Abstract

Fundo

alterações de microssatélites elevado em repetições tetranucleotídeo selecionados (EMAST ) é uma assinatura genética observada em 60% dos cancros colorectais esporádicos (CRCs). Ao contrário de microssatélites instável CRCs onde hipermetilação do reparo incompatível DNA (MMR) gene

promotor

hMLH1 é causal, a causa precisa do EMAST não está claramente definida, mas aponta para

hMSH3

deficiência.

Objectivo

para examinar se

hMSH3

deficiência provoca EMAST, e explorar mecanismos para a sua deficiência.

Métodos

Nós medidos -4 pb framshifts a

D8S321

e

D20S82

loci dentro de construções contendo EGFP para determinar a formação EMAST no MMR-proficientes,

hMLH1

– /-

,

hMSH6

– /-

, e

hMSH3

– /-

células CRC. Observamos a localização subcelular de hMSH3 com o estresse oxidativo.

Resultados

D8S321

mutações ocorreram 31 e 40 vezes maior e

D20S82

mutações ocorreram 82 e 49 vezes maior em

hMLH1

– /- Comprar e

hMSH3

– /-

células, respectivamente, do que em

hMSH6

– /-

ou células MMR-proficientes.

hMSH3

knockdown em células MMR-proficientes causou maior

D8S321

taxas de mutação (18,14 e 11,14 × 10

-4 mutações /célula /geração em dois clones independentes) do que os controles mexidos (0 e 0,26 × 10

-4 mutações /célula /geração;

p Art 0,01). sequenciamento de DNA confirmaram as mutações frameshift esperados com evidência de mutações em curso das construções. Como os tumores EMAST-positivos estão associados com a inflamação, nós submetido células MMR-proficientes ao estresse oxidativo via H

2O

2 para examinar seu efeito sobre

hMSH3

. Observou-se uma mudança nuclear-to-citosol reversível da hMSH3 sobre H

2O

2 tratamento.

Conclusão

EMAST é dependente do fundo MMR, com

hMSH3

– /-

mais propensas a mutações frameshift que

hMSH6

– /-

, oposta à deslocação do quadro de mutações observadas para repete mononucleotídicos.

hMSH3

– /-

imita completo fracasso MMR (

hMLH1

– /-

) na indução EMAST. Dada a expressão de heterogeneidade observada em hMSH3 CRCs com EMAST,

hMSH3

-deficiência parece ser o evento que inicia EMAST. O estresse oxidativo, o que provoca uma mudança de localização subcelular de hMSH3, pode contribuir para um fenótipo hMSH3 perda de função sequestrando-o para o citosol

Citation:. Tseng-Rogenski SS, Chung H, Wilk MB, Zhang S, Iwaizumi M, Carethers JM (2012) estresse oxidativo Induz a tecla Shift Nuclear-to-citosol das hMSH3, um mecanismo potencial para EMAST em células de cancro colo-rectal. PLoS ONE 7 (11): e50616. doi: 10.1371 /journal.pone.0050616

editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, República da Coreia

Recebido: 12 Agosto, 2012; Aceite: 25 de outubro de 2012; Publicado: November 30, 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Tseng-Rogenski et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Serviço de Estados Unidos de Saúde Pública (DK067287 e CA162147) eo SDSU /UCSD Comprehensive Cancer Center Parceria (CA132379 e CA132384). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

reparo incompatível DNA (MMR) disfunção conduz o processo de instabilidade de microssatélites (MSI), observada em quase todos os cânceres da síndrome de Lynch colorretal (CRCs) e em 15-20% dos CRCs esporádicas [1]. MSI é observada quando ambos os alelos de um gene importante ADN MMR é inactivado por mutação em tumores Lynch ou por hipermetilação em tumores esporádicos, fazendo com que a produção de proteína MMR ou função a falhar, e permitindo quadro de leitura para ocorrer em sequências microssatélites de DNA ao longo do genoma [1] – [3]. MSI clássico é determinado pela ocorrência de quadro de leitura de marcadores de mono /dinucleotidicos, e tem um painel definido para que a comparação entre os estudos [4]. Este painel, ou variações destes marcadores mono /dinucleótido, facilmente detecta

hMLH1 viajantes – e

hMSH2

-deficiência (como disfunção destas duas proteínas inactiva completamente DNA MMR), e, ocasionalmente,

hMSH6

-deficiência [1], [4]. O painel MSI não é o mais específico para detectar

hMSH3

-deficiência devido à natureza da reparação que esta proteína contribui para a MMR, com base em estudos de levedura [5], [6]. DNA MMR é um sistema de enzimas cuja função celular principal é reparar mispairs de nucleotídeos e de inserção /loops de deleção (IDLs) durante a replicação do DNA. A especificidade de reconhecimento de desadaptação é dirigido por hMutSα e hMutSβ; hMutSα (hMSH2-hMSH6 heterodímero) liga-se a mispairs simples e os pequenos IDLs ≤ 2 (nucleótidos), ao passo que hMutSβ (heterodímero hMSH2-hMSH3) se liga maiores IDLs [1], [5] – [7]. Nós e outros autores observaram especificidades de ligação da lesão do ADN com hMutSα purificada e hMutSβ bem como observações específicas efectuadas na ligação usando células de CRC humanas de diferentes origens ADN MMR deficientes albergando construções contendo IDLs de comprimento especificado ou mispairs nucleótidos [8] – [12] .

recentemente, uma nova forma de MSI foi descrito em até 60% do cólon esporádica [13] – [15] e mais de 30% dos cancros rectais [16]. Ao contrário MSI clássico, alterações de microssatélites elevados em repetições tetranucleotídeo selecionados (EMAST) é determinada por um painel de marcadores tetranuleotide [13] – [17]. EMAST parece ser mais comum do que a MSI clássico e parece ser uma característica adquirida associada à inflamação no CRCs [14], [16]. pacientes que têm tumores CRC EMAST-positivos apresentam um pior prognóstico do que aqueles com tumores não-EMAST ou MSI [16], [18]. EMAST tem sido observado em vários tumores, incluindo pulmão de não-pequenas células [17], da bexiga [19], do ovário [20], da próstata [21], da pele [22], e colorrectal [13] – [16], mas estes estudos não fornecem evidências integral como para a causa da EMAST. Nos relatos iniciais de EMAST em câncer colorretal, os autores observaram heterogeneidade nuclear de hMSH3 dentro dos tumores EMAST-positivos [13], [14]. Nossos dados, combinados com fermento [5], [6], e outros estudos em seres humanos [13] – [16], sugere que

hMSH3

-deficiência pode ser o condutor de EMAST em CRCs

a fim de testar se

hMSH3

-deficiência é a principal causa da EMAST, geramos tetranucleotídeo repetir contendo construções que foram fundidos out-of-frame com EGFP, de modo que quando frameshifted pelo -4 pb ( isto é, eliminação de uma unidade de tetranucleótido), EGFP poderia ser expressa. Isto permitiu a observação da geração de EMAST em tempo real, e proporcionou-nos a capacidade de calcular as frequências de mutação e taxas de mutação em vários fundos MMR-deficiente. Neste relatório, os nossos dados mostram claramente que

hMSH3

-deficiência é uma causa de EMAST em células CRC humanos e nós fornecemos mais um possível mecanismo que pode contribuir para o adquiriu

hMSH3

-deficiência em CRCs humanos.

resultados

Estabelecimento de um sistema de medição para EMAST tetranucleotídeo quadro de leitura

uma vez que alguns estudos têm indicado que EMAST está associada com expressão heterogênea de hMSH3 em tumores colorretais [13 ] – [16], a nossa abordagem foi a de gerar um sistema para medir EMAST de uma forma quantitativa como um meio para analisar directamente se

hMSH3

-deficiência é a causa de EMAST. tetranucleotídeo humana

D8S321

e

D20S82

sequências de loci (contendo 12 e /ou 16 repetições de AAAG, respectivamente) mostraram a maior frequência para um -4 frameshift pb em tumores colorretais [14], [16]. Estes dois loci foram, portanto, selecionadas para o estudo utilizando células CRC com diferentes origens genéticas MMR para averiguar mutação subsequente. Temos anteriormente estabelecido um sistema experimental semelhante onde deleção de uma pb de (A)

n conduziria à expressão do gene repórter de EGFP quando um construto foi colocada uma pb fora do quadro [10] – [12 ].

Para gerar as construções experimentais, nós inserido o loci

D8S321

(D8) e

D20S82

(D20) como 60-meros contendo as repetições tetranucleotídeo e envolvente nucleotídeos imediatamente após o codão de iniciação de EGFP [Tabela S1]. construções experimentais [D8-DOS (D8-out-of-frame) e D20-OF] foram feitas 1 pb out-of-frame de tal forma que a exclusão de uma repetição AAAG vai mudar o quadro de leitura EGFP (1 pb, para -3 bp) para o quadro correto para causar expressão EGFP. resistentes plasmídeos de mutação (MR) (MR-D8 e MR-D20), que servem como controlos negativos, foram construídas substituindo os nucleótidos AA média dentro do AAAG repete com c /nucleotídeos G em cada três AAAG, interrompendo a série de tetranucleotídeo repete evitar mutações frameshift. Os plasmídeos MR-D8 e MR-D20 foram colocados fora da moldura (DE; D8 /D20-MR-DA) e /ou na estrutura (SE; D8 /D20-MR-IF) para ser usada como negativo e positivo controles para a expressão EGFP (também ver Materiais e Métodos). Estas construções foram transfectados em linhas de células humanas de CRC com diferentes origens genéticas MMR e foram estabelecidos através de selecção higromicina B linhas celulares estáveis. clones de células individuais foram posteriormente estabelecidas. A sequenciação de ADN foi utilizada para confirmar correctamente as construções EMAST transfectadas (Tabela S1). Como esperado, as células que transportam MR-SE (controlo positivo) foram EGFP positivo, enquanto que as células contendo MR-DOS (controlo negativo) foram EGFP negativo.

Para testar se

hMSH3

-deficiência poderia causar EMAST, células não fluorescentes que transportam as construções de diferentes EMAST estavelmente transfectadas foram seleccionadas por citometria de fluxo e de forma exponencial cultivadas durante quatro a seis semanas. A cada semana, as células foram analisadas em duplicado por citometria de fluxo para a expressão EGFP, presumivelmente resultante da exclusão de uma repetição AAAG do transfectadas

D8S321

e /ou

D20S82

loci. EGFP células positivas começaram a surgir logo que uma semana após as células negativas para EGFP foram classificados e plaqueadas (dados não mostrados). Para garantir que o nosso sistema experimental permitiu-nos para avaliar corretamente a ocorrência de EMAST, as células negativas e positivas para EGFP de

hMLH1

– /- Comprar e /ou

hMSH3

– /- células contendo as construções experimentais (D8-dOS e D20-dOS) foram classificadas para isolar DNA genômico para sequenciamento. Como esperado, essencialmente todos os clones (superior a 96%) a partir de células negativas para EGFP manteve sequências de tipo selvagem (WT) para cada um dos

D8S321

e

D20S82

loci tanto em

hMLH1

– /- Comprar e

hMSH3

– /-

linhas celulares, enquanto clones de células positivas para EGFP deleção de um AAAG de repetição (Figura 1A e Figura S1A e S1B) adquiridos. Também observamos mutações frameshift de expansão em cada locus por sequenciação de ADN (incluído no “outros” na figura 1A). A mais frequente (variando de 12,5% para tão alto quanto 30% do total de células EGFP-positivo) foi a inserção de dois AAAG repete [(AAAG)

12 a (AAAG)

14] no

D8S321

que mudou o quadro de leitura a partir de 1 pb para 9 pb (listado como “outros” na Figura 1A e Figura S1A). Além disso, raramente foi observado mais de um AAAG repeat eliminação (por exemplo, 4 ou 10 AAAG repeat supressão) ( 8% do total, listados em “outros” em Figura 1A). Importante, mutações deleção /inserção sempre foram detectadas dentro das sequências microssatélites enquanto nenhuma mutação ocorreu nas sequências laterais circundantes repeat AAAG (Figura S1). Estas observações indicam que estabelecemos um sistema experimental confiável para monitorizar a ocorrência de EMAST em células de CRC.

(A) de ADN genómico isolado a partir de células-negativas para EGFP e -positivos que transportam construções experimentais (D8-DA e /ou D20-dO) foi utilizada para amplificar fragmentos de DNA contendo EMAST loci para examinar se tinha ocorrido as mutações frameshift. (B) As frequências de mutação foram calculados dividindo-se a percentagem de população de EGFP positiva no grupo experimental (DA) pela percentagem de EGFP positiva no seu controlo negativo (MR-DA) para calcular o aumento da população de EGFP-positivo em dobras. Houve significativamente mais células EGFP-positivos em

hMLH1 viajantes – e

hMSH3

-deficient células em comparação com MMR-proficientes e /ou

hMSH6

-deficient células. *:. P 0,05

Frameshift Mutações no tetranucleotídeo repetições de

D8S321

e

D20S82

Loci são dependentes do fundo MMR

Para examinar o efeito do MMR de fundo sobre mutações frameshift no tetranucleotídeo

D8S321

e

D20S82

loci, calculamos frequências de mutação dos marcadores, comparando cada grupo experimental (oF) para seu controle negativo (MR -De), utilizando a seguinte fórmula: “(células positivas para EGFP /células vivas totais de OF) /(EGFP células positivas /células vivas totais de MR-dE)”.

hMLH1

– /-

células (completamente desprovido de atividade DNA MMR) e

hMSH3

– /- células mostraram 7-12 frequências de mutação vezes mais elevadas em comparação com os controles para ambos os loci (Figura 1B). Em particular, as frequências de mutação observada em

hMSH3

– /- foram comparáveis ​​aos que, em

hMLH1

– /- tanto para loci (Figura 1B). As taxas de mutação -4 pb para ambos os loci em cada fundo MMR foram também calculados (Tabela 1). Com MMR-deficiência completa (

hMLH1

– /-

), taxas de mutação para ambos os loci eram 27 e 56 × 10

-4 mutação /célula /geração. Da mesma forma,

hMSH3

– /-

células geradas 33 e 34 × 10

-4 mutações /célula /geração. Assim, as taxas de mutação com

hMSH3

-deficiência são muito comparáveis ​​aos observados para MMR-deficiência completa. Isto está em nítido contraste com

hMSH6

-deficiência ( 1 × 10

-4 mutação /célula /geração), essencialmente idênticas às células MMR-proficientes. Estes resultados sugerem fortemente a

hMSH3

-deficiência é o driver para a formação EMAST.

Knockdown direta de hMSH3 expressão em células MMR-proficientes Causas EMAST

Para confirmar um papel de hMSH3 em EMAST, nós derrubado

expressão hMSH3

em células MMR-proficientes abrigar o

D8S321

-EGFP construir por transfecção de plasmídeos transportando

hMSH3

espec�ico shRNA e /ou controle mexidos, então medido

D8S321

tetranucleotídeo mutações frameshift como acima. Antes da transfecção shRNA, os níveis de expressão em clones hMSH3 MMR-proficientes escolhidos eram comparáveis ​​entre si (Figura S2). Após a criação de linhas celulares estáveis ​​shRNA (clones de uma única célula), hMSH3 expressão foi significativamente reduzida em células transfectadas in

hMSH3

shRNA (Figura 2; variando entre 26-34% dos níveis de proteína dos controlos de mistura).

hMSH3

shRNA transfecção reduziu com sucesso e, especificamente, os níveis de expressão hMSH3 nos clones celulares de CRC. Note-se que os níveis de outros genes de reparo de DNA de expressão permanecem inalterados.

Usando os shRNA células estavelmente transfectadas contendo o

D8S321

lugar, examinamos as linhas de células para a ocorrência de EMAST por citometria de fluxo. Uma população EGFP-positivo apareceu em células onde

hMSH3

expressão foi derrubado.

hMSH3

KD mostrou células de 5 vezes (clone 1) e de 6 vezes (clone 2) aumentar em frequências de mutação (Figura 3A), em comparação com células de controlo shRNA mexidos. Redução na expressão hMSH3 aumentou consideravelmente as taxas de mutação do D8S321

construir para 12,7 e 18,4 × 10

-4 mutação /célula /geração, em comparação com 1 × 10

-4 mutação /célula /geração Precipitação em controlos (Tabela 2). EGFP-negativas e células -positivas foram separados por sequenciamento de DNA para examinar mutações frameshift. Em ambos os clones, maior do que 90% das células negativas para EGFP retido sequência WT [(AAAG)

12], enquanto que aproximadamente 90% das células EGFP-positiva revelou uma deleção de uma repetição de AAAG (Figura 3B). Expansão das repetições microssatélites foi também detectada (incluído como “outros” na Figura 3B). No geral, as nossas observações indicam que KD direta de

hMSH3

causando

hMSH3

-deficiência por si só é capaz de gerar EMAST em células CRC MMR-proficientes anteriores.

( a) as células SW480 (MMR proficiente) que transportam a construção EMAST (D8-OF ou D8-MR-dE) foram transfectadas com

hMSH3

shRNA construção (

hMSH3

KD) ou controlo corrida (corrida ) separadamente. Dois independentes

hMSH3 Comprar e clones disputa KD, bem como as células parentais foram incluídos neste estudo. EMAST frequências de mutação foram apurados conforme descrito na Figura 1B para parental, precipitação e /ou

hMSH3

KD células. Houve significativamente mais células EGFP-positivos em

hMSH3

KD células em comparação com pais e /ou células de controlo mexidos. *: P 0,001; **: P 0,05. (B) células -positivas de

hMSH3

KD células portadoras D8-DE EGFP-negativo e foram ordenados para o isolamento de ADN genómico para analisar mutações frameshift por sequenciamento.

Estresse Oxidativo Causas subcelular deslocamento compartimental de hMSH3 a partir do núcleo para o citosol

EMAST foi observado para ser estreitamente associada com a perda de expressão heterogénea hMSH3 bem como a expressão heterogénea nuclear (Haugen

et al., 2008; Lee

et al

., 210, Devaraj

et al

., 2010). Nossos estudos fornecem acima mais evidências de que a redução de expressão hMSH3 sozinha pode induzir EMAST em células CRC humanos. Começamos a explorar como hMSH3 pode tornar-se deficiente em tumores EMAST-positivos com a redução observada de integral para expressão heterogênea. Em CRC, EMAST está associada com células inflamatórias [13], [14], [16], que pode facilitar o stress oxidativo, o que foi mostrado para prejudicar a função MMR [23]. Usando H

2O

2 como um substituto, nós investigamos o efeito (s) do estresse oxidativo na expressão hMSH3. células MMR-proficientes foram tratadas com concentrações crescentes de H

2O

2 (50 uM -500 uM) durante até 24 horas. Nós não detectou quaisquer reduções nos níveis de proteínas totais hMSH3 em quaisquer condições que tentámos (dados não mostrados). No entanto, após o tratamento de células com 50 pM de H

2O

2 durante 4 horas, foi encontrado hMSH3 homogeneamente em ambos o núcleo e o citosol de uma percentagem significativa de células (40-60%; segunda coluna painel na figura 4A). Surpreendentemente, foi observado hMSH3 a desocupar completamente núcleos em algumas células [10-20% do total de células (terceira coluna painel na Figura 4A], em nítido contraste com as células não tratadas que permaneceram hMSH3 predominantemente localizadas no núcleo (painéis da esquerda na Figura 4A ). a mudança de hMSH3 localização poderia ser detectado o mais depressa como 2 horas depois do tratamento, e o efeito atingiu um pico entre 4 e 8 horas após o H

2 tratamento

2O iniciado (dados não apresentados). ao contrário hMSH3, hMLH1, hMSH2 e hMSH6 não alterou a sua localização celular e manteve-se em núcleos (Figura 4B e Figura S3A, S3B e S3C). fracionamento celular para separar frações nucleares e citosólicos combinado nossas observações imunocitoquímica (Lanes 1-3 e 5-7 na Figura 4B).

(a) As células SW480 MMR-proficientes foram durante 24 horas e depois tratou-se com 50 pM de H

2O privadas de soro

2 durante 4 horas. Após fixação, as células foram coradas com hMSH3 anti-anticorpo e, em seguida, anticorpo anti-ratinho conjugado com Alexa 488 para observar a localização subcelular de hMSH3. Para testar se o efeito foi reversível, as células foram cultivadas durante mais 24 horas após a remoção do H

2O

2. (B) células SW480 foram por 24 horas e, em seguida, tratada com H privadas de soro

2O

2 para 4 horas (-FBS + H

2O

2). células parentais (parental) e células que foram mortos de fome soro sem o H posterior

2O

2 tratamento (-FBS) foram utilizados como controle. As proteínas celulares foram separadas em fracções nucleares e citosólicos utilizando um kit de fraccionamento nuclear. Volume igual de proteínas de cada grupo foi utilizada para SDS-PAGE e subsequente técnica Western Blot para verificar os níveis de hMSH3. H3 anti-histona foi usado para a fracção nuclear igualdade carregamento e tubulina foi utilizado para citosólica igualdade fração de carregamento.

Para examinar se o efeito do H

2O

2 na hMSH3 foi reversível , substituímos H

2 mídias contendo

2O por meio fresco após 4 horas de tratamento. hMSH3 foi encontrado para ser nuclear por 24 horas após a remoção do H

2O

2 (painéis da direita na Figura 4A e pistas 4 e 8 na Figura 4B). Este resultado pode indicar que o efeito de H

2O

2 em hMSH3 foi reversível, onde hMSH3 é deixada para voltar a entrar para dentro do núcleo uma vez que o stress oxidativo diminuído. Alternativamente, o hMSH3 que estava no citosol pode ter sido danificado e degradada e, portanto, era incapaz de re-entrar em núcleos, e pode indicar que o hMSH3 nuclear observado foi recém-sintetizado. Para determinar qual cenário poderia ser correto, nós tratamos as células com 20 ug /ml de ciclohexamida após a remoção do H

2O

2 para parar a síntese de proteínas por 24 horas. hMSH3 verificou-se ser no núcleo (dados não mostrados), demonstrando que a hMSH3 que foi deslocado para o citosol foi de facto capaz de re-entrar no núcleo.

Discussão

ADN MMR estudos de bactérias e leveduras indicam que hMutSβ, um heterodímero de hMSH2 hMSH3 e, se liga e dirige reparação de inserção-deleção laços ± 2 nucleótidos [1], [5], [6]. Assim,

hMSH3

-deficiência seria esperado para permitir grandes inserção-deleção mutações frameshift circuito, que tem sido fortemente sugerido em estudos anteriores [13] – [16]. Determinar a consequência da

hMSH3

-deficiência não era anteriormente de primordial importância, como nunca foi descrito uma mutação germinativa para

hMSH3

para causar síndrome de Lynch, e não houve correlação com CRC esporádica até que a descrição de EMAST em CRCs [13] – [16]. A ligação de EMAST com a perda de heterogeneidade de expressão hMSH3 em CRCs esporádicos sugerem que esta proteína DNA MMR poderia dirigir EMAST. Em nosso estudo, nós nos propusemos a testar isso criando um modelo de célula humana para medir a formação EMAST de uma forma quantitativa. Nosso estudo mostra que (a) formação de EMAST é dependente do fundo MMR, com

hMSH3

-deficiência correspondência MMR-deficiência completa em causar EMAST, (b)

hMSH3

-deficiência taxas de mutação para formação EMAST são marcadamente maior em comparação com a de

hMSH6

-deficiência (essencialmente nula para a formação EMAST), (c) knockdown de

hMSH3

sozinho inicia a formação de EMAST, e (d) o estresse oxidativo pode ser um dos factores causadores deficiência de hMSH3, como esta proteína MMR muda a sua localização subcelular com H

2O

2. Ao todo, o nosso estudo oferece um forte apoio ao conceito de que

hMSH3

-deficiência impulsiona a formação EMAST e fornece um possível mecanismo que pode contribuir para hMSH3-deficiência em CRCs humanos.

quadro de leitura tetranucleotídeo que definem EMAST CRC em tumores pode ser por inserção ou deleção de repetições tetranucleotidica. Em nossos experimentos, nós projetamos construções para detectar a -4 eliminação pb; no entanto mediante sequenciação de ADN algumas inserções (expansão) dos microssatélites foram também detectados. Com efeito, a maioria das mutações frameshift detectadas nas nossas experiências foram devido à eliminação de uma unidade AAAG (Figura 1A e 3B). Foi selecionado o

D8S321

e

D20S82

loci para os nossos experimentos, porque a exclusão de uma unidade AAAG tinha sido mostrado para ser a mutação mais prevalente encontrado entre loci utilizados para detectar EMAST [14], [16 ]. Porque o nosso sistema foi concebido para detectar somente um tipo de mutação, as nossas taxas calculadas provavelmente uma subestimação da mutabilidade destes loci com

hMSH3

-deficiência. Pessoa contexto sequência e as sequências flanqueadoras podem também contribuir para a diferente resultado da mutação (por exemplo, inserção versus supressão) [11], [12], [24]. No

D20S82

lugar, apenas cerca de um terço do EGFP positivos

hMSH3

– /-

células demonstraram uma deleção unidade AAAG e isso pode ser devido a este clone particular que contém múltiplos cópias da construção. Isto é contrastado por mais de 70% das células positivas para EGFP que transportam a mesma construção em

hMLH1

– /-

mostrando eliminação de uma unidade AAAG, indicando a construção comportou-se como desenhado. Para

hMSH3

– /-

células, mutação em uma das cópias levaria a expressão EGFP, enquanto o restante permaneceu WT, confundindo análise de sequenciação. Isto, no entanto, não afecta a frequência de mutação e taxa de mutação, como o cálculo baseou-se no número de células EGFP-positiva.

Não é completamente claro para os tumores EMAST-positivos como

hMSH3

é regulada negativamente para iniciar EMAST. Existem provas claras de que os tumores EMAST-positivos estão fortemente associados com as células inflamatórias, particularmente dentro dos componentes epiteliais do tumor e no estroma circundante do tumor (os chamados “ninhos tumorais”) [16]. Assim, uma hipótese é que a inflamação provoca uma redução de hMSH3 adquirida, o que conduz posteriormente EMAST. Curiosamente, H

2O

2 tratamento (que simula o stress oxidativo) leva a uma mudança de hMSH3 para o citosol para longe do seu local funcional no núcleo, sem diminuir os seus níveis de expressão geral. Com a curto prazo H

2O

2 tratamento, não foi possível demonstrar níveis detectáveis ​​de formação EMAST no nosso modelo (dados não apresentados). A presença e mais consistente do stress oxidativo pode ser necessária para iniciar EMAST, considerando EMAST parece estar associada com a inflamação crónica e com a histologia de tumores avançados [14]. Em alternativa, outros componentes de inflamação e /ou o ambiente do tumor pode funcionar em sinergia com o stress oxidativo para causar EMAST. EMAST parece ser um factor de mau prognóstico para pacientes com CRC [16], [18]. Isto está em contraste com a clássica MSI para as quais os pacientes com CCR apresentam melhor sobrevivência, ao mesmo encenado tumor de pacientes com tumores MSS [1]. Ele continua a ser determinado se esta é intrínseco ao tipo de MMR defeito (

hMLH1

vs.

hMSH3

) ou alguns outros fatores, como o grau ou tipo de inflamação no tumor.

Em resumo, mostramos através da criação de um modelo de celular romance que

hMSH3

-deficiência impulsiona EMAST. Nossos dados complementa fortemente a observação da perda de heterogeneidade de expressão hMSH3 em tumores EMAST-positivas, e sugere que adquiriu

hMSH3

-deficiência, impulsionado pelo estresse oxidativo, pode ser o mais comum defeito de DNA MMR entre os CRCs humanos.

Materiais e Métodos

linhas celulares e Reagentes

As linhas de células cancerígenas do cólon humano, HCT116 (

hMLH1

– /- hMSH3

– /-

), DLD-1 (

hMSH6

– /-

), HCT116 + ch3 (

hMLH1-

restaurada, mas

hMSH3

– /-

), e SW480 (MMR-proficientes), as células foram cultivadas como anteriormente descrito [10]. HCT116, DLD-1 e SW480 foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, Virginia). células HCT116 + ch3 foram gentilmente cedidas pelo Dr. Minoru Koi, Baylor University Medical Center, Dallas, TX [10]. Os anticorpos anti-hMLH1, hMSH2, hMSH3, e hMSH6 foram adquiridos a BD Pharmigen (San Diego, CA). O anticorpo anti-tubulina foi de Sigma (St. Louis, MO). anticorpo anti-ratinho conjugado com HRP foi adquirido a Cell Signaling (Danvers, MA). Alexa 488 anticorpo conjugado anti-rato foi a partir de Invitrogen (Grand Island, NY).

Clonagem de pIREShyg2-

D8S321

-EGFP e pIREShyg2-

D20S82

-EGFP Plasmids

o loci humano dois,

D8S321

e

D20S82,

foram relatados para ter a mais alta frequência de mutação em tumores do cólon EMAST [13] – [16], e foram selecionados para a construção de plasmídeos.

D8S321

e

D20S82

sequências contêm 12 e /ou 16 repetições de AAAG, respectivamente. oligos sentido e anti-sentido contendo

D8S321

ou

D20S82

, em torno de sequências, assim como

Pme

I e

Asc

Eu locais de clonagem (Tabela S1) foram sintetizados (Tecnologias de ADN integrado, Inc., San Diego, CA) e sujeitos a reacções de quinase T4-polinucleótido para fosforilar as extremidades 5 ‘(Invitrogen). Os oligos de sentido e anti-sentido foram autorizados a recozimento e clonados em plasmídeos pIREShyg2-EGFP através

Pme

I-

Asc I

locais imediatamente após o codão de iniciação do gene de EGFP, como descrito anteriormente [ ,,,0],10] – [12], [24]. plasmídeos experimentais foram construídos um bp fora do quadro, de modo que uma exclusão de uma repetição tetranucleotídeo dentro

D8S321

ou

D20S82

(-4 mutação frameshift pb) mudaria o quadro de leitura para a correta quadro para permitir a expressão EGFP. plasmídeos resistentes mutação [-MR-de-frame (OF)] foram construídos usando bom senso e oligos anti-sentido em que dois nucleotídeos dentro de cada terceira repetição da AAAG foram alterados para evitar mutações frameshift. O (MR-D8-SE) de plasmídeo, um controlo positivo para a expressão de EGFP, resistente mutação no quadro foi construído por eliminação de 1 bp

D8S321

sequência no plasmídeos utilizando Quikchange II MR-D8-DOS Site-Directed kit de mutagénese (Stratagene, La Jolla, CA).

hMSH3

shRNA Construção

hMSH3

shRNA construir e seu emparelhado vector vazio foram gentilmente cedidas pela Dr. Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Dallas, TX. A sequência GFP desta construção foi removido por digestão com a construção de

Apa I e

Pac

I, preenchendo-no utilizando o fragmento de Klenow para formar extremidades embotadas, e, em seguida, realizando ligação das extremidades cegas. Para efectuar um controlo scrambled, a sequência de GFP a partir do vector vazio foi removido em primeiro lugar, tal como descrito acima e a sequência mexidos, removidos a partir de um constructo disponível comercialmente (GeneCopoeia, Rockville, MD), foi inserido no vector através de

EcoR

I e

Xho

Eu sites. A existência e a precisão da corrida e /ou

hMSH3

shRNA sequências em plasmídeos foram confirmadas por sequenciação de ADN.

A transfecção e Geração de linhas celulares estáveis ​​

As células foram transfectadas com o diferente pIREShyg2-

D8S321

-EGFP e pIREShyg2-

D20S82

-EGFP plasmídeos (descritos na Tabela S1) usando kits Nucleofector (Amaxa, Colónia, Alemanha). As linhas celulares estáveis ​​foram estabelecidas por higromicina B selecção (Invitrogen). Cada linha de células foi sujeita a uma única célula de triagem FACS usando ARIA (Becton Dickinson, San Jose, CA) para estabelecer clones individuais. Todos os clones de células individuais foram examinadas por sequenciamento de DNA para garantir a existência e precisão da construção EMAST que carregavam.

Para

hMSH3

knockdown células (KD), células MMR-proficientes (SW480) transportando D8-DA e /ou D8-MR-de construções foram transfectadas com plasmídeos contendo precipitação ou

hMSH3

espec�ico shRNA utilizando Fugene 6 (Roche, Mannheim, Alemanha), seguido por puromicina (Invitrogen) para estabelecer estável selecção linhas. Dois clones independentes a partir de cada grupo foram utilizadas para os estudos.

Análise por citometria de fluxo Mutação

Quatro mil células estáveis ​​transfectadas não fluorescentes foram classificadas para cada poço em placas de 6 poços por