Abstract

Fundo

antígeno específico

próstata (PSA) é tradicionalmente usado como um indicador para detectar a presença de cancro da próstata (CaP) e a radioterapia é geralmente utilizado para tratar inoperável e localmente avançado CaP. No entanto, como o nível de PSA celular está associada com a sensibilidade do CaP à radioterapia é desconhecida. A constatação anterior de que o NF-kB via alternativa baseada em RelB regula diferencialmente PSA e interleucina-8 (IL-8) em CaP agressiva tem dirigido a nossa atenção para o papel de RelB na resposta do CaP à radioterapia.

Metodologia /PRINCIPAIS CONCLUSÕES

RelB e sua alvos PSA e IL-8 em células CaP foram manipulados pela expressão ectópica em células APC com um baixo nível endógena de RelB (LNCaP) e baseada em RNAi knock-down no células APC com um alto nível constitutivo da RelB (PC3). Os efeitos de RelB, PSA e IL-8 sobre a resposta de APC, para o tratamento de radiação foram examinados in

in vitro

e em tumores de xenoenxerto. RelB regula PSA e IL-8 de uma maneira inversa. Quando os níveis celulares de PSA e IL-8 foram directamente modulados por manipulações genéticas ou pela adição de proteínas recombinantes, os resultados demonstram que a sobre-regulação de IL-8 radiorresistência aumentada de células APC e PSA simultaneamente regulada para baixo. Em contraste, a regulação positiva de PSA resultou em radiorresistência reduzida com concomitante diminuição da regulação de IL-8.

Conclusão /Significado

RelB desempenha um papel crítico na resposta do CaP à radioterapia e a expressão inversa de IL-8 e PSA. Os resultados identificam uma relação até então desconhecida entre a IL-8 e PSA na resposta das células CaP à radioterapia

Citation:. Xu Y, Fang F, St. Clair DK, St. Clair WH (2012) Inverse Relacionamento entre PSA e IL-8 em Câncer de próstata: uma visão de um Mecanismo de NF-kB-Mediated. PLoS ONE 7 (3): e32905. doi: 10.1371 /journal.pone.0032905

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de junho de 2011; Aceito: 07 de fevereiro de 2012; Publicação: 05 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede CA 49797 para DKS e CA 11580 para WHS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é a segunda neoplasia mais comum na América do Norte e a segunda principal causa de mortes por câncer em homens americanos [1]. A concentração de soro de PSA em homens é utilizado como um indicador de doença da próstata e aumentou o nível de PSA é utilizado extensivamente como um biomarcador de CaP. Radioterapia é geralmente usado para tratar início de carreira, inoperável e localmente avançado CaP. No entanto, se a PSA celular podia ser utilizado como indicadores da capacidade de resposta do tumor a radioterapia é desconhecido.

NF-kB, um factor de transcrição que responde inflamatória, desempenha um importante papel na tumorigénese e resistência à citotoxicidade induzida pela terapia [2] . O elevado nível constitutivo de NF-kB em cancros tem sido implicado como um importante mecanismo de protecção contra o tratamento do cancro [3]. Assim, a inibição do NF-kB está a ser considerado como um alvo para melhorar a eficácia da quimioterapia e da radioterapia convencional [4]. Foi anteriormente demonstrado que a sobre-expressão de RelB, um membro do NF-kB, a expressão do PSA suprimida em células LNCaP de CaP responsivos aos andrógenos, o que sugere um efeito negativo de NF-kB na expressão do PSA [5]. Por acaso, verificámos também que, em animais portadores de tumores de LNCaP RelB-sobre-expressos, o nível de circulação de IL-8 foi aumentada.

IL-8, uma citóquina NF-kB activado, pensa-se ser uma importante factor de metástases de tumores e resistência ao tratamento [6] – [9]. O nível circulante de IL-8 é aumentada em CaP avançado na fase quando o tumor já não responde às terapias anti-andrógeno [10]. Além disso, a expressão de IL-8 aumenta a CaP independente de androgénios metástase [11], [12]. Assim, a expressão de IL-8 podem ter um valor prognóstico importante para o crescimento e a resposta à terapia de CaP. O presente estudo investigou os papéis de PSA e IL-8 no radiorresistência de células CaP usando

in vitro Comprar e

In vivo

abordagens. Os resultados revelam o papel previamente não reconhecido de IL-8 e PSA como determinantes da sensibilidade do CaP à radioterapia.

Resultados

NF-kB regula-se-IL-8, mas para baixo-regula PSA CaP em células

a activação da via NF-kB é considerado um factor importante que contribui para o desenvolvimento da radiorresistência de células cancerosas. Porque RelA e RelB são os dois membros principais da família NF-kB encontrado em células CaP [13], foram determinados os efeitos de RelA e RelB na produção de IL-8 e a expressão do PSA e radiossensibilidade usando vários abordagens para a activação e inactivação do NF via -κB. Em primeiro lugar, ou RelA RelB foi sobre-expresso em células LNCaP por transfecção com as respectivas construções de ADNc. Como mostrado na Fig. 1A, os níveis de PSA diminuíram ambos RelA e RelB quando foram sobre-expressos em células LNCaP. Em contraste, os níveis de IL-8 foram aumentadas em ambos RelA e RelB. O efeito correspondente de RelA e RelB em radiorresistência de células LNCaP foi maior com a sobre-expressão de RelB.

Para manipular função de NF-kB, ADNc RelA e RelB constrói (A), e RelB RelA siRNAs (B), e inibidores RELA e RelB translocação nuclear (IκBαM e p100M) (C) foram transfectados em células LNCaP de IV antes do tratamento. Os níveis de proteínas transfectadas e o PSA alvo relacionada foram quantificados por manchas de Western (painel superior). As imagens de Western foram normalizados por β-actina e em seguida normalizada por um controlo do veículo. Dobram mudanças são indicados. IL-8 em meios concentrações foram quantificadas por um kit de ELISA (painel do meio). sobrevivências de células foram quantificados utilizando Trypan ensaio de exclusão de azul (painel inferior). * (P 0,05) e ** (P 0,01) indicam significância estatística, em comparação com o controlo de veículo

Em segundo lugar, o RelA endógena e RelB em células LNCaP foram batidos para baixo usando a ARN. interferência abordagem (RNAi). RelA siRNA ou RelB siRNA foi transfectado em células LNCaP para silenciar sua expressão. Como mostrado na Fig. 1B, os níveis de PSA correlacionam-se inversamente com os níveis reduzidos de ambos RelA e RelB, com um maior efeito observado para RelB. Os níveis de IL-8 foram similarmente diminuiu em RelA e RelB bateu-se nas células, com um efeito maior para RelA siARN. Radiossensibilidade de células LNCaP foi aumentada pela redução quer RelA ou RelB (Fig. 1B). A sobrevivência das células em siRNA de controlo foi reduzida para 46,3%, em tratamento de radiação, enquanto que a sobrevivência das células foi reduzido para 30,1% ou 23,4% quando RelA ou RelB foi knocked-down. Análise estatística mostrou que as diferenças significativas de RelA siRNA e RelB siARN em comparação com ARNsi de controlo. Assim, knock-down de RelB quase dobrou a célula matando efeito da radiação. No entanto, a morte de RelB siRNA mais radiação foi ligeiramente menor do que os efeitos combinados de siRNA sozinho e radiação sozinho. Assim, é possível que a segunda batida para células que já estavam mortos podem ser responsáveis ​​por esta observação. Em terceiro lugar, RELA e RelB foram inibidos por bloquear a sua translocação nuclear para confirmar ainda mais os seus papéis na regulação do PSA e IL-8 expressões. construção do mutante para IκBα (IκBαM) [14] ou p100 (p100M) [15] foi transfectado em células LNCaP de bloquear RelA: dímero p50 ou RelB: translocação nuclear p52 dímero, respectivamente. Como mostrado na Fig. 1C, as respostas de PSA e de IL-8 expressões eram semelhantes aos resultados obtidos a partir do método de RNAi (Fig. 1B). Assim, o bloqueio de qualquer RelA ou translocação nuclear RelB eficiência melhorada da radiossensibilidade de células LNCaP.

PSA se correlaciona inversamente com a IL-8 em células CaP

foram mostrados PSA e IL-8 a ser biomarcadores importantes em várias fases de progressão APC. Mostrámos que a sobre-regulação de IL-8, mas a regulação negativa do PSA está associada com o aumento da tumorigenicidade de células CaP [5]. Duas linhas celulares de CaP foram utilizados para validar a correlação de PSA para a IL-8: LNCaP, uma linha de células que respondem a androgénios CaP, expressa PSA e um baixo nível de IL-8; PC3, uma linha celular de CaP independente de androgénios, expressa um nível elevado de IL-8, mas não é detectável a PSA. Após a transfecção de uma expressão de cDNA de IL-8 em células LNCaP construir, os níveis relativos de PSA foram quantificados. Como IL-8, a expressão aumentou, os níveis de PSA celular dependente da dose diminuiu. Além disso, para baixo knocking- PSA PSA por siRNA resultou em aumentos dependentes da dose na celulares níveis de IL-8 (Fig. 2a). Além disso, expressando PSA em células PC3 levou a uma redução na produção de IL-8. No entanto, não houve manifestações de PSA em células PC3, mesmo quando IL-8 foi knocked- para baixo por siARN (Fig. 2B). Tem sido demonstrado que a activação de NF-kB pode mediar a via prosurvival de IL-8: CXCR2 sinalização [16]. Para investigar se NF-kB pode ser um mediador para a relação inversa entre a IL-8 e PSA, uma construção repórter de NF-kB-luciferase foi co-transfectado para células de LNCaP com a construção de expressão de PSA ou PSA siARN. Como mostrado na Fig. 2C, a expressão excessiva da PSA suprimida mas a deficiência de PSA enhanced de NF-kB mediada por activação da transcrição.

Para manipular PSA e IL-8 em células APC, as células LNCaP foram transfectadas com uma construção de ADNc de IL-8 e um siRNA PSA (A); células PC3 foram transfectadas com ADNc de PSA construir e IL-8 siRNA (B). Para testar se a PSA influencia a activação transcricional de NF-kB, uma construção repórter de NF-kB-luciferase foi co-transfectada com uma construção de expressão de PSA ou PSA siRNA e uma expressão β-gal construir em células LNCaP. As respostas da luciferase foram normalizados com actividades β-gal (C). Os níveis de PSA e IL-8 foram quantificados por Western blot com a normalização, como descrito na Figura 1.

PSA e IL-8 desempenham papéis opostos na radiossensibilidade de células CaP

Sendo NF -κB produtos de genes regulados, de PSA e de IL-8 pode desempenhar um papel importante nas respostas de APC a radioterapia. Por conseguinte, manipulou os níveis de PSA e de IL-8 para determinar directamente os seus papéis na radiossensibilidade das células APC. O aumento de IL-8 em células LNCaP por qualquer tratamento das células com IL-8 de proteína (Fig. 3A, painel superior) ou a transfecção de forma estável de ADNc de IL-8 em células (Fig. 3A, baixo do painel) resultou numa diminuição dos níveis de PSA e a sensibilidade à radiação. Além disso, com base em lentivírus shRNA estável knock-down de PSA em células LNCaP resultou no aumento dos níveis de IL-8 e reduzindo a radiossensibilidade das células (Fig. 3B). Para verificar melhor os papéis de PSA e de IL-8 da radiossensibilidade de células APC, PSA e IL-8 em células PC3 foram modulados por transfecção de ADNc de PSA e IL-8 de siRNA, respectivamente. expressão de PSA Lentivírus base e knock-down de IL-8 em células PC3 conduziram a níveis elevados de PSA, a redução dos níveis de IL-8 e aumentou radiossensibilidade de células PC3 (Fig. 3C). Juntos, estes resultados indicam a relação inversa entre a IL-8 e PSA em células APC e sugerem que a PSA e a IL-8 tem efeitos opostos sobre a radiossensibilidade das células APC.

Para determinar os papéis de IL-PSA e 8 da radiossensibilidade de células APC, as células LNCaP foram tratados com IL-8, proteína ou estavelmente transfectadas com cADN IL-8 (a) e de forma estável com PSA transducted shRNA lentivírus (B); células PC3 foram estavelmente transducted com PSA ADNc e IL-8 shRNA lentivírus (C). Os níveis de PSA foram quantificados por Western blot e os níveis de IL-8 foram quantificados por qualquer das manchas de Western ou um kit de ELISA. A sobrevivência das células foi quantificada por exclusão de azul de tripano ensaios. Western blot foram normalizados com os controles e análise da fração de sobrevivência celular, como descrito na Figura 1.

Up-regulação da RelB reduz radiossensibilidade do tumor LNCaP

in vivo

os dados acima obtido

in vitro

implicam RelB e visa, IL-8 e PSA, como tendo um papel importante na radiossensibilidade do CaP. Para verificar o papel da RelB na radiossensibilidade da APC e a relação inversa entre IL-8 e expressões de PSA

in vivo

, um clone LNCaP RelB expressando estável foi gerado (Fig. 4A) e subcutânea injetado no flancos de ratos machos nus; crescimento do tumor foi monitorizado durante 50 dias, medindo o tamanho do tumor. Tumor mudança taxa de crescimento foi quantificado pelo tempo (dias) necessários para o tamanho do tumor para chegar a um volume de 500 mm

3. FIG. 4B mostra que o tempo médio para o grupo de controle para chegar a 500 mm

3 foi de 54 ± 6,7 dias. Tumor aumento da taxa de crescimento do clone RelB-expresso levou 43 ± 5,6 dias para chegar a 500 mm

3. Os animais com um tamanho médio do tumor de 500 mm

3 foram divididos aleatoriamente em dois grupos para 1) tratamento com radiação fraccionado (3 Gy de radiação por dia durante 5 dias) e 2) controlos simulados. Os ratinhos foram sacrificados humanamente quando os tumores atingiram o tamanho máximo de 2000 mm

3. Como mostrado na Fig. 4C, nos ratos unradiated, tumores de controle de vetores cresceu de 500 mm

3-2000 mm

3 em 25 ± 3,7 dias, enquanto que o tumor expressando RelB atingiu o mesmo tamanho em 14 ± 2,3 dias. A radiação ionizante (IR) prevenida eficazmente o crescimento de tumores de controlo no prazo de 50 dias da experiência. No entanto, IR só parou o crescimento de tumores que expressam RelB durante 20 dias pós-radiação, após o que foi observado novo crescimento do tumor. O experimento foi finalizado porque alguns ratos nos grupos irradiados desenvolvido más condições de saúde implicados por sinais clínicos de doença sistêmica, como desidratação, respiração difícil ou superficial, e perder 20% do seu peso máximo. Após os tumores foram removidos, a expressão de RelB e níveis de PSA e de IL-8 nos tecidos tumorais foram quantificados utilizando um anticorpo apropriado, para cada proteína. Consistente com os níveis elevados de RelB identificadas nos tumores RelB-expressos, IL-8 foi aumentada de PSA, mas foi reduzida nos mesmos tecidos do tumor (Fig. 4D).

Um RelB estável expressa o clone foi caracterizado por LNCaP As transferências de western (A). As células /RelB LNCaP foram injectadas em ratinhos machos para a formação de tumores e o crescimento para atingir 500 mm

3 (b). Os tumores foram tratados de IV (5 × 3 Gy) e os volumes dos tumores foram medidos até chegarem a 2.000 milímetros

3 (C). RelB, os níveis de PSA e de IL-8 foram quantificados nos lisados ​​tumorais e analisados ​​estatisticamente (D). significâncias estatísticas de volumes de tumor (C) e os níveis das proteínas-alvo (D) entre RelB expressa e controle do veículo em ambos os grupos noções IR e IR tratados são indicados.

Down-regulação da RelB aumenta a radiossensibilidade de tumores PC3

Para validar ainda mais o papel de protecção contra a radiação de RelB, um clone RelB siARN PC3 à base de lentivírus foi seleccionado (Fig. 5A) e injectado nos flancos de ratinhos nus do sexo masculino. No grupo siRNA controle, o tempo médio de um tumor para chegar a 500 mm

3 foi de 11 ± 2,1 dias, enquanto o tempo médio no grupo knock-down RelB estendido para 26 ± 5,1 dias (Fig. 5B). Os tumores foram tratados com IR de 3 × 5 Gy depois do tumor atingiu um tamanho médio de 500 mm

3. Em camundongos de controle unradiated, o tamanho do tumor no grupo siRNA controle rapidamente cresceu de 500 mm

3 a 2000 mm

3 dentro de 15 ± 3,1 dias. Em comparação com o grupo de ARNsi de controlo, o crescimento do tumor no grupo de knock-down RelB foi significativamente mais lento do que no grupo de controlo de siRNA. IV inibiu o crescimento do tumor de controlo com a tendência para novo crescimento depois de 20 dias pós IR. Curiosamente, não só IR controlada recrescimento do tumor, mas é também reduzido o tamanho do tumor no grupo RelB siRNA (Fig. 5C). As diferenças observadas

in vivo

não são simples reflexos de diferenças de crescimento

in vitro

porque não existem reduções significativas no crescimento celular quando RelB foi estavelmente knocked-down em células PC-3. Assim, o efeito de radiossensibilização por knock-down de RelB é devido à inibição da activação do NF-kB induzivel radiação. Os efeitos do mediada por siRNA knock-down de RelB foram confirmadas por análises de Western blot de RelB e IL-8 nos tecidos do tumor (Fig. 5D). Estes resultados suportam o papel de RelB na resposta do CaP à radioterapia.

A RelB siRNA clone PC3 knock-down baseada em lentivírus foi caracterizado por Western blot (A). As células /PC3 RelB shRNA foram injectadas em ratinhos machos para a formação de tumores (B). Os tumores foram tratados com IR (3 × 5 Gy), quando o volume do tumor atingiu 500 mm

3 e os tumores foram deixados crescer a 2000 mm

3 (C). níveis RelB e IL-8 foram quantificados nos lisados ​​tumorais e analisados ​​estatisticamente (D). A análise estatística para volumes tumorais e os níveis de proteínas-alvo, como descrito na Figura 4.

Discussão

PSA é um receptor de andrógeno (AR) serina-protease -regulated produzida por células epiteliais da próstata [17]. Embora um nível de PSA no soro elevada se correlaciona com a presença de CaP, diversos factores, tais como a inflamação, infecção, hiperplasia prostática, assim como processos de tecido, conduzem a alguma perda de integridade da glândula prostática e fugas de PSA do lúmen para o intersticial líquido e para a circulação geral. [18], [19]. Além disso, o PCA pode estar presente, na ausência de níveis de PSA no soro elevadas [20]. De facto, não existem níveis detectáveis ​​de PSA em linhas celulares de CaP independente de androgénios, tais como PC3 e DU-145. Apesar de PSA é utilizado como um biomarcador para o diagnóstico de APC, a sua função biológica não foi totalmente elucidado. Os resultados do presente estudo demonstram que o nível de PSA celular pode ser um indicador importante da resposta das células CaP de IR. A regulação negativa do PSA em células LNCaP que respondem a androgénios conduz a radiossensibilidade reduzida e expressão de PSA em células PC3 independente de androgénios resulta em radiossensibilidade aumentada, sugerindo que a PSA desempenha um papel importante na resposta de células APC a radioterapia.

IL-8, uma citocina pró-inflamatória, expressa unicamente em células CaP independente de androgénios, mas não em células CaP responsivos aos andrógenos [8], [21]. Elevados níveis de IL-8 em CaP avançada têm sido considerados como um factor principal que contribui para a proliferação de células cancerosas e a sobrevivência após tratamentos [6], [12]. O presente estudo revela uma relação interessante entre a PSA e IL-8 na resposta de células APC a radioterapia. A relação inversa entre PSA e IL-8 expressões confunde a conclusão de que as mudanças observadas na radiossensibilidade do CaP são dependentes de nível de PSA; Alternativamente, o efeito observado de PSA pode ser mediada, em parte, por uma mudança no nível de IL-8. Os dados apresentados neste relatório demonstram directamente o papel de IL-8 no radiossensibilidade das células APC. Juntos, estes resultados destacam a intrincada relação entre IL-8 e PSA, que contribuem para a resposta das células APC, para radioterapia.

NF-kB é constitutivamente ativo em muitos tipos de câncer, e ela funciona no aumento da regulação de genes anti-apoptóticos e oncogénicas [10], [22], [23]. Outra importante função biológica do NF-kB está relacionada com a coordenação das respostas imune inata e adaptativa que mantêm os sistemas de defesa celular [3]. A inibição da NF-kB é, portanto, considerado um complemento útil para quimioterapia tradicional ou radioterapia. NF-kB consiste em cinco proteínas relacionadas-Rel, que contêm a /p50 via clássica mediada pelo heterodimero RelA e a via alternativa RelB /p52 heterodímero mediada [3], [10], [13]. RelB é expresso exclusivamente em células CaP avançada e a via alternativa baseia-RelB desempenha um importante papel na tumorigénese do CaP [24], [25]. Nós mostramos anteriormente que a inibição selectiva da via alternativa notavelmente suprime a tumorigenicidade de células CaP [5], [26], [27]. Os resultados do presente estudo demonstram que RelB também podem desempenhar um papel crítico na radiorresistência de células APC, em parte, através de um efeito inverso sobre a expressão de IL-8 e PSA.

AR actividade é essencial para a iniciação APC e progressão. Mesmo quando CaP progride para as fases refractário a hormonas, a sinalização AR permanece através de uma variedade de mecanismos independente de androgénios [28]. Assim, a ablação da função AR é o objetivo da terapia de primeira linha. Embora estes tratamentos são inicialmente eficaz, os tumores recorrentes surgem com actividade restaurada ar [29], ou mesmo com outros receptores de ligação ao ligando [30]. Como um alvo de AR, o rastreio PSA monitora a gestão de CaP. No entanto, a presença de AR não é adequado para a previsão da eficácia da terapêutica porque o nível de PSA pode também ser regulada por vários outros factores. Um grande número de estudos demonstraram que ambos RA e de sinalização de NF-kB são factores importantes na progressão de CaP. A restauração da actividade de AR, na ausência de androgénio é considerado um mecanismo de CaP à medida que progride para o estágio refractário a hormonas [29]. Além disso, o NF-kB mediada por activação de IL-6-STAT3 é pensado para ser um outro mecanismo importante para a metástase do tumor [31]. No entanto, conversas cruzadas entre as duas vias de sinalização é indescritível. Os resultados deste estudo demonstram que a sobre-expressão de RelB aumentou o nível celular de IL-8, mas diminuiu o nível de PSA, sugerindo que os genes-alvo de NF-kB podem ser regulados diferencialmente por diferentes membros da família NF-kB ou que RelB pode servir como co-activador de transcrição de IL-8, enquanto que serve como co-regulador negativo para a transcrição de PSA. Tem sido demonstrado que a combinação de RelB e receptor de hidrocarboneto de arilo (AHR) pode activar a transcrição a partir de um elemento RelB /AhR localizado exclusivamente a montante do local de IL-8-kB [32]. Também tem sido mostrado que NF-kB suprime a transcrição de PSA por meio de um elemento receptor de androgénio localizado na região promotora de um gene [33]. A nossa descoberta é consistente com a possibilidade de que o NF-kB não só tem a capacidade para activar o seu gene alvo, mas também para inibir o seu gene alvo, dependendo da composição dos factores que afectam a transcrição.

A terapia de radiação provoca a paragem do crescimento e morte em células de cancro, quer por ionização directa de DNA ou por geração de espécies de oxigénio reactivas (ROS) que podem danificar o DNA. Tem sido demonstrado que os agentes genotóxicos, incluindo IR, induzida por quebras de cadeias duplas (DSB) estimular a via de NF-kB para gerar positiva laços de realimentação através da produção de citoquinas, que por sua vez activa os mecanismos de reparação de ADN [34] – [36]. A via de NF-kB activado por citocinas, também pode levar à indução das enzimas antioxidantes, que protegem as células de cancro contra ROS terapêutica geradoras. Os nossos estudos anteriores que demonstram que a inibição do NF-kB e o seu alvo antioxidante, superóxido de manganês dismutase (MnSOD), notavelmente aumentar a radiossensibilidade das células cancerosas da próstata agressivos [5], [25], são consistentes com a conclusão de que este mecanismo mais tarde.

O mecanismo pelo qual o PSA pode modular a resposta celular a radiação terapêutica permanece desconhecida. É possível que o efeito negativo observado de PSA é devido, em parte, ao aumento do nível de IL-8 quando o PSA está reduzida. Com efeito, observou-se associação inversa de PSA e de IL-8, em ambas as células CaP responsivos aos andrógenos e independente de androgénios, o que sugere que o aumento da relação de IL-8 ao PSA contribui para radiorresistência das células APC. futuros estudos para determinar como o nível de PSA afeta a produção de IL-8 seria interessante.

Em resumo, o presente estudo utiliza abordagens experimentais complementares para mostrar que RelB contribui para radiorresistência de células APC e inversamente regula IL -8 e PSA expressões. A relação inversa entre os níveis de PSA e de IL-8 é preditivo para a resposta de células APC a radiação, sugerindo que o potencial para melhorar a radioterapia de CaP por modulação directa de IL-8 e /ou PSA níveis. Esta é a primeira evidência experimental para implicar o papel da PSA na radioterapia de células APC. Insights obtidos no presente estudo fornecem uma base científica para a utilização da razão /PSA IL-8 como um indicador de celular para a gestão de células CaP por radiação.

Materiais e Métodos

cultura celular e tratamento

carcinoma da próstata humano LNCaP e PC3 (American Type Culture Collection, ATCC) foram cultivadas e mantidas em meio RPMI com soro fetal bovino a 10%. As células foram tratadas com IR utilizando uma máquina de raios-X de 250 kV (Faxitron X-ray Corp.) com energia de pico de 130 kV, 0,05 mm de filtro de Al, a uma dose de 0-5 Gy. Para examinar o efeito de IL-8 em respostas de radiação, as células LNCaP foram pré-tratados com IL-8 (BD Biosciences) em concentrações de 0 a 100 pg /ml durante 12 h antes da exposição à radiação. Radiossensibilidade de células CaP foi quantificada utilizando fracção de sobrevivência de células determinado por ensaio de exclusão de azul de tripano, tal como previamente descrito [26].

transfecção celular

Para expressar RelA, RelB, PSA, IL-8, proteínas e p100M IκBαM em células APC, foram usadas construções de expressão que codificam estas proteínas. RelA (p65) construção de expressão é um dom do laboratório de Nancy Rice (NIH); o cDNA p65 foram clonados entre H

ind

III – X

ba

locais I em PRC-CMV vector; RelB, PSA e IL-8 construções de expressão foram adquiridos a Applied Biosystems abertas. Catálogo RelB No .: MHS1010-7507797; Catálogo PSA No .: MHS1010-9205472; IL-8 catálogo No .: MHS1010-58052. O cDNA foram clonadas entre E

CR

V – N

ot

Eu sites em pCMV-Sport6 ​​vector; construção P100M foi fornecida pelo laboratório Dr. Shao-Cong da Sun na Pennsylvania State University [37]. sequência P100M foi clonado entre H

ind

III – X

ba

locais I em pCMV4 vector; construção IκBαM foi fornecida pelo laboratório do Dr. Veronique Imbert, cellulaire aderência, Hôpital de Sainte Marguerite, Marselha, França. IκBα (S32-36A) sequência mutante foi clonado em E

CR

local V em pcDNA 3.1 vetor. Todos os vectores contêm um promotor de CMV e foram utilizados sem qualquer condição indutível. Os clones transfectados estáveis ​​foram seleccionados por resistência à neomicina. Para knock-down RelA endógena, RelB, PSA e IL-8 em células APC, o siRNA específico (Santa Cruz Biotech.) Foi transfectada. baseada em lentivírus shRNA constrói (Open Biosystems) foram usadas para knock-down estavelmente os alvos de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de proteínas foi confirmada por Western blot. Um repórter plasmídeo NF-kB-luciferase contendo quatro cópias dos elementos de NF-kB ligada a um promotor de SV40 no vector pGL3 (Promega) foi construído anteriormente [25]. A construção repórter foi co-transfectada com o vector de expressão de PSA ou PSA siRNA (Santa Cruz Biotech.) E β-galactosidase (β-Gal) para construir células LNCaP para determinar o efeito de PSA na activação transcricional de NF-kB.

Animais

Quatro semanas macho velho NCRNU (nu /nu atímicos nus) ratos foram adquiridos a Taconic (Hudson). 1,8 × 10

6 células CaP misturadas com Matrigel (BD Biosciences) foram injectados nos flancos direitos dos murganhos. Os volumes dos tumores foram calculados semanalmente utilizando um padrão fórmula (A x B

2 × 0,52; A e B representam os comprimentos de tumor diagonal). Os tecidos tumorais foram recolhidas, e 100 ug tecidos foram lisadas para quantificar os níveis de proteína utilizando Western blots. procedimentos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use da Universidade de Kentucky, Protocolo de Aprovação No. 01077M2006.

Western blot.

Para quantificar os níveis de proteína, extratos de células e tecidos foram separados utilizando SDS-PAGE, 8% (w /v) em gel de poliacrilamida, e, em seguida, transferidos para uma membrana de nitrocelulose e colocados a hibridar com anticorpos primários contra RelA, RelB, P100, IκBα, PSA, IL-8 e β-actina. Um anticorpo secundário conjugado anti-IgG de ratinho de cabra-HRP foi utilizado para detectar RelA, PSA, IL-8, e β-actina. Outras proteínas foram detectadas utilizando um anticorpo secundário conjugado de anti-IgG de coelho-HRP de cabra. Imunotransfer�cias foram visualizados por um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).

IL-8 quantificação

media em cultura foram recolhidos no final dos procedimentos experimentais. Os níveis de IL-8 segregadas a partir de células de cultura foram quantificadas utilizando um kit de ELISA IL-8 (BD Biosciences) de acordo com o protocolo do fabricante.

analisa os dados estatísticos

Várias experiências independentes foram realizados para cada conjunto de dados. Imagens em transferências de Western foram quantificados utilizando software Carestream Molecular (Carestream Health Inc.). A significância estatística foi analisada utilizando ANOVA de uma via e teste de comparação múltipla de Tukey, seguido de análise de dados com Graphpad Prism.