Abstract

Purpose

Novos agentes anticancerígenos que têm como alvo um único receptor da superfície celular, regulado para cima ou amplificados produto do gene ou gene mutado, reuniram-se com algum sucesso no tratamento de cancros avançados. No entanto, os tumores dos pacientes ainda, eventualmente, progredir sobre estas terapias. Se fosse possível identificar um maior número de vulnerabilidades segmentáveis ​​no tumor de um indivíduo, vários alvos pode ser explorada com o uso de agentes terapêuticos específicos, assim, possivelmente dando as alternativas terapêuticas viáveis ​​de pacientes.

Experimental Design by

neste estudo exploratório, usamos tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS), incluindo sequenciamento todo genoma (WGS), e sempre que possível, toda transcriptoma sequenciamento (WTS) para identificar eventos genômicos e mudanças de expressão associados em pacientes com câncer avançado.

resultados

WGS no tumor emparelhados e amostras normais de nove pacientes com câncer avançado e WTS em seis dos tumores desses pacientes foi concluída. Um tratamento do paciente foi baseada em alvos e vias identificadas por NGS e o doente teve uma resposta de curta duração PET /CT com uma redução significativa na sua dor relacionado com o tumor. Para conceber planos de tratamento com base na informação obtida a partir de NGS, vários desafios foram encontrados: relatando NGS atrasos, a comunicação dos resultados aos participantes de fora da estado e seus oncologistas tratam, ea cadeia de custódia manipulação de amostras de biópsia frescas para Clinical Laboratory Improvement Alterações ( CLIA) de validação alvo.

Conclusão

Embora o esforço inicial foi um processo mais lento do que o previsto devido a uma variedade de questões, demonstramos a viabilidade do uso NGS em pacientes com câncer avançado de modo que os tratamentos para pacientes com tumores progridem pode ser melhorada

Citation:. Weiss GJ, Liang WS, Demeure MJ, Kiefer JA, Hostetter G, Izatt T, et al. (2013) Um estudo-piloto utilizando Next-Generation Sequencing em cancros avançados: Viabilidade e desafios. PLoS ONE 8 (10): e76438. doi: 10.1371 /journal.pone.0076438

editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapura

Recebido: 24 Abril 2013; Aceito: 23 de agosto de 2013; Publicação: 30 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Weiss et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecida pela Fundação Nacional de Pesquisa do Câncer (www.nfcr.org) eo Fundo Lee T. Hanley para a Investigação do cancro do pâncreas (https://www.tgenfoundation.org/netcommunity/page.aspx?pid=1196). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pacientes com câncer avançado opções de tratamento, muitas vezes de escape. Eles podem participar em II de testes de novos agentes anticancerígenos Fase I ou Fase se cumprem os critérios de elegibilidade normalmente rigorosos e ter acesso a centros que pode administrar agentes de investigação. Quando os doentes participar nestes ensaios, novos agentes, em média, dar as taxas de resposta de entre 5% e 10% em uma Fase I configuração e 12%, num ambiente de Fase II [1] – [3]. Os pacientes também têm uma opção para melhores cuidados de suporte em uma tentativa de resolver os seus sintomas.

Recentemente, tem havido uma explosão de interesse no desenvolvimento de novos agentes anticancerígenos que são mais direcionados, geralmente contra um receptor da superfície celular ou um -regulada ou amplificados produto do gene ou gene mutado. Esta abordagem está a cumprir com algum sucesso (por exemplo trastuzumab contra HER2 /

neu

em células de câncer de mama, erlotinib contra o câncer de pulmão de não pequenas células EGFR-mutante, etc.). No entanto, os tumores dos pacientes ainda, eventualmente, o progresso nestas terapias porque contêm várias anomalias genómicas, e destinada a um único anormalidade não é suficiente para prevenir a progressão. Se fosse possível identificar um grande número de alvos de tumor de um indivíduo, onde existem agentes que poderiam potencialmente orientá-las, múltiplos alvos poderiam ser tratadas usando agentes terapêuticos específicos, e, talvez, reduzir a probabilidade de progressão. Em última análise, a maioria dos investigadores prevemos utilizando vários agentes para atingir alvos múltiplos presentes no tumor de um paciente. No entanto, a identificação e aplicação das terapêuticas adequadas continua a ser um desafio.

Nós já realizou um estudo prospectivo multicêntrico utilizando perfil molecular dos tumores por imuno-histoquímica (IHQ), hibridização fluorescente in situ (FISH) e microarray de DNA para encontrar alvos potenciais drogas e tratamentos seleccionados em conformidade [4]. Sessenta e seis dos 84 pacientes foram tratados com base no perfil molecular de seu tumor. Para 18 desses 66 pacientes, o tratamento derivado pelo perfil molecular, levou a uma taxa de sobrevivência livre de progressão ≥1.3, sugerindo assim um benefício do tratamento. profiling Molecular apoiou a indicação de um novo tratamento que não está prevista inicialmente pelo investigador, em uma população de pacientes que foi fortemente pré-tratados e refratários aos tratamentos anteriores.

Para desenvolver esse passo inicial para a terapia personalizada, usamos NEXT- tecnologias de geração de sequenciamento (NGS), incluindo sequenciamento do genoma inteiro (WGS), e sempre que possível, toda transcriptoma sequenciamento (WTS) para identificar eventos genômicos e mudanças de expressão associados em pacientes com câncer avançado. Usamos WGS para sequenciar DNA biópsia do tumor e combinados ADN da linha germinativa a partir de nove pacientes com câncer avançado para identificar alterações somáticas chave. O ADN da linha germinal foi amostrado a partir de células de sangue brancas e o DNA do tumor foi amostrado a partir de células tumorais. Por seis desses pacientes, também usado WTS para sequenciar ARN total isolado a partir do tumor, juntamente com controles de RNA total não-paciente. Como os perfis de expressão de genes diferem entre tipos de tecidos, e o tecido saudável não poderia ser feita a biópsia do paciente para comparação, comercialmente adquirido ARN normal para o tecido correspondente foi comparado com ARN isolado a partir do tumor. Em seguida, avaliamos alterações transcriptomic e realizou genômica integrados análises [5] com os dados WGS para identificar potenciais alvos druggable. Aqui, nós demonstramos a viabilidade e destacar os desafios da utilização de tecnologias NGS de forma prospectiva em pacientes com câncer avançado.

Métodos

Declaração de Ética

O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Institutional Review Board Ocidental (WIRB® Protocolo # 20.101.288) (NCT01443390). consentimento informado por escrito foi obtido de pacientes, incluindo consentimento por escrito para a publicação dos detalhes clínicos e imagens.

Objetivos do Estudo

O objetivo principal deste estudo foi identificar o maior número de alterações genômicas quanto possível em cancros avançados, de modo a ampliar o leque de potenciais alvos acionáveis ​​com terapias que estavam comercialmente disponíveis ensaios ou clínicos. O objectivo secundário foi o de desenvolver um processo de fluxo de trabalho a partir da biópsia do tumor ao tratamento; Na verdade, este processo deve ocorrer em um período de tempo suficientemente curto para que os pacientes se beneficiar desta informação adicional no desenvolvimento de um plano de tratamento. Isto incluiu a medição do tempo a partir de biopsia de realização e análise final de NGS em amostras de tumor do paciente e não tumorais, examinando a frequência com a qual os dados de sequência utilizável é obtida como uma função de envolvimento percentual de tumor na biópsia, e na avaliação da correlação entre o anti -tumor atividade de tratamentos identificadas pelo NGS.

design estudo

a justificação para este estudo é que NGS poderia ser usado para identificar não apenas uma, mas muitas anormalidades genómicas que poderiam ser direcionados usando potencialmente disponíveis terapias em pacientes com câncer avançado. Este único centro, estudo piloto prospectivo, de braço único foi realizado em doentes com cancro avançado que evoluíram na terapia sistémica padrão ou se o seu tipo de tumor não tinha uma terapia sistémica padrão. Este estudo teve caráter exploratório. Para participar, os pacientes devem ter sido idade ≥18 e dispostos a passar por uma biópsia ou procedimento cirúrgico para obter o tecido, a menos que um tumor congelado recolhido menos de 8 semanas antes estava disponível. Os interessados ​​foram informados que a obtenção de uma nova biópsia pode não ser uma parte dos cuidados de rotina do paciente para a sua malignidade. Outros critérios de elegibilidade incluíram: dados de laboratório de referência indicando reserva aceitável medula óssea, fígado e função renal, estado de Karnofsky desempenho ≥80%, ea expectativa de vida 3 meses. Participação noutro ensaio clínico envolvendo tratamento antes ou durante a participação neste estudo era permitido. critérios de exclusão principais eram metástases sintomáticos ou não tratados do sistema nervoso central (CNS), infecções activas conhecidas que requerem terapia intravenosa antimicrobiana, as mulheres grávidas ou a amamentar, ou tumor que era inacessível para uma biópsia. Indivíduos com HBV conhecida, VHC, ou infecção (s) de HCV requerendo terapia antiviral também foram excluídos como essa população é frequentemente excluídos do primeiro-em-humanos oncologia ensaios clínicos; limitando assim a margem para potenciais opções de tratamento para este grupo. Todos os pacientes elegíveis tinham sangue total e uma amostra de tumor fresco congelado recolhidas e enviadas para análises. Estes métodos e informações sobre os dados de sequenciação matérias são descritos mais adiante na secção suplementar. Nós inicialmente previsto cerca de 100 dias a partir da biópsia do tumor fresco para a conclusão da NGS. Após análise NGS foi realizada, os principais investigadores analisou os resultados e, quando clinicamente apropriado, escolheu alvos para validação por um (Clinical Laboratory Improvement Alterações) laboratório certificado pela CLIA. Durante cinco amostras de pacientes com baixa porcentagem de tumor, sequenciamento exome foi adicionado para identificar potenciais alvos acionáveis. Após a validação alvo, um relatório foi fornecido ao tratamento oncologista com possíveis recomendações de tratamento, que podem ser utilizados em sua /seu critério.

Resultados

características do paciente

Todos os pacientes foram vistos e avaliados para inclusão neste estudo entre outubro de 2010 e fevereiro de 2012 em um único centro. Para evitar atrasos de fluxo de trabalho em máquinas NGS disponíveis, a triagem para pacientes foi espaçados para permitir que há mais de dois candidatos potenciais por mês. Como o centro realização do estudo recebe referências de todo o país para 1 estudos de fase, algumas pessoas vieram de fora do estado para uma triagem e consentimento de avaliação programada, e após confirmação da elegibilidade, prosseguiu com uma biópsia do tumor fresco dentro de 24 horas. Isso foi feito para a conveniência do paciente para permitir a viagem de volta para casa logo após a avaliação inicial. Ele fez criar desafios logísticos com follow-up e transmitir os resultados de volta para o médico assistente. Para os pacientes que vivem dentro de um raio de distância, o processo de inscrição foi semelhante, embora a biópsia nem sempre foi marcada para o dia seguinte.

A Tabela 1 apresenta as características dos 11 pacientes que consentiram para este estudo. A maioria dos pacientes eram homens, com uma idade mediana de 59 anos (variando de 20 a 69 anos). É de notar, no momento do seu consentimento, todos menos um dos pacientes (paciente 9) tinha progredido em, pelo menos, um tratamento sistémico anterior para doença avançada (3, gama 0-8). O paciente 9, com diagnóstico de carcinoma adeno avançado de pâncreas, foram submetidos à terapia sistêmica e, posteriormente progrediu após resultados NGS se tornou disponível.

Figura 1 detalha as Normas Consolidadas do Reporting Trials (CONSORT) diagrama demonstrando o fluxo de os 11 pacientes que consentiram e foram avaliadas para o estudo. Dois pacientes (pacientes 1 e 5) foram submetidos a biópsia do tumor e tinha DNA suficiente disponível para análise NGS, devido à falta de celularidade tumor adequada observada nos espécimes coletados (Tabela 1 e Tabela S1). Para os restantes nove pacientes com cancro avançado, foi realizada em ambos WGS ADN de tumor, bem como do ADN da linha germinal isoladas a partir de sangue total, a fim de identificar tanto alterações somáticas; respectivamente. métricas WGS e estatísticas de resumo para cada um dos nove pacientes são apresentados na Tabela S1. Seis pacientes tinham ARN de tumor disponíveis que foram analisados ​​com sucesso por STV. Durante os últimos três pacientes (pacientes 9, 10 e 11) inscritos no estudo, realizamos uma análise biológica mais envolvidos dos dados genômicos montados para discernir caminhos biológicos notáveis ​​que podem ser afetados em câncer do paciente para identificar possíveis alvos terapêuticos.

* – análise de enriquecimento prospectivo foi realizado antes de discutir os resultados com o paciente e tratamento médico oncologista para os últimos três pacientes inscritos

dos 9 pacientes com WGS e /ou exome. sequenciação e /ou análise WTS disponíveis, foram identificados potenciais alvos e vias para todos, mas paciente 2 (88,9%) (Tabela 1). Para os nossos objetivos secundários, o tempo médio de biópsia para conclusão e análise final da NGS em amostras de tumor do paciente e não tumorais foi de 91 dias (intervalo de 46-243 dias). As principais razões para os valores extremos eram ou problemas de instrumento de sequenciação ou resultado da baixa porcentagem de tumor na amostra que exijam sequenciamento exome para identificar potenciais alvos acionáveis. Para o protocolo utilizado, exome sequenciação de ADN necessária mais de entrada (3 ug) do WGS (1 ug) e fornecida informação sobre as regiões de codificação e não traduzidas que flanqueiam regiões do genoma. Para sete dos casos, as amostras de tumores iniciais foram enviados diretamente para nossa instituição para avaliação patologia de modo a que porcentagem do tumor pôde ser verificada. O teor mínimo de celularidade do tumor para o sucesso NGS foi de 30% (Tabela 1).

Whole sequenciação do genoma

Para o estudo piloto completo, sequenciamento foi realizado por tecnologia de síntese e 100 bp-end emparelhado química . Geramos mais de 19 mil milhões totais lê a partir WGS para coberturas médias mapeadas que variam de 17 × a 71 ×. SNP (single nucleotide polymorphism) chamada foi realizada utilizando duas chamadas separadas para reduzir a taxa de falsos negativos. Para avaliar a qualidade geral dos dados variantes, SNPs germinativas foram chamados e a transição para a transversão e dbSNP (Single Nucleotide Polymorphism Banco de Dados) [6] 129 rácios de concordância foram calculados. Para todos os pacientes, os rácios de transição /transversão estavam no intervalo de 2,01-2,24, e a taxa de concordância dbSNP 129 variou 86,0-89,4 (Tabela S1). A partir dessas análises não há preconceitos foram detectados no que diz respeito ao nucleótido substituições, os SNPs identificados estão fortemente relacionadas com as variações genéticas comuns, ea variante de alta qualidade de chamada foi realizada. Para todos os pacientes, houve um total de 5.778 codificação eventos genômicas identificadas (mediana = 15,5). Paciente 2, uma fêmea não-fumante com adenocarcinoma do pulmão metastático, abrigado a maioria destes acontecimentos genómicos que codificam (n = 4137), incluindo uma mutação TP53 nonsynonymous (G226V) com expressão específica de 100% alelo mutante, e um 8q intersticial CNV (número de cópias variação) ganhar englobando MYC. O paciente 11, com uma fêmea carcinóide brônquica metastático, tinha os acontecimentos genómicos que codificam menor número (n = 4). Exome sequenciação foi realizada em amostras de tumores de pacientes 6, 7, 8, 10 e 11 com métricas fornecidas na Tabela S1. resultados da CNV são fornecidos na Tabela S2.

sequenciamento do transcriptoma inteiro de

WTS foi realizada em seis pacientes (Tabela 1 e Tabela S1) e RNA tecido normal correspondente não-paciente baseada na origem do tumor primário . Como o tecido normal adjacente não foi coletada de pacientes durante a biópsia, o RNA total para o tecido relevante foi comercialmente adquirido. bibliotecas de RNA foram preparadas para estas amostras e sequenciados com as respectivas bibliotecas de RNA tumor. Tumor de dados WTS foi comparado ao correspondente tecido normal de dados WTS para identificar mudanças de expressão nas biópsias de tumores. Cada um dos tumores analisados ​​apresentaram genes com expressão muda significativas com q . 0,05, corrigido para testes múltiplos (número médio de genes diferencialmente expressos 1731, a gama 495-2,323) (Tabela S3)

Copy Number Variação

as amplificações e deleções foram detectados por regiões que identificam onde havia um delta (+/-) em log2FC (como descrito acima) maior do que 2 desvios padrão da média log2FC entre o braço do cromossoma a ser interrogada. Delta foi calculado subtraindo os pontos finais de cerca de 1 MB janela deslizante. Além disso, as regiões detectadas necessários para ser inferior a 14 MB de comprimento a ser marcado como um evento focal. Tabela S2 contém todos os eventos focais que contêm genes COSMIC para pacientes 2, 3, 4, 7 e 8. Os pacientes 9 e 11 não possui eventos focais que continham genes cósmica. Pacientes 6 e 10 não possui eventos focais (ver Tabela S3 e Figura S7)

prospectivo Enriquecimento Análise

Durante os últimos três pacientes inscritos, foi realizada a análise de enriquecimento de WGS e /ou exome sequenciamento e WTS. Detalhes para cada paciente individual são as seguintes:

O paciente 9 carcinoma adeno do pâncreas

Dos nove pacientes que tinham tumores analisados ​​pela NGS, paciente 9 (câncer de pâncreas adeno) é o único indivíduo cujo tratamento foi baseado em metas e vias identificadas pelo NGS. Somente dois tipos de dados estavam disponíveis para análise em tecidos deste paciente, variações de nucleotídeo único (SNV) e WTS. Há regiões significativas de alteração foram observados nos dados do número de cópia.

Os 20 melhores mapas canônicos enriquecidos nos dados WTS são apresentados na Figura S1. mecanismos biológicos comuns associados com estes top 20 mapas enriquecidos incluem aderência, remodelação do citoesqueleto e processos imunes /quimiotaxia. Tais enriquecimentos implica uma activação generalizada de remodelação da matriz extracelular que pode estar relacionada com o fenótipo para este tipo de tumor raro. Dois mapas de nota no top vinte mapa via enriquecimentos são mapas específicos de câncer pancreático construídos especificamente para processos de captura alterados em câncer pancreático. Estes mapas, intitulado ‘interações tumor-estroma em câncer de pâncreas “e” Papel das células estreladas na progressão do câncer de pâncreas “, destaque ainda possível interação estroma /ECM dentro deste tumor. O «papel de células estreladas na progressão do câncer de pâncreas” mapa é apresentado na Figura S2.

Uma observação adicional da inspeção dos dados WTS sobrepostos mapas de sinalização é o possível envolvimento de TGF-beta mediada epitelial para mesenquimal neste tumor. «Regulamento de Desenvolvimento de epitelial para mesenquimal (EMT)” mapa (figura S3), destaca os dados WTS sobrepostos como representado pelos termômetros ao lado de nós no diagrama. Um termómetro vermelho significa que o gene é sobre-expressa e azul significa que o gene é underexpressed.

dois ligandos, o TGF-beta 1 e TGF-beta 2 estão ambas sobre-regulada juntamente com o seu receptor cognato, o tipo do receptor de FTC-beta II. A regulação positiva combinada dos fatores de crescimento /pontos pares receptor de potencial importância deste par de sinalização de ser “ativo” neste tumor. Evidências adicionais ligando de sinalização beta TGF a EMT é realçada pela regulação positiva de Lef-1, TCF8 e fatores de transcrição E2A. Estes factores de transcrição funcionar a jusante de TGF beta para sinalizar para EMT. Mais uma prova da sua activação é a infra-regulação da caderina-E, que é uma característica do fenótipo EMT. A presença do fenótipo EMT seria portend relativa resistência a muitos agentes terapêuticos e significam um tumor metastático.

A inspecção dos dados WTS revela a sobre-expressão de possíveis alvos para intervenção. Como mencionado acima, a regulação par ligando /receptor sugere a activação e regulação positiva de neuropilina 1 e VEGF-A. Isto pode representar vulnerabilidades às terapias anti-angiogénicos. metas adicionais que foram upregulated são ESR1, ABL1, GART, VDR e ERBB2.

tumor do paciente 9 teve mutações notáveis ​​no KRAS (G12R) e PIK3CA (R93W). Ambas estas mutações ligar a sinalização para o crescimento e proliferação. Estas mutações coexistentes sugerem que combinada segmentação de MEK /ERK e PI3K /AKT para o tratamento deste tumor seria mais eficaz do que a segmentação apenas uma das duas mutações. Enquanto a mutação KRAS foi validada por testes CLIA, a região contendo a mutação PIK3CA não fazia parte de um teste comercial e, portanto, não confirmado em condições CLIA. Outra proeminente SNV está no gene RAD50 (Q737R), que codifica para uma proteína que está envolvida em ADN de cadeia dupla reparação de quebras. função defeituosa de RAD50 tem sido associada a sensibilização para a cisplatina e o aumento da sensibilidade a inibidores de PARP [7].

O paciente foi inicialmente tratada com cisplatina e gemcitabina e depois progrediu. Naquele tempo os resultados WGS /WTS se tornaram disponíveis eo paciente matriculados em uma fase I PI3K estudo inibidor MEK e combinação inibidor. O paciente teve uma resposta curta duração /CT PET sobre este estudo (Figura 2) e isso também foi acompanhada por uma diminuição dramática na sua dor de moderada a nenhum (4/10 a 0/10 na escala de dor visual).

18 fluorodeoxyglucose tomografia por emissão de pósitrons /tomografia computadorizada (PET /CT) imagens que descrevem (a) corte axial no início e (B) corte axial após 30 dias de tratamento. A seta amarela está apontando para dois gânglios linfáticos hipermetabólicas em B e C. Em B, o valor de captação padrão (SUV) do linfonodo resta é 9.8 eo nó de linfa da direita é 7,5, enquanto o SUV do linfonodo esquerda é 3.1 eo nó de linfa do lado direito é de 3,5 em C.

paciente 10 metastático carcinoma de células renais papilar

os dados para análise para este paciente consistia apenas de SNVS e WTS como nenhuma foram identificados cópia aberrações numéricas. Os 20 melhores mapas canônicos revelam temas comuns ao redor do ciclo celular, o cromossomo /função de fuso, adesão celular, e de transição EMT. Uma via de nota é o “ciclo celular de montagem do fuso e cromossomo separação” mapa (Figura S4). Um certo número de genes envolvidos com este mapa são regulados positivamente em esta do tumor, incluindo o AURKB alvo druggable (log2ratio = 6,3). montagem do fuso e separação cromossomo são vitais para a divisão celular com um número de alvos de drogas oncológicas associadas a este processo. Dois SNVS também estão presentes nos genes (STAG1 (F802Y) e NUMA1 (L1400P)) nesta via e sugerem a importância destas alterações neste tumor.

Outras vias com significância estatística que contêm observações importantes relacionadas com a biologia deste tumor e possíveis opções terapêuticas estão indicadas. O ‘estimulação EGF e HGF dependente de metástase em câncer gástrico “mapa revelou regulação positiva do HGF e do seu receptor MET. Este mapa foi construído a partir de informações específicas câncer gástrico, apesar de muitos cânceres compartilham vias de sinalização semelhantes e moléculas. Tendo tanto de receptor e ligando upregulated sugere um mecanismo autócrino de sinalização. Como mostrado na Figura S5, alfa-6 /beta-4 integrina componentes são regulados positivamente e a função em conjunto com MET para activar a transdução de sinal a jusante. O possível envolvimento do TEM é uma observação importante como é atualmente um alvo de oncologia droga atraente.

inspeção adicional dos dados revelou a presença de alterações no nível de RNA de alvos potenciais da droga. O ligando de sinalização angiogénico mRNAs VEGFA, TOP2A, e ASNS são regulados positivamente. Estes três genes são alvos de agentes oncológicos actuais. Além disso, MGMT ARNm, que é um gene de reparação de ADN que transporta a resistência à temozolomida, é regulada negativamente, o que sugere a temozolomida como uma opção de tratamento. Por último, este tumor tem um SNV no gene que codifica APTX para uma proteína envolvida na reparação do DNA que podem transmitir a sensibilidade irinotecano [8].

11 Paciente cancro metastático neuroendócrino brônquica

Três tipos da informação genómica disponível para análise de tecidos deste paciente incluído WTS, CNV (Tabela S2), e os dados SNV. Apenas quatro SNVS em dois genes, KRT4 e GOLGA6L10, foram identificadas, resultando nos dados WTS e CNV condução a narrativa biológica sobre este tumor. Figura S6 exibe os 20 melhores mapas via canonical de análise de enriquecimento de dados do paciente 11 do. Os temas representados pelos títulos destes mapas não são tão concisa como no paciente 10, mas novamente, observamos citoesqueleto e mapas adesivas dominando. De nota, não há ciclo celular ou cromossomo mapas centrados são enriquecidos possivelmente sugerindo um tumor minimamente mitótico. Em termos de genes alvos, houve vários genes sobre-expressos específicas, incluindo KIT, PDGFRB, EGFR, FGFR1 e SPARC. Deve-se notar que nenhum número variações de cópia foram vistos nestes genes.

Discussão

Neste estudo piloto exploratória, construímos em nossa experiência anterior com perfil molecular potencial. Como esta é uma tecnologia emergente, não eram esperados e imprevistas desafios encontrados durante o curso do estudo conduta. A população de pacientes avaliados neste piloto tinha avançado cancros com a progressão da doença e, infelizmente, por dois indivíduos, os resultados tornaram-se disponíveis depois de deterioração clínica significativa ou morte (pacientes 2 e 3). Embora o estudo estava em andamento, o custo do sequenciamento continuou a diminuir, e as ferramentas melhoradas para WTS e integração de WGS com WTS emergiu. Assim, foi adicionado WTS prospectivamente a partir paciente 7 em diante. Para o paciente 2, WTS era viável como havia tumor disponível para extração de RNA. A informação adicional do WTS para o paciente 2 foi então retransmitida para o oncologista tratamento. Além de DNA insuficiente tumoral (pacientes 1 e 5), a tecnologia e fluxo de trabalho de processamento da amostra melhorou, onde fomos capazes de incorporar exome sequenciamento (pacientes 6, 7, 8, 10, e 11), quando percentual de conteúdo tumor era inadequada da biópsia amostra . Este adicionado ao sequenciação e análise do tempo total para estes pacientes (Tabela 1) [9] – [12]. Note-se que WGS foi a modalidade preferida durante a realização deste estudo. WGS proporciona melhor resolução do número de cópias e a capacidade para identificar rearranjos, tais como inversões que se estendem por um único exão de um gene supressor de tumor. Com este tipo de inversão, não há nenhum desvio de enquadramento e o gene supressor de tumor é expresso em níveis normais. Sem isoforma ou análise de splicing, esta alteração seria perdida por IHC porque ainda se expressa ao nível da proteína, embora a proteína é inactivo devido aos aminoácidos que faltam [5]. Nós reconhecemos que exome sequenciamento fornece cobertura mais profunda para identificar as mutações de codificação. estratégias mais recentes podem capturar o melhor dos dois WGS e sequenciamento exome por incluem Long inserir genomas inteiros rasas e sequenciamento exome profunda para capturar rearranjos complexos e alcançar uma maior sensibilidade para captar mutações de codificação.

Outro desafio realizado após o estudo foi em curso foi a cadeia de custódia de manuseamento para amostras de biópsia frescos. Porque os tumores iniciais analisadas não foram submetidos a processamento de DNA /RNA em um laboratório CLIA, a validação planejada posterior de metas a partir da mesma amostra fresca não pôde ser verificada por um teste certificado pela CLIA. Além disso, a aproximadamente 2 semanas de atraso para validação CLIA acoplado com um tempo médio de 91 dias para NGS resulta de se tornar disponível era problemático. Para tumor paciente 9 de, a (G12R) mutação KRAS foi validado utilizando um teste-certificado CLIA. Para todos, mas um paciente (Paciente 2), um alvo potencialmente druggable com qualquer uma terapia disponível comercialmente ou de investigação foi identificado. Para o paciente 11, WGS não deu um alvo, e só WTS ajudaram a identificar alvos druggable. A integração da análise epigenomics também poderia fator como uma outra camada para facilitar a identificação de alvos druggable com as terapias existentes.

Mesmo que não haja atrasos técnicos ou lógicos em NGS, a interpretação ea aplicação dessas informações para a prática clínica é cheio de incertezas. Nem todos os SNVS identificados por WGS terão um efeito deletério sobre a função da proteína. Assim, a mera identificação de SNVS, mesmo quando validado em um teste com certificação CLIA, não garante que a segmentação que vai levar a uma estabilização ou diminuição da carga tumoral. Também temos de reconhecer que a heterogeneidade intratumoral e evolução clonal pode complicar nossas estratégias de tratamento concebidas para pacientes com base nos resultados de uma biópsia do tumor único [13], [14].

Durante a realização deste estudo, percebemos que com um prazo médio de 91 dias para informar dos resultados da NGS, os pacientes com um excelente nível de desempenho e baixa carga tumoral são mais propensos a ter alvos identificados que podem ser postas em prática. Com maior eficiência que reduzem o tempo para obter resultados NGS e custos razoáveis, podemos imaginar NGS pode ser aplicada mais globalmente para pacientes com câncer avançado. Mesmo durante o tempo relativamente curto que este estudo foi se matricular, observamos melhorias significativas na sequenciação analisa e reduziu os custos de reagentes. Outros relatado recentemente resultados bastante impressionantes, com 27% de taxa de resposta a terapias específicas disponíveis usando tecnologia de sequenciamento mais finito para identificar alvos druggable [15]. No geral, demonstrar a viabilidade de realizar tecnologias NGS de forma prospectiva em pacientes com câncer avançado. Prevemos que no futuro não muito distantes tecnologias NGS irá tornar-se mais facilmente disponíveis para incorporação em cuidados de rotina dos pacientes oncológicos avançados.

Conclusão

Embora o esforço inicial foi um processo mais lento do que o previsto, devido a uma variedade de questões, demonstramos que NGS pode ser utilizado em situações-se clínicos esta abordagem irá levar a um benefício real e consistente paciente ainda está para ser provado.

Informações de Suporte

arquivo S1.

Informações Suplementares

doi:. 10.1371 /journal.pone.0076438.s001

(DOCX)

Figura S1.

paciente 9 de dados WTS mapas canônicos. Esta figura ilustra as 20 melhores mapas canônicos enriquecidos nos dados WTS para o paciente 9.

doi: 10.1371 /journal.pone.0076438.s002

(TIFF)

Figura S2.

Papel das células estreladas na progressão do cancro pancreático. Esta figura ilustra o papel das células estreladas na progressão do cancro pancreático

doi:. 10.1371 /journal.pone.0076438.s003

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Figura S3.

regulamento relativo ao desenvolvimento de células epiteliais de transição mesenquimal. Esta figura ilustra o possível envolvimento de TGF-beta epitelial mediada para mesenquimal

doi:. 10.1371 /journal.pone.0076438.s004

(TIFF)

Figura S4.

mapa canônica Selecionado para 10 Paciente: montagem de ciclo do fuso celular e separação de cromossomas. Esta figura ilustra a montagem ciclo de células fusiformes e separação de cromossomos, incluindo o alvo regulada positivamente e druggable, aurora-B (AURKB)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0076438.s005

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Figura S5 .