Abstract

Os marcadores moleculares nos fluidos brônquica pode contribuir para o diagnóstico de câncer de pulmão. Nós previamente observado um aumento significativo de C4d contendo fragmentos de degradação do complemento no lavado bronco-alveolar (BAL) sobrenadantes de pacientes com câncer de pulmão em uma coorte de 50 casos e 22 controles (CUN coorte). O presente estudo foi desenhado para determinar o desempenho diagnóstico desses fragmentos do complemento (conjuntamente designadas como C4d) em fluidos brônquicas. níveis de C4d foram determinados em sobrenadantes LBA a partir de duas coortes independentes: a coorte CU (25 casos e 26 controles) e coorte HUVR (60 casos e 98 controles). Uma série de amostras de escarro espontâneo de 68 pacientes com câncer de pulmão e 10 controles também foi usado (LCCCIO coorte). conteúdo de proteína total, complementar C4, complementar C5a, e Cyfra 21-1 também foram medidos em todas as coortes. níveis de C4d foram significativamente aumentados em amostras de LBA de pacientes com câncer de pulmão. A área sob a curva de ROC era de 0,82 (IC de 95% = 0,71-0,94) e 0,67 (95% CI = 0,58-0,76) para CU e coortes HUVR, respectivamente. Além disso, ao contrário dos outros marcadores, os níveis de C4d em amostras de BAL eram altamente consistentes nos coortes CUN, Cu e HUVR. Curiosamente, teste de C4d aumentou acentuadamente a sensibilidade da broncoscopia nas duas coortes em que os dados citológicos estavam disponíveis (coortes CUN e HUVR). Finalmente, na coorte LCCCIO, C4d níveis foram mais elevados nos sobrenadantes de expectoração de pacientes com cancro pulmonar (área sob a curva ROC: 0,7; 95% CI = 0,56-0,83). Em conclusão, C4d é consistentemente elevados em fluidos brônquica de pacientes com câncer de pulmão e podem ser utilizados para melhorar o diagnóstico da doença

Citation:. Ajona D, Razquin C, Pastor MD, Pajares MJ, Garcia J, Cardenal F, et al. (2015) Os níveis elevados do complemento de ativação do produto C4d na brônquica Fluidos para o diagnóstico de câncer pulmonar. PLoS ONE 10 (3): e0119878. doi: 10.1371 /journal.pone.0119878

Editor do Academic: Cordula M. Stover, da Universidade de Leicester, Reino Unido

Recebido: 20 de novembro de 2014; Aceito: 02 de fevereiro de 2015; Publicação: 23 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ajona et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro dos arquivos de papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo “projeto UTE CIMA”, o Governo espanhol (Red Tematica de Investigación en Cooperativa Cancer RD12 /0036/0028, RD12 /0036/0040, RD12 /0036/0045, e RD12 /0036/0062; e Fondo de Investigación Sanitaria-Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) PI08 /1156, CD09 /00148, PI10 /01652, PI10 /00166, PI11 /00618, PI11 /02.688, PI13 /00806, e PI14 /01686), e Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (HEALTH-F2-2010-258677-CURELUNG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Eu li política da revista e os autores deste manuscrito tem a interesses concorrentes seguinte : Um pedido provisório de patente foi preenchida por Digna Biotech para Drs. Ajona, Pajares, Montuenga, e Pio como inventores de “novos marcadores moleculares de câncer de pulmão.” (Aplicação provisória União Europeia de Patentes no. EP12382113). Isso não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. A taxa de sobrevida global em cinco anos para o câncer de pulmão é de aproximadamente 15-20%, e menos de 5% nos casos metastáticos [2]. Uma das razões para um resultado tão sombrio é a falta de técnicas eficazes para o diagnóstico precoce da doença. Atualmente, o diagnóstico de câncer de pulmão envolve a combinação de análises radiológicas e histológicas de lesões. broncoscopia flexível representa um teste de diagnóstico inicial relativamente não invasiva em indivíduos com suspeita de doença, e é a principal ferramenta de diagnóstico em pacientes com câncer de pulmão localização central. técnicas de broncoscopia para o diagnóstico de câncer de pulmão incluem o exame citológico de amostras de biópsia brônquica, escova brônquica, lavagem brônquica, e lavado bronco-alveolar (BAL) [3, 4]. Especificidade da citologia de material broncoscopia é 100%; No entanto, a sensibilidade permanece baixa, especialmente em lesões mais periféricas, para os quais são rotineiramente necessários procedimentos diagnósticos mais invasivos [5]. Assim, existe uma procura clínica de marcadores adjuntos que podem melhorar a sensibilidade dos procedimentos de diagnóstico de cancro do pulmão

biomarcadores múltiplos detectáveis ​​em fluidos brônquica de pacientes com cancro do pulmão têm sido propostos [6, 7, 8, 9, 10. , 11, 12]. Recentemente, mostrámos que as células de cancro do pulmão activar eficientemente a via clássica do complemento. Como consequência, C4d, um produto estável divisão desta via, encontra-se elevada nas amostras de plasma e de BAL de pacientes com cancro pulmonar [13]. O objetivo do presente estudo foi validar nossa observação anterior em coortes de caso-controle independentes. Nós também teve como objetivo comparar o desempenho diagnóstico do C4d com outros potenciais biomarcadores de diagnóstico: Cyfra 21-1, proteína total, C4, e C5a. Cyfra 21-1 tem sido proposto como um biomarcador cancro do pulmão nos fluidos brônquicas [7, 14], as proteínas de plasma são aumentadas em fluidos de BAL de pacientes com cancro do pulmão [15], C4 é uma proteína de plasma abundante a partir da qual é gerado depois de C4d complemento activação [16], e C5a é um fragmento de complemento activo aumentaram em amostras de plasma de pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas [17]. Nossos resultados sugerem que a determinação de C4d em fluidos das vias aéreas supera os outros marcadores e podem ser úteis na investigação diagnóstica de pacientes com câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Amostras clínicas

O estudo incluiu três coortes de amostras de LBA e uma das amostras de expectoração. fluidos BAL foram obtidas a partir de indivíduos submetidos a broncoscopia de diagnóstico e armazenado a -80 ° C. O procedimento para a recolha de BAL foi previamente descrito [15]. A coorte da Clínica Universidad de Navarra (CUN) incluiu amostras de LBA de 50 pacientes com neoplasias pulmonares e 22 pacientes com doenças pulmonares não malignos. Mais detalhes desta coorte foram previamente relatada [15]. A coorte de Charité-Universitätsmedizin (CU) incluiu BAL amostras de 25 pacientes com câncer de pulmão e 26 indivíduos de controle. Estes indivíduos controles foram submetidos a broncoscopia para doenças das vias respiratórias não malignas, como infecção, estenose das vias aéreas benigno ou sarcoidose. Não há dados adicionais estavam disponíveis a partir desta coorte. A terceira coorte foi obtida no Hospital Universitário Virgen del Rocio (HUVR) e incluiu fluidos BAL de 60 pacientes com câncer de pulmão e 98 pacientes de controle. As características desses pacientes são apresentados na Tabela 1. A broncoscopia foi necessária em pacientes de controle devido à presença de hemoptise ou uma lesão pulmonar no peito-raio x ou tomografia computadorizada. Finalmente, a Clínica Câncer de Pulmão de Instituto Catalão de Oncologia (LCCCIO) coorte de amostras de expectoração incluiu 68 amostras de pacientes com câncer de pulmão e 10 amostras de indivíduos saudáveis. As amostras foram colhidas depois de expectoração espontânea, diluída em 10 ml de solução salina, extensamente agitadas e armazenadas à temperatura de -80 ° C. Todos os protocolos de estudo foram realizadas de acordo com a Declaração de Helsínquia, foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Navarra (Institutional Review Board # 015-2014), e todos os pacientes deram consentimento informado por escrito. tumores pulmonares foram classificadas usando a classificação da OMS 2004 e o Sistema Internacional de Estadiamento do Câncer de pulmão [18, 19].

medições marcador

C4d contendo fragmentos foram medidos por uma enzimática linked immunosorbent assay (Quidel). Este ensaio reconhece todos os fragmentos de C4d contendo de activado C4 (C4b, iC4b e /ou C4d), que juntos são referidos neste documento como C4d. Os ensaios imunoenzimáticos quantitativos também foram utilizados para as determinações do C4 (Assaypro), C5a (R D) e Cyfra 21-1 (DRG International). amostras de BAL foram diluídos a 1:10, 1: 1000, 1: 100, 1:25 e para a análise de C4d, C4, C5a, e Cyfra 21-1, respectivamente. amostras de escarro foram diluídas 1: 4 para C4d quantificação. A proteína total foi medida utilizando o ensaio de proteína BCA (Pierce). Todas as medições de biomarcadores foram realizados retrospectivamente por profissionais de laboratório não reconhecem o diagnóstico. Todos os procedimentos foram realizados em um único laboratório, seguindo as instruções dos fabricantes.

Análise estatística

o software SPSS 15.0 foi utilizado para análise estatística. A normalidade foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk. Frente e verso teste de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis H foram usados ​​para comparar dados não normalmente distribuídos a partir de dois ou mais grupos, respectivamente. níveis de marcadores são apresentados como mediana (intervalo interquartil). operating characteristic (ROC) do receptor foram gerados, a fim de avaliar o desempenho diagnóstico dos biomarcadores. As diferenças estatísticas entre a área sob a curva ROC e uma área de referência sob a curva ROC de 0,5 foram calculados com um teste z-score. intervalos de noventa e cinco por cento de confiança também foram calculados. Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

níveis de C4d em sobrenadantes LBA de pacientes com câncer de pulmão

Em um estudo anterior verificou-se que os níveis de C4d- contendo fragmentos de degradação do complemento (em conjunto como C4d) foram aumentadas em amostras de LBA de pacientes com câncer de pulmão quando comparadas com amostras de pacientes com doenças pulmonares não-malignas [13]. Resumidamente, os níveis de C4d, mostrado como mediana (gama interquartil), foram de 0,26 (0,11-0,54) ng /ml no grupo de cancro do pulmão e 0,11 (0,11-0,23) ng /ml no grupo de controlo (P 0,001). A área sob a curva de ROC era de 0,73 (IC de 95% = 0,61-0,84; P = 0,002). Esta análise foi realizada em amostras de BAL de uma coorte de pacientes aqui denominada como CUN coorte. As características desses pacientes já foram publicados [15]. No presente estudo, buscou-se validar este resultado usando duas coortes independentes de amostras de LBA: o HUVR e as coortes CU. Neste último grupo, os níveis de C4d em amostras de cancro do pulmão e os controlos foram de 0,19 (0,11-0,84) e 0,11 (0,11-0,13) ig /ml, respectivamente (P 0,001; Fig. 1A). A área sob a curva de ROC era de 0,82 (IC de 95% = 0,71-0,94; P 0,001). Na coorte HUVR, C4d níveis no grupo de cancro foram de 0,18 (0,15-0,26) ug /ml, e no grupo de controlo eram de 0,16 (0,14-0,18) ng /ml (P 0,001; Fig. 1B). A área sob a curva de ROC era de 0,67 (IC de 95% = 0,58-0,76; P 0,001). Nesta coorte, os níveis de C4d tendeu a ser maior em fluidos BAL por câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) pacientes ou ex-fumantes, embora as diferenças não atingiram significância estatística (Tabela 1). De acordo com esta observação, em nosso estudo anterior (CUN coorte) encontramos um aumento significativo de C4d em ex-fumantes no grupo de câncer, e uma tendência para níveis mais elevados de C4d em pacientes com SCLC [13].

a) os níveis de C4d e curva ROC a partir de sobrenadantes de LBA da coorte CU. B) Os níveis de C4d e curva ROC a partir de amostras de LBA da coorte HUVR. Diferenças entre os grupos foram avaliados usando o teste de Mann-Whitney. As áreas sob as curvas ROC (AUC) e seus valores P associados são indicados.

Comparação de desempenho de C4d com outros marcadores moleculares

A fim de avaliar a utilidade de C4d como um biomarcador de diagnóstico em fluidos BAL, comparamos seu desempenho com outros marcadores moleculares de diagnóstico potenciais. Para o efeito, foram medidos os níveis de Cyfra 21-1, C4 e C5a nas coortes CUN, Cu e HUVR. Exceto para Cyfra 21-1 e C5a na coorte CUN, e por C5a na coorte HUVR, os níveis de todos os marcadores foram significativamente aumentados em pacientes com câncer de pulmão (Tabela 2).

A acumulação de proteínas do plasma no interstício do tumor é uma característica comum de tumores sólidos [20]. Na verdade, as proteínas plasmáticas podem ser encontrados nos fluidos de BAL de pacientes com cancro pulmonar [15]. De acordo com esta observação, nas três coortes, os níveis de proteínas totais foram encontrados aumentou em fluidos do LBA de pacientes com câncer de pulmão em comparação com os controles (Tabela 2). Para avaliar a possibilidade de que C4d, Cyfra 21-1, C4, e C5a foram encontrados em amostras de BAL como uma mera consequência do seu extravasamento do sangue, analisamos o enriquecimento destes marcadores em amostras de LBA de pacientes com câncer de pulmão em relação ao sangue, utilizando teor total de proteína de referência (Tabela 3). proporções muito semelhante de C4 foram encontrados em amostras de BAL e no sangue, o que sugere que a presença desta proteína de complemento no microambiente tumoral é devido principalmente ao seu extravasamento. No entanto, Cyfra 21-1, C4d, e C5a mostrou uma proporção significativamente maior nos fluidos de BAL, sugerindo uma produção local destas moléculas dentro do microambiente do tumor.

Um fator que influencia fortemente o desempenho e utilidade de um marcador de diagnóstico é a sua consistência entre as diferentes populações de pacientes. Portanto, em comparação dos níveis dos quatro marcadores moleculares nos três grupos independentes. Como mostrado na Fig. 2, foram observadas diferenças significativas entre os pacientes com câncer de pulmão nas coortes CUN, Cu e HUVR para Cyfra 21-1, C5a, C4, e proteína total (P 0,001, P 0,001, P 0,001 e P = 0,029, respectivamente). Observou-se níveis mais elevados destes marcadores na coorte CUN, embora a razão para esta diferença é incerta. No entanto, os níveis de C4d foram notavelmente semelhantes em toda a três séries, sem diferenças significativas entre eles (p = 0,922). A consistência dos níveis de C4d nos permitiu propor valores de corte C4d com sensibilidade e especificidade satisfatórias nas três coortes. Por exemplo, com um valor de corte de 0,18 ng /ml, a sensibilidade para o diagnóstico de câncer de pulmão foi de 62%, 52% e 53%, com uma especificidade de 73% (odds ratio (OR) = 4,35, 95 % CI = 1,45-13,05, P = 0,009), 100%, e 80% (OR IC = 4,46, 95% = 2,20-9,03, P 0,001) nos grupos CUN, Cu, e HUVR, respectivamente. Quando o agrupamento dos três estudos em conjunto, a sensibilidade foi de 56% ea especificidade foi de 82% (OR = 5,94, 95% CI = 3,45-10,24, P 0,001). Em resumo, podemos concluir que C4d é produzido dentro do microambiente do tumor do pulmão, resultando em um aumento consistente desta molécula em fluidos do LBA de pacientes com câncer de pulmão.

A) C4d (dados da coorte CUN foram publicados anteriormente [ ,,,0],13]). B) Cyfra 21-1. C) C5a. D) C4. E) A proteína total. Os valores de P foram calculados utilizando o teste de Kruskal-Wallis.

Determinação de C4d em sobrenadante do LBA como um adjunto à citologia para o diagnóstico de câncer de pulmão

A seguir, avaliou a capacidade de determinação C4d para melhorar o desempenho do diagnóstico do exame citológico de material broncoscopia, uma técnica com alta especificidade, mas baixa sensibilidade. Para este efeito, foram utilizadas as duas coortes a partir do qual nós tivemos de dados de citologia: CUN e HUVR coortes. Na coorte CUN, exame citológico de amostras de BAL produziu uma especificidade de 100% e uma sensibilidade de 32%. Examinando o valor diagnóstico das informações fornecidas por C4d, descobrimos que este marcador foi significativamente aumentada em ambos os sobrenadantes LBA citologicamente positivos e negativos de pacientes com câncer de pulmão (Fig. 3). Os níveis de C4d no grupo de controlo foram de 0,11 (0,11-0,23) ng /ml e aumentou para 0,33 (0,23-0,5) ig /ml em amostras de citologia positiva (P 0,001), e 0,24 (0,11-0,62) ng /ml em amostras citologicamente negativos (P = 0,018). As áreas sob as curvas ROC foram 0,85 (IC 95% = 0,71-0,98; P 0,001) e 0,67 (IC 95% = ,53-,81; P = 0,033), respectivamente. O desempenho diagnóstico de C4d foi melhor em amostras de LBA citologicamente positivas, embora não foram encontradas diferenças significativas entre os dois grupos (P = 0,187). Este resultado sugere que a determinação de níveis de C4d pode ser útil, mesmo nos casos em que o exame citológico de fluidos BAL é avaliado como negativo. Na verdade, usando o valor de corte previamente estabelecido (0,18 mg /ml), 18 dos 34 cânceres de pulmão relatados como negativo pelo exame citológico foram classificados como positivos por determinação C4d, aumentando a sensibilidade para o diagnóstico de câncer de pulmão de 32% a 68%, com uma especificidade de 73%. Esta observação foi validado com a análise da coorte HUVR. exame citológico neste coorte proporcionou uma sensibilidade de 32% e uma especificidade de 100%. O conteúdo do C4d na BAL sobrenadantes aumentou significativamente em ambos os sobrenadantes citologicamente positivas e negativas LBA cancro do pulmão, quando comparados com indivíduos de controlo (Fig. 4). C4d níveis no grupo de controlo eram de 0,16 (0,14-0,18) ng /ml, e aumentou para 0,22 (0,16-0,40) ig /ml em amostras de citologia positiva (P 0,001), e a 0,18 (0,15-0,23) ig /ml em amostras citologicamente negativo (p = 0,017). As áreas sob as curvas ROC de 0,76 (IC 95% = 0,63-0,88; P 0,001) e 0,63 (IC 95% = 0,52-0,74; P = 0,011), respectivamente. Não foram observadas diferenças significativas nos níveis de C4d entre amostras de LBA citologicamente positivas e negativas (P = 0,123). Com um valor de corte de 0,18 ng /ml, 19 dos 41 cânceres relatados como negativo pela citologia foram classificadas como positivas por C4d, aumentando a sensibilidade para o diagnóstico de câncer de pulmão de 32% para 63%, com uma especificidade de 80 %.

os valores de P foram calculados utilizando o teste de Mann-Whitney. As áreas sob as curvas ROC (AUC) e seus valores P associados são indicados.

Os valores de P foram calculados utilizando o teste de Mann-Whitney. As áreas sob as curvas ROC (AUC) e seus valores P associados são indicados.

níveis de C4d em sobrenadantes de escarro de pacientes com câncer de pulmão

O diagnóstico de câncer de pulmão pelo exame de escarro é uma alternativa atraente à broncoscopia. A fim de avaliar a utilidade preliminar de C4d como um marcador de diagnóstico biológico nesse modelo, os níveis de C4d foram determinados em amostras de expectoração espontâneas de pacientes com cancro do pulmão (n = 68) a partir da coorte LCCCIO. C4d níveis variaram de 0,04 a 0,56 ug /ml, com uma mediana (IQR) de 0,06 (0,06-0,07) ng /ml. Não foram encontradas associações significativas entre os níveis do marcador e dados clínico-patológicos, como sexo, tabagismo, histologia (NSCLC vs. SCLC) ou estágio (I-III vs. IV). Finalmente, foram comparados os níveis de C4d nestas amostras de escarro com os níveis em 10 controles saudáveis. Como mostrado na Fig. 5, os níveis de C4d foram ligeiramente maiores em sobrenadantes de escarro de pacientes com câncer de pulmão do que naqueles de sujeitos de controlo (p = 0,047). A área sob a curva de ROC era de 0,7 (IC 95% = 0,56-0,83, P = 0,047). Com um 0,06 ug /ml de corte, a sensibilidade e a especificidade foram de 54% e 80%, respectivamente. Em conclusão, os níveis de C4d são significativamente mais elevados em amostras de escarro espontâneo de pacientes com câncer de pulmão do que nas amostras de indivíduos sem câncer.

Os valores de P foram calculados utilizando o teste de Mann-Whitney. A área sob a curva ROC (AUC) e seu valor P associado são indicados.

Discussão

Neste estudo, demonstramos que C4d contendo fragmentos de degradação do complemento (em conjunto como C4d) são elevados em fluidos brônquica de pacientes com câncer de pulmão e sua determinação desempenho melhor do que os biomarcadores de proteínas anteriormente propostos para diagnóstico de câncer de pulmão. Nossas conclusões são apoiados por quatro grandes observações: i) que tenham validado, em duas coortes independentes, o aumento do C4d observados anteriormente em uma coorte de amostras de LBA de pacientes com câncer de pulmão [13]; ii) não foram observadas diferenças nos níveis do marcador através de amostras de LBA de pacientes com cancro do pulmão de três coortes independentes; iii) C4d quantificação melhorou a sensibilidade do exame citológico de fluidos do LBA; e iv) os níveis de C4d foram ligeiramente aumentada em sobrenadantes de escarro de pacientes com câncer de pulmão.

Até agora, os esforços para identificar marcadores de diagnóstico clinicamente valiosas para o cancro do pulmão, quer falharam ou tiveram sucesso limitado. Isto pode ser explicado em parte pelo baixo grau de reprodutibilidade entre estudos independentes, devido à grande heterogeneidade genética e fenotípica dos tumores pulmonares [21]. Para superar esta limitação, foi sugerido que os marcadores imuno-relacionadas podem ser mais homogénea e sensível do que os marcadores de cancro derivado de [22]. Neste sentido, durante a transformação neoplásica, células de tumor de pulmão de diferentes subtipos histológicos pode ser reconhecido pelo sistema do complemento [17], [23, 24]. Complemento é uma parte importante da resposta imune inata que defende o hospedeiro contra elementos não-eu. Curiosamente, devido à expressão elevada de inibidores do complemento, células de cancro do pulmão controlar a activação do complemento e citotoxicidade são resistentes a [23, 24, 25, 26, 27] mediada pelo complemento. Esta resposta imune controlada pode resultar numa libertação permanente de fragmentos de complemento para o microambiente do tumor, o que explicaria porque C4d, um fragmento originado a partir do complemento C4, é aumentada em fluidos biológicos de pacientes com cancro do pulmão [13]. Curiosamente, observou-se concentrações notavelmente semelhantes de C4d em toda amostras de LBA a partir dos três grupos estudados. Este é um ponto relevante, uma vez que a padronização das medidas entre os diferentes estudos é um grande problema na descoberta de biomarcadores [28, 29]. Em relação à fonte primária de C4d, esta molécula é um fragmento proteolítico de complemento C4 gerado após activação da via clássica do complemento [16]. Assim, a explicação mais plausível para a sua presença dentro do microambiente do tumor seria sua produção local após a activação desta via canonical. No entanto, não podemos excluir outros mecanismos. Por exemplo, exoproteases presentes nos fluidos biológicos de pacientes com cancro pode gerar péptidos de proteínas do complemento [30]. Por outro lado, embora os níveis de C4d também são aumentadas no plasma de doentes com cancro do pulmão [13], os níveis do marcador em fluidos brônquica são sensivelmente mais elevado do que os esperados por extravasamento, o que favorece a origem local de C4d.

Nós também descobrimos que C4d desempenho melhor do que outros marcadores relacionados com o complemento, C4 e C5a, ou o marcador de tumor proposta Cyfra 21-1. No caso de C4, a molécula precursora de C4d, conclui-se que a sua presença nos fluidos das vias respiratórias é principalmente devido ao seu extravasamento do sangue. Do mesmo modo, o aumento dos níveis de outras proteínas do plasma extravasados, tais como o factor H do complemento ou albumina, foram anteriormente observados em fluidos brônquica de pacientes com cancro pulmonar [15]. Por outro lado, os nossos dados sugerem uma produção local de C5a, um anafilotoxina que pode ser produzida por células de cancro do pulmão [17]. No entanto, este marcador foi encontrado um aumento significativo em amostras de BAL de pacientes com cancro do pulmão em apenas um dos três grupos. Resultados semelhantes foram observados com Cyfra 21-1, um dos biomarcadores de câncer de pulmão mais estudados na literatura [7, 14]. Os nossos dados sugerem uma produção local de Cyfra 21-1 dentro do microambiente do tumor, mas os seus níveis em toda a coortes foram mal consistente e diferenças entre amostras malignas e não-malignas não foram encontradas em uma das séries. Estas observações sugerem que a C5a e Cyfra 21-1 são produzidos na presença de tumores nos pulmões, mas também na presença de condições inflamatórias não malignas comuns aos pacientes submetidos a broncoscopia.

Devido à sensibilidade relativamente baixa do citológico exame de espécimes broncoscopia, testes diagnósticos mais invasivos são geralmente necessários. Neste contexto, um procedimento de diagnóstico útil para determinar quais pacientes com cancro do pulmão suspeita, mas broncoscopias negativas, devem ser submetidos a testes de diagnóstico adicional seria clinicamente relevante. Neste estudo, a adição de C4d quantificação para o procedimento de diagnóstico aumentou a sensibilidade de broncoscopia, embora a sua especificidade reduzida. A redução na especificidade pode limitar a sua adoção como uma ferramenta de diagnóstico clínico de rotina. No entanto, a consistência do marcador através coortes independentes de amostras de fluidos dos brônquios e do seu melhor desempenho do que os biomarcadores anteriormente propostos favorecer a integração de C4d em um painel de biomarcadores para complementar citologia no diagnóstico da doença. Este é um ponto importante, pois novos painéis de biomarcadores tais como auto-anticorpos, microRNAs ou classificadores proteômicas produziram resultados promissores em amostras de sangue de coortes clínicos de câncer de pulmão [31, 32, 33]. Além disso, os nossos dados sugerem que a avaliação de C4d em amostras de expectoração não invasivas podem também ser uma ferramenta útil para o diagnóstico do cancro do pulmão. Esta observação, baseada em um pequeno grupo de amostras de escarro, merece uma avaliação mais aprofundada em série maiores, usando controles relevantes clinicamente mais com doença pulmonar não maligno. Outros aspectos que necessitam de ser clarificada é o desempenho do ensaio nos diferentes subtipos histológicos, bem como a influência de fumar, e condições respiratórias não malignas específicas e os tratamentos nos níveis de C4d. Neste momento, podemos concluir que os níveis de C4d são consistentemente aumentou em fluidos brônquica de pacientes com cancro do pulmão e podem complementar a citologia no diagnóstico da doença.

Reconhecimentos

Agradecemos Amaya Lavin, usua Montes e Ana Remírez de assistência técnica.