Abstract
Fundo
Reconhecendo EGFR como orquestrador chave do processo metastático em câncer colorretal, mas também a heterogeneidade das respostas à terapia anti-EGFR, examinou-se o padrão de actividades de quinase tumorais compostos regulados pela sinalização mediada pelo EGFR que pode estar implicado no desenvolvimento da doença metastática.
pacientes e Métodos
As mutações pontuais em
KRAS
,
BRAF
, e
PIK3CA
e
ERBB2
amplificação foram determinados em tumores primários de 63 pacientes com localmente avançado câncer retal agendada para o tratamento radical. O uso de matrizes de peptídeos com substratos de tirosina-quinase,
ex vivo
perfis fosfopeptídeo foram gerados a partir das mesmas amostras de tumor de base e correlacionada com sobrevida livre de metástases.
Resultados
análise de agrupamento não supervisionado da fosforilação resultante de 102 substratos de matriz definida duas classes de tumores, tanto que consiste em casos com e sem
KRAS /BRAF
mutações. O grupo de cluster menor de pacientes com tumores que geram alta
ex vivo
fosforilação de fosfatidilinositol 3-quinase relacionada substratos, tinha um curso da doença particularmente agressiva, com quase metade dos pacientes que desenvolvem a doença metastática dentro de um ano follow-up.
Conclusão
High fosfatidilinositol-3-quinase mediada por atividade de sinalização do tumor primário, em vez de
KRAS /BRAF
estado de mutação, foi identificado como um marca de sobrevivência pobres livre de metástases em pacientes com cancro rectal localmente avançado em tratamento radical da cavidade pélvica
Citation:. Ree AH, Kristensen AT, Saelen MG, de Wijn R, Edvardsen H, Jovanovic J, et ai. (2012) Tumor fosfatidilinositol-3-quinase Sinalização e Desenvolvimento de doença metastática em Localmente cancro retal Avançado. PLoS ONE 7 (11): e50806. doi: 10.1371 /journal.pone.0050806
editor: Ming Tan, University of South Alabama, Estados Unidos da América
Recebido: 29 de agosto de 2012; Aceite: 25 de outubro de 2012; Publicado: November 30, 2012 |
Direitos de autor: © 2012 Ree et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Universidade Akershus Hospital Grant 2010-003 (a AHR), a União Europeia 7º Programa-Quadro Grant 222741-METOXIA (a AHR e KF), a Sociedade norueguesa Câncer (para KF), e uma generosa doação de paciente (cerca de 10.000 USD ) em apoio a esta actividade específica de investigação (a AHR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e ter o seguinte conflito: RDW é PamGene Internacional BV empregado. Os outros autores declararam que não existem interesses conflitantes. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
A multidão de mais de 500 proteínas quinases, o kinome, representa uma parte substancial do o genoma humano, e o receptor de tirosina-quinases são mediadores chave na cascata de sinalização que regulam processos biológicos centrais de malignidade, tais como a proliferação, a angiogénese, metástase e [1], [2]. A fim de otimizar e individualizar eficácia terapêutica da quinase agentes para o controle da doença metastática inibição, parece racional para explorar o padrão específico de actividade tumoral quinase biomarcador tão funcional de metas acionáveis.
No cancro rectal localmente avançado (LARC) , estudos randomizados têm destacado o papel central da quimioradioterapia (CRT) em conjunto com a ressecção cirúrgica para erradicar tumor dentro da cavidade pélvica e melhorar resultados a longo prazo [3]. No entanto, mesmo com tratamento local bem sucedida, um número substancial de pacientes irão desenvolver doença metastática precoce como resultado da difusão, não detectado sistémica de células tumorais. Dentro deste quadro de referência, o nosso estudo não randomizado, prospectivo compreendendo pacientes LARC dadas CRT seguida de cirurgia radical e nenhum tratamento adicional oferece uma oportunidade única para explorar o papel regulador das vias específicas quinase sinalização em proliferação tumoral, angiogênese e metástase em um definida contexto clínico. Neste estudo, utilizando matrizes de peptídeos com substratos de tirosina-quinase [4] – [6] para analisar tumores dos pacientes no momento do diagnóstico, nós descobrimos que os pacientes com resposta CRT pobres tiveram atividade da quinase do tumor significativamente elevada, representando sinalização mediada por VEGFR, EGFR, e fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) /AKT, em comparação com pacientes respondendo boas-[7]. Além disso, têm relatado que tumorais assinaturas angiogénicos que compreende PDGFR, VEGFR, e R-EPO foram associados com disseminação microscópica de células tumorais na medula óssea, no momento do diagnóstico, o que por outro lado foi correlacionada com um risco elevado de desenvolver doença metastática seguindo o curso do tratamento radical da cavidade pélvica [8].
no cancro colorectal metastático, os anticorpos monoclonais dirigidos contra o EGFR, atualmente cetuximab e panitumumab, foram implementadas na prática clínica durante os últimos oito anos. Para a seleção ideal de pacientes elegíveis, dados moleculares iniciais mutações de genes que codificam proteínas efetoras a jusante de EGFR no tumor cascata, principalmente mutações no códon 12 ou 13 da
KRAS
, como preditor de resistência terapêutica intrínseco à sinalização estabelecida anticorpos monoclonais anti-EGFR [9]. Além disso, mutações em genes que codificam outros mediadores, principalmente
BRAF
p.V600E mas também
PIK3CA
mutações, estão associados com a resistência [9], enquanto os tumores abrigando
KRAS
p .G13D podem responder [10], [11]. Recentemente, foi sugerido que a amplificação do
ERBB2
compreende um outro mecanismo de resistência [12], [13], e que a resistência adquirida é conferida pela mutação do
EGFR
si [14] ou resultados de expansão de subclones tumorais com mutado ou amplificada
KRAS
[15], [16]. Além de sinalização através da via de
KRAS /BRAF
codificado pelo efectores, EGFR em paralelo activa a sinalização através de uma interacção de múltiplos passos de moléculas mensageiras com efectores [17] mediada por PI3K, [18]. Apesar de todos os conhecimentos acima, no entanto, de resposta objectiva para a terapia com anticorpos anti-EGFR em cancro colo-rectal metastático é obtido, no melhor dos casos, em não mais de metade dos pacientes sem aberrações tumorais na rede de sinalização de EGFR que são actualmente testados na prática de rotina [ ,,,0],9], [19], [20].
hipótese de que quinase sinalizando actividade desenvolvida pelo EGFR pode refletir estado de mutação de genes que codificam proteínas efetoras de qualquer componente da rede molecular, comparamos a anteriormente alcançada
ex vivo
perfis fosfopeptídeo tumor dos pacientes do estudo LARC [7] [8], com mutações de tumor dentro
KRAS
exão 2,
BRAF
exão 15, e
PIK3CA
exons 9 e 20, e amplificação de
ERBB2
. Conceitualmente, assinaturas de atividade tumor quinase compreendendo todas as vias de sinalização que interagem de relevância pode ser desenvolvido em biomarcadores funcionais de alvos de terapia acionáveis para o controle da doença metastática. As investigações neste estudo definido um subgrupo de pacientes LARC, após a ressecção dos tumores primários com elevada actividade da via de sinalização de PI3K, particularmente com a sobrevivência pobre livre de metástases. Esta constatação sugere que a atividade de sinalização mediada por PI3K alta tumor é um biomarcador da avaliação de risco e estratificação tratamento.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
A fase II, não protocolo do estudo randomizado (ClinicalTrials ID NCT00278694) foi aprovado pelo Conselho de revisão Institucional e do Comité Regional para Médicos e de Saúde de Ética em Pesquisa do Sudeste da Noruega, e está em conformidade com a Declaração de Helsinki. consentimento informado por escrito foi necessária para a participação.
Pacientes e Procedimentos
A população paciente do caso foi registrado entre outubro de 2005 e maio de 2008. Os critérios de elegibilidade do paciente, procedimentos de avaliação, tratamento do estudo e procedimentos de revisão de seguimento foram descritos em detalhe anteriormente [7]. Seguindo CRT neoadjuvante fluoropirimidina /à base de oxaliplatina e posterior cirurgia, os espécimes de tumores primários ressecados foram histologicamente avaliadas para a resposta ao tratamento de acordo com critérios padrão (histopatológico de paragem; ypTN) e grau de regressão do tumor histomorfológica (TRG). Resumidamente, este último foi classificada dentro de uma das cinco categorias TRG, que vai desde a ausência de células de tumor residuais no material ressecado (TRG1) para a falta de sinais morfológicos de resposta ao tratamento (TRG5) [21]. dados de acompanhamento foi obtido a partir da base de dados clínicos e censurado em 31 de dezembro de 2011. As observações válidos da presença ou ausência de metástases à distância exigidos exame radiológico designado. Quatro pacientes com metástases hepáticas ressecáveis síncronas foram excluídos da análise da sobrevida livre de metástase.
amostras de tumores
No momento do diagnóstico, da linha de base biópsias de tumores primários específicos de estudo foram obtidos de 79 pacientes com cancro rectal localmente avançado sob sedação pesada, congelado em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C, conforme relatado anteriormente [7]. Dos pacientes incluídos, 16 pacientes foram excluídos do estudo, com 12 pacientes tiveram amostras de biópsia de tumor em que a atividade quinase profiling não tinham sido realizados porque os pacientes eram ou não elegível após o registo de estudo (
n
= 4) , tinha retirado o consentimento (
n
= 1), tinha inesperadamente morreram durante o tratamento pré-operatório (
n
= 1), tinha desenvolvido a progressão da doença metastática durante o tratamento pré-operatório, que impediu a cirurgia definitiva (
n
= 1), teve conteúdo da célula tumoral menos de 20% dentro dos biópsia (
n
= 3), ou uma biópsia espécime em que a análise de atividade quinase estava faltando de razões desconhecidas (
N
= 2), e quatro pacientes adicionais não têm o ADN isolado do tumor porque nenhum material de biópsia manteve-se para o efeito. Assim, perfis de actividade tumor quinase baseados em dados phosphosubstrate matriz anterior foram identificados com sucesso por 63 pacientes que tiveram seu tumor
KRAS /BRAF /PIK3CA /ERBB2
estado de mutação determinado, e isso população do estudo estava presente nas análises atuais.
gene do tumor análises de mutação
KRAS
,
BRAF
, e
PIK3CA
sequências alvo foram amplificados por reação em cadeia da polimerase e substituições de bases foram detectados por desnaturante, ciclismo de electroforese capilar da temperatura [22], [23], de acordo com a Tabela S1.
ERBB2
amplificação foi analisado utilizando o ensaio TaqMan ® Copiar Número (Applied Biosystems, Oslo, Noruega) protocolo [24] e calibrado em relação ao ADN correspondente de cada paciente individual isolado a partir de células mononucleares do sangue periférico. As amostras de DNA do tumor com quantificação relativa valores superiores a 5 foram considerados amplificado para garantir pontuação focal de alto grau
ERBB2
amplificação apenas, omitindo polissomia de baixo grau do cromossomo 17.
tumor Kinase Atividade Profiling
Preparação de lisatos de amostra de tumor e a análise multiplex de actividade de quinase do tumor usando matrizes péptido com substratos de tirosina-quinase (tirosina-quinase PamChip96 matriz; PamGene International BV, ‘s-Hertogenbosch, Holanda) foram descritos em detalhe previamente [7 ]. O teor médio de célula de tumor nas biópsias foi de 46%, e não houve diferença entre os tumores com o tipo selvagem e mutante
KRAS /BRAF
(
P Art 0,67; duas amostragens
t
-teste). Quatro repetições técnicas foram analisados a partir de cada amostra de paciente para gerar
ex vivo
perfis phosphosubstrate.
Adaptação da matriz de dados
visualização e tratamento de dados de matriz anteriormente alcançados Dados (adesão ArrayExpress número de E-TABM-913), conforme relatado anteriormente [7], foram realizadas utilizando BioNavigator versão 5.10.70 (PamGene International BV). Os tumores foram divididos em dois grupos; Do tipo selvagem e mutante
/BRAF
KRAS (36 e 27 amostras, respectivamente). Os dados sobre a fosforilação péptido matriz, após a conversão de intensidades de sinal de matriz, foi log-transformados após tratamento de um pequeno número de pontos de dados negativos subtraindo o percentil 1% do total do conjunto de dados e, subsequentemente, definindo todos os pontos de dados restantes com valor inferior a 1 para o valor 1. Esta abordagem foi escolhida adaptação de equilibrar o número de pontos de dados que foi definido para o valor de 1 e a extensão de movimento ascendente colectiva de todo o conjunto de dados. Correcção de variação placa-a-placa foi alcançado através da normalização da intensidade de sinal do substrato para a intensidade média do sinal de todos os tumores do tipo selvagem nas respectivas placas com a seguinte fórmula: N
PSM = log
2 (S
PSM) – log
2 (G
pm), onde N
PSM é o sinal normalizado para substrato p da amostra s na placa m, s
PSM é o sinal não normalizado correspondente, e G
pm é o sinal médio de tumores do tipo selvagem de substrato p na placa. Phosphosubstrates com um sinal da amostra da média inferior a 10 foram excluídos, deixando 102 péptidos para posterior análise (Tabela S2).
Análise estatística
Com base nos valores de sinal de estes resultantes 102 fosfopéptidos de matriz, análise sem supervisão foi realizada aplicando análise de componentes principais e
k
-means clustering, com 10 Monte Carlo repetições, utilizando as funções padrão fornecidas no Matlab Statistics Toolbox (Matlab R2010A; Mathworks, Natick, MA, EUA). Binary supervisionado análise de classificação foi realizada utilizando parciais mínimos quadrados análise discriminante em Matlab R2010A, essencialmente como descrito anteriormente [7]. Desempenho de partição classe com relação ao estado de mutação do tumor foi avaliada por validação cruzada de 20 vezes. Distribuição de parâmetros entre pacientes com tumores abrigando características moleculares diferenciais foi comparado pelo teste exato de Fisher para dados categóricos e de duas amostras
t
-teste para variáveis contínuas. -Rank log teste foi aplicado para calcular qualquer diferença na sobrevida livre de metástases entre os subgrupos de pacientes. A análise dos dados foi realizada usando SPSS Predictive Analytics Software (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).
P
-Valores inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Resultados
Mutações tumorais
As mutações pontuais em
KRAS
,
BRAF
, e
PIK3CA
e amplificação de
ERBB2
foram detectados em 35%, 6,3%, 9,5% e 3,2% dos tumores primários de 63 casos LARC, respectivamente (Tabela 1); na maior parte, um único aberração gene foi encontrado. Quatro tumores abrigavam
BRAF
mutação, quer p.D594G ou p.V600E, como uma aberração solitária. Em seis tumores,
PIK3CA
mutações foram encontradas; em dois dos casos,
KRAS
foi também mutado. Apenas duas amostras, ambos sem outras mutações detectadas, apresentou amplificado
ERBB2
(em virtude de tumor maior do que 5 vezes
ERBB2
nível em relação ao nível de ADN normal correspondente do paciente). Não foram observadas diferenças entre os doentes portadores do
KRAS /BRAF
de tipo selvagem e tumores mutantes sobre estágio radiológico TNM no momento do diagnóstico, o estágio ypTN histopatológico ou pontuação TRG histomorfológica dos espécimes cirúrgicos seguinte CRT, o desenvolvimento de doença metastática no seguimento médio -up de 53 meses (intervalo 7-70), ou a idade (Tabela S3).
tumor Kinase Atividade perfis
Ex vivo perfis de actividade
tumor quinase foram obtidos a partir de substratos de matriz 102 que tinham intensidades de sinal acima do limite definido (Tabela S2), com os níveis de fosforilação relativas variadas dentro de um registo
2 gama de -1,0 a 1,0. Com base nos perfis phosphosubstrate gerados, um modelo de partição de classe binário discriminado corretamente entre tumor
KRAS /BRAF
de tipo selvagem e de mutação de estado em 67% dos casos. Nenhuma melhoria na precisão da partição classe foi alcançado sobre a inclusão de qualquer um
PIK3CA
ou
ERBB2
aberrações como camadas adicionais de informações para o grupo de amostras de tumores com mutações genéticas.
a Figura 1 mostra o gráfico pontuação resultante da análise de componentes principais do conjunto de dados de 102 substratos fosfopeptídeo; cada mancha representa uma das 63 amostras em um principal componente espaço tridimensional. Na inspecção do terreno pontuação, um único tumor (triângulos fechados) foi observado como um outlier claro para a distribuição de amostras ao longo do primeiro componente principal, e por outro lado, as amostras restantes parecia separar-se em dois grupos, tanto consistindo de um relativamente equilibrada número de
KRAS /BRAF
de tipo selvagem e tumores mutantes. Posteriormente, utilizando as notas dos três componentes principais como entrada e excluindo o tumor outlier de uma análise mais aprofundada,
k
-means agrupamento foi aplicada a fim de obter dois grupos distintos de amostras, atribuindo, assim, quaisquer casos limite em qualquer dos dois. Resultante deste procedimento, 15 de 62 amostras (24%), dos quais 11 (69% dos 15) foram
KRAS /BRAF
casos do tipo selvagem, agrupados no grupo menor (Cluster-Grupo 2; círculos fechados). Embora o maior conjunto de 47 amostras (cluster-group 1; quadrados abertos) consistiu de 26 (55%)
KRAS /BRAF
do tipo selvagem tumores,
KRAS /BRAF
de tipo selvagem e casos mutados foram igualmente distribuídos dentro dos dois clusters de tumor (
P
= 0,17).
análise de agrupamento não supervisionado dos níveis de fosforilação do substrato da quinase gerados por tumores de 63 pacientes. Distribuição das amostras individuais de
KRAS /BRAF
do tipo selvagem (vermelho) e tumores mutantes (azul) é visualizada utilizando os escores dos três primeiros componentes em uma análise de componentes principais (PC1-3) do intervalo dos níveis de fosforilação de 102
ex vivo
substratos quinase.
k
-means agrupamento foi usado para obter dois grupos de amostras de tumores, indicado por quadrados brancos (Cluster-Grupo 1) e círculos fechados (Cluster-Grupo 2), respectivamente. O triângulo fechado representa um único outlier para a distribuição de amostras ao longo PC1, conforme elaborado em resultados.
Na Figura 2, usando os grupos resultantes da análise de agrupamento não supervisionado, amostras de tumor (eixo horizontal) e peptídeos (eixo vertical), foram ordenados ao longo de uma linha que liga as duas centroids de cluster de acordo com a sua projecção e peso na mudança de sinal, respectivamente, ilustrando que se aglomeram-Grupo 2 tumores gerados
ex vivo
níveis de fosforilação de substrato mais elevadas do que as amostras de agrupamentos Grupo 1 para todos os 102 péptidos. A ordem dos substratos peptídicos com respeito a como a sua diferença em níveis de fosforilação através das amostras tumorais distinguiu entre os dois grupos de cluster,
isto é, o perfil
discriminar a actividade de quinase do tumor, é apresentado na Tabela 2. Interessantemente, as diferenças na fosforilação de substratos relacionados com factores dependentes de PI3K (um PIK3R1, três CTTN1, um PLCG1, dois PDPK1, e uma péptidos RASA1) contribuíram mais fortemente para a discriminação de grupos de fragmentação, uma vez que, essencialmente, foram encontrados na metade superior da lista , que phosphosubstrates relacionadas com a sinalização mediada pelo
KRAS /BRAF
via efetora codificado pelo (um RAF1 e quatro MAPK isoformas peptídeos). Um dos peptídeos matriz três EGFR foi encontrado entre phosphosubstrates fortemente estabelecendo uma distinção entre os dois grupos de cluster.
Uma linha imaginária foi traçada entre o determinado centróide de cada paciente Cluster-Grupo 1 e Cluster-Grupo 2 (representado na Figura 1), e as amostras 63 de tumor (eixo horizontal; marcadas por mutações do gene conforme especificado) e 102 phosphosubstrates (eixo vertical), foram ordenados ao longo desta linha de acordo com a projecção e o peso na diferença de sinal, respectivamente. O vermelho corresponde ao maior e azul para níveis inferiores a fosforilação do substrato. As setas indicam péptidos que representam factores de matriz de vias de sinalização dirigida-EGFR, tal como indicado, e a identidade de cada substrato péptido, a fim de cima para baixo da figura, é dada na Tabela 2. Nesta análise, o único valor extremo para a distribuição de amostras, como se explica nos resultados, ordenada esquerda do Cluster-Grupo 1 no calor-map.
a Tabela 3 resume tumorais e tratamento características dos 62 pacientes incluídos em qualquer Cluster-Group 1 ou Cluster-Grupo 2. Mais uma vez, não foram observadas diferenças entre os grupos de cluster sobre o estágio TNM, estágio ypTN, ou pontuação TRG. sobrevida livre de metástases foi avaliada em 58 pacientes, como os quatro pacientes com metástases hepáticas síncronas foram omitidos a partir desta análise, com Cluster-Grupo 2 demonstrando pior sobrevida livre de metástases de Cluster-Grupo 1 (
P = 0,011
; Figura 3). De particular interesse, enquanto um quinto dos pacientes no Cluster-Grupo 1 desenvolveram doença metastática ao longo de um período de acompanhamento de 36 meses, os pacientes no Cluster-Grupo 2 parecia ter uma doença muito mais agressiva, como quase a metade tinha sido diagnosticado com metástases por menos de um ano de follow-up.
Este parâmetro desfecho foi analisado em 58 pacientes em função da baixa (Cluster-Grupo 1) ou alta (Cluster-Grupo 2)
ex vivo
atividade fosforilação do substrato do tumor primário.
Separadamente, quando se compara
KRAS /BRAF
tumores do tipo selvagem como um grupo inteiro com todo o grupo de tumores abrigar tais mutações, as amostras sem mutações geradas significativamente maior fosforilação de 11 dos 102 peptídeos matriz que constituem os perfis de actividade da tirosina quinase (
P
gama -valor 0,0034-,049). Na Figura 4, as amostras dentro de cada um desses dois grupos tumorais são organizados horizontalmente, a fim de baixa a níveis elevados fosfopeptídeo, para visualizar a percentagem mais elevada de
tumores KRAS /BRAF
do tipo selvagem que produziu maior do que a fosforilação significa níveis para os 11 substratos (18 de 36 amostras) do que tumores com mutantes
KRAS /BRAF
desempenho correspondente (6 de 27 amostras;
P
= 0,036). A maioria dos phosphosubstrates discriminantes foi considerada para representar factores de sinalização que são interligados com a via mediada pela EGFR. Dentro de todo o painel 102-péptido, foram identificadas seis péptidos que representam membros da família de EGFR de tirosina-quinases de receptor (EGFR três, dois erbB2, e erbB4 um) (Tabela S2). Embora nenhum dos peptídeos de matriz de três EGFR foi encontrado entre phosphosubstrates distinguem tumor
KRAS /BRAF
estado de mutação ao nível do grupo, todos os três peptídeos que representam ErbB2 e ErbB4 estavam entre os substratos exigentes.
as amostras tumorais 63 são ordenados ao longo do eixo horizontal, anotado por tipo selvagem ou mutado
KRAS /BRAF
e marcado para outras mutações genéticas como especificado, enquanto os 11 discriminando substratos quinase (
P
gama -valor ,0034-0,049 na comparação de
KRAS /BRAF
tumores do tipo selvagem como um grupo inteiro com todo o grupo de tumores que abrigam tais mutações) são retratados ao longo do eixo vertical. Para cada substrato péptido, posição do (s) sítio (s) de fosforilação de tirosina dentro da proteína está indicado. Red corresponde a mais elevada e azul para níveis de fosforilação de substrato inferiores.
Discussão
A descoberta essencial deste estudo foi que a alta
ex vivo
fosforilação de PI3K relacionada- substratos pelo tumor primário, em vez do
KRAS /BRAF
estado de mutação, pode ser uma indicação de baixa sobrevida livre de metástases em pacientes LARC após o tratamento radical da cavidade pélvica. Este subgrupo específico de pacientes do estudo tinham o desenvolvimento da doença agressiva, com uma fração substancial de pacientes diagnosticados com doença metastática em menos de um ano de follow-up.
Enquanto o tratamento multimodal contemporânea do LARC levou a uma melhoria significativa da controle de doenças local, desenvolvimento da doença metastática ainda é um grande desafio [3]. Atualmente, não existe consenso sobre se a terapia sistêmica pode reduzir o risco de desenvolvimento de metástases em pacientes com câncer retal [25], o que em parte pode ser explicado pela escassez de biomarcadores para avaliação de risco e estratificação tratamento. No grupo de doentes analisado aqui, já anteriormente demonstrado que a presença de células tumorais disseminadas na medula óssea, no momento do diagnóstico correlacionados com o desenvolvimento da doença metastática evidente [8]. A questão de saber se tumor
KRAS /BRAF
estado de mutação pode ser um biomarcador confiável para fins de selecção dos pacientes de alto risco à terapia anti-EGFR, no entanto, permanece indefinida. Apesar de evidências convincentes de eficácia na doença metastática a partir do tipo selvagem
KRAS /tumores colorretais BRAF
[9], incluindo a descoberta de uma elevada percentagem de ressecabilidade de metástases hepáticas após a terapia sistémica à base de cetuximab [26], o adição de cetuximab à quimioterapia padrão em pacientes com o tipo selvagem
KRAS
cancro do cólon não conseguiu cumprir o ponto final da sobrevida livre de doença prolongada em um estudo randomizado recentemente concluído no cenário adjuvante [27]. Um estudo semelhante para o cancro rectal ressecado não foi feito.
No presente estudo, a análise de classificação supervisionada binário do
ex vivo
perfis fosfopeptídeo -generated discriminados corretamente entre tumor
KRAS /BRAF
de tipo selvagem e mutados amostras em dois terços dos casos. Porque esta manipulação de dados em particular foi realizada para permitir a detecção de pequenas diferenças entre os dois grupos a ser comparados, não totalmente comparar com o resultado da análise sem supervisão de todo o painel 102-phosphosubstrate. No último caso, duas populações tumorais alternativos fenotípicas apareceu; um menor, que compreende um quarto de toda a coorte, e um conjunto maior de tumores, tanto que consiste de amostras com e sem
KRAS /BRAF
mutações com distribuição semelhante nos dois grupos tumorais. No cancro colorectal metastático, resposta objetiva à terapia anticorpo anti-EGFR pode ser esperado em um terço dos pacientes não selecionados e, inversamente, tumor
KRAS
mutações podem ser encontrados em quase um terço dos que responderam [19]. A nossa observação de que
KRAS /BRAF
de tipo selvagem e tumores mutantes tinham perfis de actividade quinase sobreposição é consistente com o crescente reconhecimento da heterogeneidade do tumor, que se reflecte no estado de mutação díspares, como determinante da variável resposta à terapia anticorpo anti-EGFR .
de pré-aviso, pacientes do estudo demonstram atividade de sinalização mediada por PI3K alta tumor, como todos os substratos de matriz desta via específica (PIK3R1, CTTN1, PLCG1, PDPK1 e RASA1) foram altamente fosforilada, teve metastasis- particularmente pobre sobrevida livre após o tratamento radical da cavidade pélvica. O complexo de PI3K é constituída por uma subunidade reguladora, existente em várias isoformas (PIK3R1 e CTTN1), e uma subunidade catalítica codificada por
PIK3CA
. Na fosforilação da subunidade reguladora por tirosina-quinases receptoras ou a proteína G (receptores) RASA1 -coupled, a subunidade catalítica é activado para gerar fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato, o qual activa a proteína cinase de 3-fosfoinositida-1 dependente de (PDPK1) e subsequentemente AKT e o alvo de mamífero a jusante da rapamicina (mTOR). Além disso, a fosfodiesterase 1-fosfatidilinositol-4,5-bifosfato gama-1 (PLCG1) é crucial para a geração de moléculas de activação de segundos mensageiros na, via de sinalização mediada por PIK3 dirigida-EGFR [17], [18]. No contexto das nossas observações, mesmo sem provas válidas no momento, é tentador especular que os pacientes LARC pode ser elegível para a terapia adjuvante sistêmica com base nessa característica biológica de alto risco. Dada a constatação de que o complexo PI3K pode ser um orquestrador rede de sinalização chave da metástase do câncer colorretal, terapêutica segmentação PI3K /AKT ou o complexo mTOR a jusante [17] pode ser racional, e dentro deste quadro de referência, a
ex vivo
tecnologia phosphosubstrate poderia mostrar útil no desenvolvimento de biomarcadores necessários de via de sinalização druggability.
na análise separada comparando
ex vivo
perfis fosfopeptídeo gerados pelo
KRAS /BRAF
selvagem -type tumores como um grupo inteiro com aqueles obtidos em bloco a partir do grupo de tumores que albergam tais mutações, ErbB2 e ErbB4 estavam entre os substratos dominantes discriminar estes dois grupos. No entanto, tendo em conta que os 11 substratos que discriminam nesta análise apareceu a partir de um número total de 102 péptidos que constituem os perfis de actividade de tirosina-cinase, a taxa de detecção falsa pode ser tão elevada quanto 50% com o nível de significância estatística de
P
0,05. No entanto, a resistência ao tratamento com o anticorpo anti-EGFR pode ser mediada por activação da sinalização mediada-ErbB2, quer através de amplificação
ERBB2
ou o aumento dos níveis de heregulina ligando ErbB3 /ErbB4 [13]. Além disso,
ERBB2
foi encontrado recentemente para ser amplificado em um terço dos tumores, principalmente câncer de cólon, confirmado para ser de tipo selvagem para
KRAS /BRAF /PIK3CA
mas resistentes ao anticorpo anti-EGFR terapia; tumores com
ERBB2
amplificação foram substancialmente enriquecida nesta população específica em comparação com pacientes não selecionados [12]. Na presente coorte de pacientes LARC, no entanto, apenas dois casos foram concluídas ter
ERBB2
amplificação.
Especificamente, usando de alto rendimento matrizes substrato quinase, uma associação entre a atividade da quinase de tumores e metástases sobrevida livre de foi encontrado nesta coorte LARC. Para a prática clínica, esta tecnologia pode ser praticável, uma vez que é robusto com quantidades pequenas de tecido, tipicamente 10-15 microgramas de proteína total ser suficiente [4] – [6]; No entanto, até agora tem sido utilizada para tratar um número limitado de tópicos clínicos [7], [8], [28] – [30]. O conceito está dependente de tecido de tumor fresco congelado para a preservação da actividade de quinase, e para a investigação aqui relatada, tomamos a vantagem de um biobanco existente de amostras de biópsia prospectivamente compilados a partir de pacientes do estudo, permitindo a análise do tecido tumoral de qualidade garantida. No entanto, a população atual LARC não tinham recebido tratamento com o anticorpo anti-EGFR e, portanto, esses dados de resultados não estava disponível para correlação com os perfis de actividade tumor gerado quinase.
Ao selecionar pacientes com câncer para quinase inibição terapêutica, o ouro prevalecente -Standard é baseada principalmente na detecção de aberrações genéticas nos tumores dos pacientes.