Abstract

MicroRNA foi recentemente reconhecido como desempenhando um papel de destaque na tumorigênese e metástase. Aqui, nós relatamos que o miR-338-3p foi epigenetically silenciada no câncer gástrico, e sua infra-regulação foi significativamente correlacionada com câncer gástrico características clínico-patológicas. Surpreendentemente, restaurando a expressão de miR-338-3p em células de câncer gástrico SGC-7901 inibiu a proliferação, migração, invasão e tumorigenicidade

in vitro

e

in vivo

, pelo menos parcialmente, pela indução de apoptose. Além disso, demonstramos o SSX2IP oncogene é um alvo de miR-338-3p. Propomos que as funções de miR-338-3p como um supressor tumoral no câncer gástrico e do estado de metilação de sua ilha CpG poderia servir como um potencial marcador de diagnóstico para câncer gástrico

Citation:. Li P, Chen X, su G, Li C, Zhi Q, B Yu, et ai. (2013) epigenética silenciamento de miR-338-3p Contribui para tumorigenicidade em Câncer Gástrico por Segmentação SSX2IP. PLoS ONE 8 (6): e66782. doi: 10.1371 /journal.pone.0066782

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha |

Recebido: 17 Janeiro, 2013; Aceito: 10 de maio de 2013; Publicação: 24 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Natural Science Foundation da China (números 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 e 81272749), Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Município (números 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 11jc1407602 e 101.409.042.000), Xangai Key Disciplina ( S30204) e Principais Projetos na Science Programa Pillar Tecnologia da China (números 2008BA152B03 e 2011BA203191), China Pós-Doutorado Science Foundation (número 2011M500796). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

o câncer gástrico é uma neoplasia com alta incidência e a segunda principal causa de morte por câncer em todo o mundo [1]. A taxa de diagnóstico precoce do câncer gástrico é baixo, e os pacientes são normalmente difíceis de ser diagnosticada até que o câncer se desenvolveu em estágio avançado ou metástase. Assim, é de grande importância para realizar um estudo em profundidade sobre a patogênese do câncer gástrico e de procurar novos tomadores moleculares e alvos terapêuticos.

MicroRNAs são pequenos RNAs que regulam a expressão do gene, e eles estão envolvidos em uma variedade de vias de sinalização biológicos [2]. Vários estudos têm revelado diferença significativa da expressão de perfil microARNs entre células tumorais e células derivadas de tecidos normais, indicando que microARNs têm desempenhado papéis importantes na tumorigénese [3], [4]. Assim, MicroRNAs tornou-se recentemente um hotspot do diagnóstico genético e tratamento alvo como novos oncogenes ou genes supressores [5], [6]. A expressão anormal de microARNs em tecidos ou no soro está intimamente relacionado com múltiplas malignidades humanas, incluindo cancro gástrico [7], [8], e vários microARNs regulada para baixo em tecidos de cancro gástrico têm funções de supressão de tumor. Por exemplo, a família let-7 microARN foi encontrado pela primeira vez como um repressor de RAS, reprimindo RAS e expressão de c-myc no nível translacional [9]. O nível de let-7a expressão é significativamente reduzida nos tumores gástricos, enquanto a proteína Ras é significativamente mais elevado em tumor gástrico [10]. Além disso, o miR-15b, o miR-16 e miR-21 etc, que tenham sido ligados ao desenvolvimento e diagnóstico clínico de cancro gástrico [11], [12]. O nosso grupo também relatou o papel anticancerígeno de miR-126, miR-409-3p e miR-155 em câncer gástrico [13] – [15]

MicroRNA microarray foi realizada para detectar os perfis de miRNA em gástrica. câncer, e descobrimos que miR-338-3p foi significativamente regulada para baixo (dados não publicados). miR-338-3p, localizado em 17q25.3 cromossoma com um comprimento de 22 nt, foi relatada pela primeira vez na neurodegeneração induzida por prião como a expressão de miR-338-3p é reduzida nos cérebros de ratos infectados com adaptado-rato raspagem [ ,,,0],16]. miR-338-3p pudesse regular o nível de ARNm do seu gene hospedeiro Apoptose-tirosina-quinase associada (AATK) em neurónios de rato [17]. Por outro lado, o miR-338-3p foi regulada em doentes com esclerose amiotrófica lateral, esporádicos (SALS), um outro tipo de lesões do sistema nervoso [18]. Importante, um papel de miR-338-3p na tumorigénese foi previamente sugerido, como miR-338-3p é regulada negativamente no cancro rectal [19], e é regulada pela Hepatite B proteína do vírus X (HBx) para inibir a proliferação e invasão de células de hepatoma por ligação a genes alvo CyclinD1 e smoothened na carcinoma hepatocelular [20] – [22]. No entanto, o papel de miR-338-3p em GC ainda é desconhecida.

No presente estudo, foram analisados ​​ainda mais a expressão sub-regulação de miR-338-3p em tecidos GC em comparação com o normal, pareados por paciente tecidos, e determinou que o nível de miR-338-3p expressão foi estreitamente relacionado com as variáveis ​​clínico-patológicas de GC. A expressão ectópica de miR-338-3p inibe a proliferação, invasão e metástase de células de cancro gástrico, reduz a capacidade tumorigénica de células de cancro gástrico em ratos pelados, e promove a apoptose. Mostramos também que miR-338-3p pode funcionar como um supressor tumoral diretamente pela segmentação SSX2IP. Assim, nossos resultados sugerem que miR-338-3p é um potencial marcador de diagnóstico e alvo terapêutico do câncer gástrico.

Materiais e Métodos

1. Linhas celulares e Cultura

As linhas celulares de cancro gástrico humano SGC-7901, NCI-N87, BGC-823 e AGS foram comprados de Xangai Institutos de Ciências Biológicas, da Academia Chinesa de Ciências [23] – [26]. KATO-III e SNU-1 foram adquiridas a partir da ATCC (American Type Culture Collection) [24], [27], MKN28 e MKN45 foram obtidos a partir do Cancer Research Resources Banco Japonês [28], a linha celular epitelial gástrica imortalizada, GES -1, foi um presente do Prof. Feng Bi (Hospital Huaxi, Universidade de Sichuan, Chengdu, província de Sichuan, PR China) [29], [30]. HEK293T, linha de células de rim embrionário humano, foi preservada em nosso instituto. As linhas celulares de cancro gástrico foram cultivadas em RPMI1640 suplementado com FBS 10% (soro bovino fetal) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2. células HEK293T foram cultivadas em DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com a mesma condição acima cultivadas.

2. Ética Declaração

consentimento informado por escrito no estudo foi obtido de todos os participantes. O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Ruijin Hospital, Faculdade de Medicina da Shanghai Jiao Tong University.

3. As amostras de tecido

tecidos de câncer gástrico primários e os tecidos não tumorais combinadas foram coletados de 66 pacientes submetidos à gastrostomia radical no Departamento de Cirurgia do Hospital Ruijin, Escola de Medicina da Universidade Shanghai Jiao Tong. Nenhum dos doentes recebeu tratamento pré-operatório. Todas as amostras de tecido foram coletadas com o consentimento informado dos pacientes e confirmada pelo exame patológico, ea identificação do tipo histológico foi baseado na classificação do Lauren. As definições de classificação TNM estavam de acordo com a União Internacional contra o Câncer (2002).

4. Isolamento de ARN e qPCR

O ARN total foi isolado a partir de linhas celulares e amostras de tecido por

mir

Vana ™ kit de isolamento de miARN (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade e quantidade das amostras de ARN foram avaliadas por electroforese e métodos espectrofotométricos padrão. O nível de miR-338-3p em linhas celulares e amostras de tecido de expressão foi medida por qPCR e calculado como descrito [13]. O nível de ARNm SSX2IP expressão foi medida por qPCR de acordo com o gene TaqMan® Ensaios de Expressão protocolo (Applied Biosystems). O nível de mRNA GAPDH foi utilizada para a normalização.

5. O isolamento de ADN e análise de metilação

O ADN genómico a partir de amostras de tecido foi purificado utilizando DNAzol (Invitrogen). conversão de bissulfito de sódio foi realizada utilizando o Qiagen Epitect Bissulfito Kit (Qiagen) de acordo com o fabricante. As estátuas metilação foi realizada por metilação de PCR específica (MSP). Os primers para DNA metilado ou não metilado foram desenhados pelo software Metil Primer Expresso v1.0 (ABI) .A metilação iniciador directo para o CpG de miR-338-3p: 5′-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 ‘e o iniciador inverso: 5’ -AAACCTAACCGATCCTCG-3 ‘, o iniciador directo unmethylation para o CpG de miR-338-3p: 5′-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3′ e o iniciador inverso: 5’-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3 ‘

6.. A transfecção transiente de miARN Imita

imita miARN-338-3p e imita de controlo negativo foram adquiridos de GenePharma (Xangai, China) .Cells foram semeadas em placas de cultura celular 20 h antes da transfecção para assegurar a confluência celular de 70% ao momento da transfecção. A transfecção de imita miARN em células foi realizada utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com o procedimento do fabricante. Os imitadores de miARN trabalhou na concentração final de 100 nM. Às 48 h pós-transfecção, qPCR e Western blot foram realizados.

7. Ensaio de Proliferação de Células

A proliferação celular foi avaliada por ensaio de WST (sal de tetrazólio solúvel em água) utilizando uma contagem celular Kit-8 (Dojindo) de acordo com as instruções do fabricante. Às 24 h pós-transfecção imita com miARN, as células (2 x 10

3 células /poço) foram semeado em placas de 96 poços. As placas foram incubadas durante 5 dias. O número de células viáveis ​​foi avaliado por medição da absorvância a 450 nm.

8. Agar Mole Formação Colony Ensaio

GC células transfectadas com imita miARN foram ressuspensas com 0,3% de agar mole em RPMI1640 contendo 10% de FBS e 0,6% em camadas em agar solidificado em RPMI1640 contendo 10% de FBS em placas de 6 poços (1 × 10

3 células /cavidade). As placas foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. As colónias contendo pelo menos 50 células foram contadas.

9. A migração celular e invasão Ensaio

Migração de células foi realizada utilizando QCM

TM24-Bem Colorimétrico migração Assay Kit (Millipore) de acordo com as instruções do fabricante. Para o ensaio de invasão, invasão celular Kit de Ensaio (Millipore) foi usada de acordo com as instruções do fabricante. As células (1 x 10

5) em 300 ul de meio isento de soro, foram adicionados às câmaras superior e cultivadas durante 48 h. células não invasoras não migra ou foram removidos com algodões cotonetes, células que migraram ou invadido para a parte inferior da membrana foram coradas com o tampão de coloração de células fornecido no kit de ensaio e contadas sob microscópio e fotografados. Três experimentos independentes foram realizadas para as mesmas condições.

10. Análise apoptose

A análise celular apoptose foi executada com anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD) de acordo com as instruções do fabricante. Cada ensaio foi realizado em triplicado e repetidas três vezes, independentemente. A característica de encolhimento nuclear associada com apoptose foi mostrado pela Hoechst 33342 (Beyotime) de acordo com a morfologia protocol.The foi visualizado por um microscópio de fluorescência que foi excitada no comprimento de onda de 350 nm e medido a 460 nm.

11. Construção de plasmídeos de luciferase e Ensaio de Actividade

O fragmento de tipo selvagem (wt) ou 3 ‘UTR de SSX2IP locais mutante (Mut) 3’UTR de SSX2IP contendo a putativa sítios de ligação de miR-338-3p foram sintetizados . Os fragmentos foram clonados no vector PMIR-Report luciferase (Ambion) contendo

Firefly

e nomeado PMIR /SSX2IP-3’UTR

mut.Cells WT e PMIR /SSX2IP-3’UTR

foram semeado em placas de 24 poços 24 h antes da transfecção. 500 ng de PMIR /SSX2IP-3’UTR

em peso ou PMIR /SSX2IP-3’UTR

mut foram transfectados em cada poço, juntamente com 20 ng de vector PRL-TK (Promega) contendo

Renilla

luciferase e 60 pmol dos miR-338-3p ou controle imita. As células foram colhidas após 48 horas de transfecção.

Firefly

e

Renilla

actividades de luciferase foram medidos usando ensaio de repórter Dual-luciferase (Promega) de acordo com as instruções do fabricante.

12. Transfecção estável de expressão de miR-338-3p Vector

pSilencer-miR-338-3p vector e pSilencer-miR-controlo do vector foi transfectado em células SGC-7901, respectivamente, utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen), e seleccionado com 100 ug /ml de higromicina B (Invitrogen) durante 4 semanas. Os clones de células transfectadas de forma estável foram seleccionadas e mantidas em metade da concentração de selecção.

13. Tumor Xenoenxerto modelo

células SGC-7901 (2 × 10

6 células /ratinho) estavelmente transfectadas com vector de controlo de pSilencer pSilencer-miR-338-3p ou foram injectados por via subcutânea em macho de 4 semanas de idade camundongos nus (Instituto de Zoologia da Academia chinesa de Ciências, Xangai, China) .Os ratos foram verificados semanalmente, os nódulos tumorais foram medidos com um paquímetro. Os ratinhos foram sacrificados 4 semanas após a injecção, e os tumores foram removidos e pesados. O volume do tumor foi avaliada utilizando a seguinte fórmula:. Volume = (largura + comprimento) /2 × comprimento x largura x 0.5236.Tumor curvas de crescimento foram calculadas

14. Imuno-histoquímica

Detecção de SSX2IP foi realizada em cortes de parafina com a SSX2IP anti-anticorpo (Abcam, a diluição 1:1000). O complexo imune foi visualizado com a Dako REAIS

Sistema de Detecção ™ TMEnVision, Peroxidase /DAB, Coelho /Mouse (Dako), de acordo com o procedimento do fabricante. Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina.

15. Análise Estatística

A relação entre o nível de expressão de miR-338-3p e os parâmetros clínico-patológicas foi analisada pela Pessoa

X

2 de teste. As diferenças entre os grupos foram analisadas utilizando Student

t

teste. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS 13.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, EUA), e

P Art 0,05 foi considerado significativo

Resultados

1. . A expressão de miR-338-3p é regulada negativamente em linhas de células de GC e Tecidos

Para explorar o papel de miR-338-3p no GC, primeiro comparou o nível de expressão de miR-338-3p em oito linhas de células de cancro gástrico com uma linha imortalizada normais da mucosa gástrica célula epitelial (GES-1). Como mostrado na Fig. 1A, miR-338-3p foi significativamente regulada para baixo em linhas de células de GC em comparação com GES-1. Para confirmar este resultado, nós também compararam as expressões de miR-338-3p em tecidos GC e tecidos não tumorais adjacentes. 66 amostras de GC emparelhado foram incluídos neste estudo. Os resultados mostram que o nível de expressão média de miR-338-3p foi significativamente regulada para baixo em tecidos tumorais em comparação com os tecidos adjacentes não tumorais (Fig. 1B). Além disso, elucidou a correlação entre a expressão de miR-338-3p e fatores clínico-patológicas. Tal como mostrado na Tabela 1. 59,1% (39/66) de amostras de GC mostrou a sub-regulação de miR-338-3p abaixo duas vezes de corte (razão de expressão relativa 0,5), esta situação foi considerada significativamente para baixo -regulamentado. Com base neste ponto de corte, os 66 casos clínicos foram divididos em dois grupos: o miR-338-3p inferior expressão grupo (n = 39) e miR-338-3p maior expressão (n = 27). O grupo de menor expressão mostrou inclinação para maior tamanho do tumor, mais linfonodo metástases, invasão mais profunda local e estágio TNM mais avançado, mas nenhuma correlação significativa com a idade, sexo ou tipo histológico (Tabela 1).

(A) a expressão relativa de miR-338-3p em linhas de células gástricas e a linha de células imortalizadas normais da mucosa gástrica epitelial (GES-1) (*

P

0,05, **

P

0,01) foram detectados por qPCR. (B) para a expressão de qPCR de miR-338-3p foi realizada utilizando 66 casos de cancro gástrico tecidos e tecidos adjacentes correspondentes. A média eo desvio-padrão foram mostrados (**

P Art 0,01).

2. miR-338-3p é epigenetically Silenciado em Câncer Gástrico

Como silenciamento epigenético é um meio comum para a infra-regulação da expressão de miRNA [31], [32], decidimos analisar a distribuição ilha CpG no promotor região de miR-338-3p pelo software v1.0 metil Primer Express. Os resultados mostraram que existem ilhas de CpG na secção (-690 a -241) a montante do local de início da transcrição (SAT). Foi examinado o estado de metilação de ilhas de CpG da região promotora por PCR específicos de metilação (MSP), que abrange a região de -366 a -576 (Fig. 2A). Usando MSP, verificou-se que a ilha de CpG de miR-338-3p foi extensivamente metilado nas linhagens de células em comparação com GC na linha celular epitelial da mucosa gástrica (GES-1). Como esperado, o tratamento com 5-aza induzida desmetilação significativa (Fig. 2B). Os resultados representativos das análises de MSP de miR-338-3p em tecidos tumorais GC e tecidos não tumorais adjacentes combinados foram mostrados na Fig. 2C. As taxas de metilação das ilhas de CpG miR-338-3p em tecidos tumorais e tecidos não tumorais adjacentes de pacientes 66 eram GC 78,79% e 24,24%, respectivamente (**

P

. 0,01, Figura 2D) . Quando a curva das características operacionais do receptor e a área sob a curva (AUC) para o estado desnaturado de miR-338-3p em GC foram calculadas, a AUC foi de 0,773 ± 0,042, significativamente maior do que a da hipótese nula (

P

0,001), e o intervalo de confiança de 95% foi 0,690-0,856 (Fig. 2E). Assim, o estado de metilação da ilha de CpG miR-338-3p poderia servir como um marcador molecular potencial para GC.

(A) locais esquemáticas de locais CpG dentro das ilhas CpG que cercam o promotor miR-338-3p região. (B) Análise de REM para a metilação do miR-338-3p em linhas celulares de GC. H: MSP de iniciadores específicos de metilação; L: MSP de iniciadores não específicos da metilação (C) Os resultados representativos das análises de MSP de miR-338-3p em tecidos de cancro gástrico (T) e tecidos adjacentes normais (N). (D) os níveis de metilação da ilha CpG miR-338-3p em tecidos tumorais GC e combinados tecidos não tumorais adjacentes em 66 pacientes (78,79% e 24,24%, **

P Art 0,01). (E) A curva de características de funcionamento do receptor de estado de metilação de miR-338-3p. A AUC foi 0,773 ± 0,042 (

P Art 0,001), 95% de intervalo de confiança foi de (0,690, 0,856)

3.. miR-338-3p inibe as células de câncer gástrico Proliferação

Desde miR-338-3p é significativamente regulada para baixo em GC, como mostrado acima, pode funcionar como um supressor de tumor. Portanto, o próximo determinado se a sobre-expressão de miR-338-3p em células de câncer gástrico poderia afetar o crescimento celular. Sintético imita ou imita controlo negativo miR-338-3p foram transfectados em células SGC-7901 em que o nível do miR-338-3p expressão é a menor, seguido por ensaio de WST para monitorizar o crescimento celular.

A expressão ectópica de miR-338-3p em células SGC-7901 foi confirmada por células qPCR e SGC-7901 transfectadas com imita miR-338-3p cresceu significativamente mais lento do que o grupo controle (Fig. 3A) (*

P

0,05, **

P

0,01). Para caracterizar ainda mais o efeito de miR-338-3p no crescimento celular, foi realizado ensaio de formação de colónia macio-ager. Verificou-se que o número de colónias a partir de células SGC-7901 transfectadas com imita o miR-338-3p foi significativamente menos do que a do grupo de controlo (Fig 3B-C.) (**

P

0,01) . Consistentemente, a inibição de miR-338 induziu a proliferação de SGC-7901 (Fig S2 no arquivo S1, *

P

. 0,05). Resultados similares foram observados nos GES-1 de controlo de células (Fig S1 A-B em arquivo S1, *

P

. 0,05). Em resumo, estes resultados sugerem que miR-338-3p suprime a taxa de crescimento de ambas as células GC e células epiteliais gástricas

em

vitro.

(A) SGC- 7901 proliferação de células foram realizadas pelo ensaio de WST. células SGC-7901 foram transfectadas com imita ou imita controlo miR-338-3p a uma concentração final de ensaio de 100 nM.The WST foi realizada a cada 24 horas durante 4 dias. Os resultados são meio de três experimentos independentes ± D.P. (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01).. (B-C) O efeito de miR-338-3p em SGC-7901 a proliferação das células foi avaliada por ensaio de formação de colónias. células SGC-7901 transfectadas com imita ou imita de controlo 100 nM miR-338-3p foram semeadas em placas de 6 cavidades. O número de colónias foi contado na 14

º dia após a semeadura. (B) fotografias representativas das colónias. (C) As colónias foram contadas. Os resultados foram médias de três experiências independentes ± S.D. (**

P Art 0,01).

4. miR-338-3p inibe a migração e invasão das células GC

in vitro

Com base na ideia de que o miR-338-3p serve como um supressor de tumor de GC, exploramos ainda mais os seus efeitos sobre migração e invasão celular, um determinante crítico de progressão maligna e metástase. Como mostrado na Fig. 4, o número de células SGC-7901 migratórias transfectadas com imita miR-338-3p foi significativamente menor do que o grupo controle (105,00 ± 11,16 vs 145,00 ± 7,00, **

P Art .. 0.01 Fig 4 a-B), eo número de células SGC-7901 invasivos transfectadas com miR-338-3p foi significativamente menor em comparação com o grupo controle (41,33 ± 4,04 vs 76 ± 10,54, **

P Art 0,01. A Fig. 4 C-D). Consistentemente, a inibição de miR-338-3p induzida migração e invasão de células SGC-7901 (Fig S3 no arquivo S1, *

P

. 0,05). Por outro lado, miR-338-3p não teve influência sobre a migração de GES-1 (Fig. S1 E no Arquivo S1), provavelmente porque as células GES-1 não têm a migração e natureza invasiva das células cancerosas. Estes resultados exibido um papel de miR-338-3p na inibição tanto da migração e invasão de células de GC.

(A) fotografias representativas das células migratórias na membrana (ampliação 100 x). (B) célula migratória Média número de três experiências independentes ± SD (**

P Art 0,01). (C) fotografias representativas das células invasoras na membrana (ampliação de 100 ×). (D) o número de células invasivas média de três experiências independentes ± S.D. (**

P Art 0,01).

5. miR-338-3p pode induzir as células do cancro gástrico apoptose

Para elucidar o mecanismo de miR-338-3p sobre os efeitos inibidores do crescimento de células de GC, foi testada a análise da apoptose por citometria de fluxo. Os resultados indicaram que a taxa de apoptose foi significativamente aumentada em imita o miR-338-3p grupo transfectados em comparação com o grupo de controlo transfectado imita (**

P

0,01) (Fig. 5A-B). Examinamos ainda mais as características morfológicas de apoptose incluindo cromatina condensada e fragmentação nuclear pela Hoechst 33342 coloração, e reafirmou que a taxa de apoptose foi aumentada em imita miR-338-3p células transfectadas (Fig. 5C). Consistentemente, a inibição de miR-338 apoptose inibido de SGC-7901 células (Fig S4 no arquivo S1, *

P

. 0,05). Resultados similares foram observados nos GES-1 de controlo de células (Fig S1 C-D em Arquivo S1, **

P

. 0,01). Estes resultados indicaram que a sobre-expressão de miR-338-3p induz a apoptose em células de GC, o que poderia contribuir para as propriedades inibidoras de crescimento de miR-338-3p.

(A) histogramas representativos que descrevem a apoptose de células SGC-7901 transientemente transfectadas com imita ou imita controlo miR-338-3p. As células foram coradas com PI e anexina V-FITC às 48 h pós-transfecção. (B) A percentagem de células apoptóticas de três experiências independentes ± S.D. são mostrados (**

P Art 0,01). (C) histogramas representativos que descrevem a morfologia nuclear de células SGC-7901 transitoriamente transfectadas com imita ou células imita controle de miR-338-3p com Hoechst33342 (ampliação de 200 ×).

6. miR-338-3p Inibe tumorigenicidade e aumenta a apoptose

in vivo

Estamos próximos testaram se a expressão ectópica de miR-338-3p poderia influenciar o crescimento e apoptose de tumor gástrico

in vivo . células SGC-7901

foram transfectadas com o vector de expressão de miR-338-3p (p

Silencer

-miR-338-3p) ou o vector de controlo (p

Silencer

-miR -ao controle). Os clones estáveis ​​com ambos p

Silencer

-miR-338-3p ou p

Silencer

-miR-controle foram selecionados e injetado subcutaneamente em ratinhos nus, ea formação de tumores foi monitorada. células SGC-7901 transfectadas com miR-controle apresentou crescimento progressivo, mas foram inibidas quando a expressão ectópica de miR-338-3p. Após 28 dias, os murganhos nude foram sacrificados, e os pesos do tumor e o volume foi medido (Fig. 6 A-E). O peso médio dos tumores resultantes da pSil grupo

células encer

-miR-338-3p foi significativamente menor do que os tumores de p

grupo Silencer

células -miR de controle (1200 ± 193,26 mg vs 1800 ± 229,52 mg, **

P

. 0,01)

(a-C) fotografias de tumores derivados de SGC- pSilencer-miR-338-3p ou pSilencer-control vector estavelmente transfectadas 7901 células em ratos nus. cinética (D) crescimento de tumores em ratinhos nus. diâmetros de tumor foram medidos a cada 7 dias (**

P

0,01). (E) Peso médio de tumores em ratinhos nus. Médias ± S.D. foram mostrados (**

P Art 0,01). (F) fotografias representativas de ensaio TUNEL de amostras de tumores de ratos pelados (ampliação, 200 ×). (G) A percentagem de células apoptóticas foi contado. Significa SD ± (**

P Art 0,01).

Para examinar se a apoptose contribui para este observado

in vivo

inibição do crescimento do tumor em cima do miR-338 -3p sobre-expressão, ensaio TUNEL foi realizado em tecidos tumorais. Os resultados mostraram que tecidos tumorais de p

Silencer

-miR-338-3p continham células de coloração significativamente mais positivos em comparação com o grupo controle (**

P

. 0,01, Fig 6F-G ). Assim, nossos resultados indicaram que miR-338-3p inibe tumorigênese gástrica

in vivo

, pelo menos parcialmente, pela indução de apoptose in situ.

7. Alvos miR-338-3p o 3′-UTR do Oncogene

SSX2IP

Como miRNAs frequência regular a expressão de genes-alvo, buscamos alvos putativos de miR-338-3p usando ferramentas de busca on-line (por exemplo TargetScan, Microrna.org e PicTar). Os genes preditos por todos os programas usados ​​foram considerados alvos candidatos de miR-338-3p. Entre todos os hits, SSX2IP causado a nossa atenção, estudos anteriores indicaram que SSX2IP é um antigénio associado a leucemia mielóide aguda e um alvo imunoterapia potencial para a leucemia [33] – [35] e do nosso trabalho anterior mostrou que SSX2IP promove a invasão e migração de células de carcinoma hepatocelular e contribui para a resistência à quimioterapia [36].

Um potencial local de ligação de miR-338-3p foi previsto dentro da 3’UTR de SSX2IP (Fig. 7A). Para validar essa interação, colocamos um tipo selvagem ou fragmento 3’UTR mutante de SSX2IP para a luciferase vector PMIR-REPORT. As construções resultantes foram co-transfectadas com imita ou imita controlo miR-338-3p em células HEK293T, seguido pelo ensaio de repórter de luciferase. A actividade luciferase relativa de PMIR /SSX2IP-3’UTR

em peso, mas não PMIR /SSX2IP-3’UTR

mut, foi significativamente suprimida pelo miR-338-3p (**

P

.. 0,01) em comparação com a dos imita de controlo (Fig 7B), indicando que o miR-338-3p liga-se directamente para o 3 ‘UTR de SSX2IP funcionar como um supressor

(a) gráfico esquemático dos sítios de ligação putativos de miR-338-3p alvo 3’UTR de SSX2IP. (B) mimetiza downregulated miR-338-3p actividades de luciferase controlada por de tipo selvagem 3’UTR de SSX2IP (**

P

0,01), mas não afectou a actividade de luciferase controlada por 3’UTR do mutante SSX2IP. Os resultados são médias de três experiências independentes ± S.D. (C) SSX2IP, caspase-3 e Pro-casepase-3 foram detectadas por Western Blot às 48 h pós-transfecção imita com miR-338-3p e de controlo. (D) mRNA SSX2IP em células SGC-7901 analisadas por qPCR às 48 h pós-transfecção com imita miR-338-3p e controle.

A seguir, examinou a influência de miR-338-3p em a expressão de SSX2IP, medindo os níveis de mRNA e proteína de SSX2IP após transfecção de células SGC-7901 com miR-338-3p ou imita controlo. Como mostrado na Fig. 7C-D, o miR-338-3p não teve efeito sobre o

SSX2IP

nível de ARNm tal como medido por qPCR, mas causou uma redução significativa do nível de proteína SSX2IP em comparação com o controlo transfectadas. Estes resultados sugerem que o miR-338-3p suprime a expressão de SSX2IP ao nível pós-transcricional, provavelmente através da ligação a da 3’UTR de SSX2IP. Notavelmente, também descobrimos que Capase-3 e procasepase-3, dois genes importantes apoptose, foram reduzidos em conformidade (Fig. 7C).

8. A expressão de miR-338-3p é inversamente correlacionada com o nível de expressão da proteína SSX2IP no câncer gástrico

miR-338-3p é regulada negativamente em câncer gástrico e SSX2IP é suportado a um gene alvo de miR-338 -3p, promoveu-nos a especular que SSX2IP pode ser sobre-expressão em tecidos de câncer gástrico e em relação aos tecidos não tumorais correspondentes.

a análise imunohistoquímica do antígeno SSX2IP revelou a situação de coloração para proteína SSX2IP em tecidos tumorais e combinados tecidos não tumorais em 66% do cancro gástrico samples.65 (43/66) de tecidos de cancro gástrico exibida immuostaining elevada para a proteína SSX2IP em comparação com os tecidos não tumorais correspondentes. Em particular, 84% (31/37) de tecidos de cancro gástrico exibiu imunomarcação elevada em amostras de GC do grupo de baixa expressão de miR-338-3p, enquanto os dados é de 41% (12/29) no miR-338-3p grupo de alta expressão. Assim, a análise da expressão de miR-338-3p e SSX2IP em tecidos de cancro gástrico confirmou a existência de correlação inversa entre a expressão de miR-338-3p e sua SSX2IP gene alvo (Pessoa de teste de qui-quadrado:

P Art 0,001, correlação de Spearman:.. r = -0,442,

P Art 0,001, Fig 8)

(A) análise imuno-histoquímica mostrou que a expressão aumentada de SSX2IP era mais frequentemente observada em tecidos de câncer gástrico no grupo de baixo-expressão de miR-338-3p e vice-versa. Tumor não tumorais (SSX2IP) significa a sobre-expressão de SSX2IP no tecido de tumor comparado com GC tecido não tumoral correspondente, e vice-versa. (B) fotografias representativas de análise imuno-histoquímica de SSX2IP em tecidos tumorais GC /não-tumorais pareadas (ampliação, 200 ×).

9. A expressão ectópica de SSX2IP resgata a fenótipos causado pelo excesso de produção de miR-338-3p em células GC

Se SSX2IP é um alvo principal suprimida por miR-338-3p no GC, expressão ectópica de SSX2IP deve resgatar os fenótipos causada por miR-338-3p sobre a produção em células de GC. Para testar esta ideia, e o vector de expressão ou vector vazio SSX2IP foi transfectadas individualmente em SGC-7901, seguido por ensaios citológicos para medir a proliferação celular, migração, invasão e apoptose. Como esperado, a sobre-expressão de SSX2IP parcialmente ou totalmente reverte o efeito inibidor de miR-338-3p GC em células em cada aspecto examinámos (Fig. 9 A-D). Por outro lado, SSX2IP não tem qualquer influência sobre a expressão de miR-338-3p (Fig. S5 no ficheiro S1). Assim, concluiu-se que a função supressora de cancro de miR-338-3p em GC é pelo menos parcialmente através de suprimir a sua SSX2IP gene alvo.

proliferação células SGC-7901 (A) foi realizada através do ensaio de WST.

Apoiar figuras de informação. Figura S1. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5.