Abstract
população Side (SP) e de expressão transportador ABC enriquecer em células-tronco em numerosos tecidos . Nós exploramos se este fenótipo caracterizado células-tronco do câncer de bexiga humanos (CSCs) e tentativa de identificar mecanismos de regulação. Concentrando-se em câncer de bexiga invasivo não-muscular (NMIBC), várias linhas de células humanas foram utilizados para caracterizar SP e expressão transportador ABC.
In vitro
e
in vivo
fenotípica e avaliação funcional do comportamento CSC foram realizadas. Expressão de putativa marcador ABCG2 CSC foi avaliada em amostras clínicas NMIBC (n = 148), e um papel para a sinalização MAPK, de um mecanismo central de tumorigénese da bexiga, foi investigada. Os resultados mostraram que o transportador ABCG2 foi predominantemente expresso e foi regulada na fração SP por 3 vezes (ABCG2
oi) em relação à fracção não-SP (NSP) (ABCG2
baixo). ABCG2
oi células SP exibida enriquecimento de marcadores de células-tronco (Nanog, Notch1 e SOX2) e um aumento de três vezes na formação de colónia eficiência (CFE), em comparação com ABCG2
células de baixa NSP.
In vivo
, ABCG2
oi células SP enriquecido para o crescimento do tumor em comparação com ABCG2
células de baixa NSP, consistente com CSCs. vantagem foi constitutivamente ativo na ABCG2
oi células SP e inibição de MEK também inibiu o ABCG2
oi SP fenótipo e suprimiu significativamente CFE. Além disso, ao examinar amostras NMIBC clínicos, expressão ABCG2 correlacionados com o aumento da recorrência e diminuição da sobrevivência livre de progressão. Além disso, a expressão pERK também se correlacionou com a diminuição da sobrevida livre de progressão, enquanto uma correlação positiva foi ainda demonstrada entre ABCG2 e expressão privilégio. Em conclusão, podemos confirmar ABCG2
oi SP enriquece para CSCs em NMIBC humana e MAPK via /ERK é um alvo terapêutico adequado
Citation:. Hepburn AC, Veeratterapillay R, Williamson SC, El-Sherif A, Sahay N, Thomas HD, et al. (2012) População Side in Human Non-Invasive Muscle cancro de bexiga enriquece de células-tronco cancerosas que são mantidos por MAPK sinalização. PLoS ONE 7 (11): e50690. doi: 10.1371 /journal.pone.0050690
editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América
Recebido: 27 de julho de 2012; Aceito: 23 de outubro de 2012; Publicado: November 30, 2012 |
Direitos de autor: © 2012 Hepburn et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo JGW Patterson Foundation e NHS Trustees. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
carcinoma de células transicionais (TCC) da bexiga urinária tem uma incidência anual mundial de mais de 350.000 novos casos e 145.000 mortes [1]. Em os EUA, é a quinta neoplasia mais comum sendo responsável por mais de 70.000 novos casos por ano e um gasto anual estimado de US $ 3,5 bilhões com o tratamento do câncer [2], [3]. Embora 85% dos pacientes apresentam não-muscular câncer de bexiga invasivo menos agressivo (NMIBC), eles têm um alto risco de recorrência e aqueles com características desfavoráveis, como a doença multifocal, tumores de alto grau, com ou sem carcinoma concomitante in situ (CIS) , estão particularmente em risco de progressão da doença. Intravesical Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) pode reduzir o risco de progressão de 27% em pacientes com alto risco NMIBC [4], mas aqueles que não conseguem responder normalmente submetido a uma cirurgia para remover o mórbida bexiga. Para os pacientes que se apresentam com, ou progredir para, músculo invasivo cancro da bexiga (CINM), a chance de sobreviver mais de 5 anos após o tratamento é de aproximadamente 50-60% [5], [6]. Este fundo indica que novas abordagens terapêuticas contra NMIBC são urgentemente necessários para erradicar a doença antes de um fenótipo invasivo desenvolve [7].
Os recentes avanços na biologia do câncer têm incluído a caracterização de células-tronco cancerosas (CSCs), uma pequena subpopulação de células de tumor que está a iniciar tumor e dirigem a produção do resto do cancro. CSCs foram descritos num número crescente de locais de tumores, incluindo hematopoiético, mama, cólon, próstata e melanoma [8] – [12]. Está se tornando claro que é essencial para direcionar essas células como eles determinar a resposta ao tratamento [13]. A (SP) por citometria de fluxo fenótipo categorização e selecção de uma população lateral [14] para os CSCs enriquece em numerosos tumores [15] – [18]. recente demonstração de SP em câncer de bexiga requer uma investigação mais aprofundada do seu potencial papel na CSCs caracterizam [19].
A patogênese do câncer de bexiga parece intimamente ligada à vias moleculares distintas [20], [21]. Mais de 70% dos NMIBCs abrigar mutações ativadoras do receptor de crescimento de fibroblastos fator 3 (FGFR3), levando à activação constitutiva de MAPK sinalização [22], [23]. Além disso, aumento da regulação do EGFR /receptores da família ErbB está associada com o aumento do grau e estágios do câncer de bexiga [24], [25]. De relevância, SP fenótipo é mediada pela cassete de ligação a ATP (ABC) da família de proteínas transportadoras [14], e a resistente do cancro da mama proteína-1 (BCRP1) /ABCG2 transportador tem demonstrado ser a principal mediador deste fenótipo [26]. Em particular, ABCG2 por sua vez é regulada por MAPK [27] e um papel para MAPK via de sinalização /ERK na regulação de SP tem sido sugerido (Tsichuda et al 2008).
Como um primeiro passo para a informação do concepção de novas terapias para NIMBC, que teve como objetivo caracterizar CSCs em câncer de bexiga humano utilizando selecção SP e explorar regulação através da MAPK /ERK eixo sinalização.
células RT112, RT4, J82 e 253JB-V foram coradas com Hoechst 33342 corante por si só ou na presença de reserpina e analisadas por citometria de fluxo, medindo a Hoechst azul vs Hoechst fluorescência vermelha. O SP foi fechado e representado como uma porcentagem de toda a população de células viáveis seguinte exclusão PI (média ± SE).
expressão de mRNA relativo de ABCA2, ABCG2, MRP1 e P-glicoproteína foi determinada em SP e frações NSP de RT112 (A) e as células RT4 (B) usando PCR em tempo real. Os dados apresentados são a média de três experiências independentes cada uma realizada em triplicado (média ± EP). * P 0,05 (Student bicaudal
t
-teste). Os estudos de inibição foram realizados em RT112 (C) e (D) RT4 células utilizando-específica ABCG2 fumitremorgin inibidor C (FTC) e verapamil inibidor de P-glicoproteína.
Materiais e Métodos
reagentes e cultura celular
de células de cancro da bexiga humano RT4, RT112 e J82 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1 % de L-glutamina – referido como meios completo (FM). O altamente metastático linha celular humana TCC 253JB-V foi generosamente fornecida pelo Professor Colin Dinney [28] e cultivadas em meios MEMalpha suplementado com 5% de FBS. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C na presença de 5% de CO
2. MEK1 /2 inibidor específico, U0126 (Cell Signaling Technology), e RegF (Sigma) foram utilizados nos estudos para modular a sinalização MAPK. As células de controlo para comparação incluiu as culturas em meio basal (BM) que faltam FBS e FM.
Hoechst Dye efluxo Ensaio
As células foram coradas com Hoechst 33342 dye utilizando modificação de um protocolo previamente descrito [14] . Resumidamente, foi adicionado a Hoechst 33342 corante (2,5 ug /ml) sozinha ou na presença de reserpina (50 uM), verapamil (50 uM) ou fumitremorgin C (10 uM) e as células foram incubadas a 37 ° C durante 90 min e agitada a cada 30 minutos. marcador de superfície celular análises seguintes Hoechst 33342 coloração com corante foram realizados com anticorpos anti-ABCG2-FITC (clone 5D3, Millipore) co-rotulagem em gelo durante 20 min. rato normal IgG-FITC foi utilizada como controlo de isotipo (Upstate). iodeto de propídio (PI) (2 ug /ml) fechado células viáveis. Análise e classificação foram realizadas em um FACSDIVA de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson).
Extração de RNA e análise em tempo real de PCR
O ARN total foi extraído utilizando o kit High Pure RNA (Roche) e invertidas transcritos utilizando iniciadores aleatórios (Promega) e Superscript III reverter enzima transcriptase (Invitrogen). PCR em tempo real foi realizado com mastermix SYBR Green ROX ™ e contendo UDG (Invitrogen) utilizando o Prism 7900HT Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems). Para as sequências de iniciador ver Tabela S1. Os níveis de expressão foram normalizados para gene GAPDH de limpeza.
(A) As células seleccionadas por FACS foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1 x 10
2 células /poço e As colónias foram contadas após 2 semanas . Colony eficiência de formação (CFE) foi calculada tal como descrito em Materiais e Métodos. Os dados apresentados são a média (± DP) de três experiências independentes realizadas em triplicado cada. * P 0,05 (Student bicaudal
t
-teste). (B) Os perfis do ciclo celular de RT112 ABCG2
oi SP e ABCG2
células de baixa NSP que mostram um aumento na fase S na ABCG2
oi fração SP. (C) a seleção de série, sub-cultura e fracionamento de citometria entre RT112 SP e células NSP. células SP e NSP ordenados a partir RT112 foram cultivadas por duas semanas, restained com Hoechst 33342 dye e reanalisados por citometria de fluxo. Este processo foi repetido 4 vezes.
(A) 1 × 10
3 ABCG2
oi SP e ABCG2
baixo NSP classificadas células RT112 foram injectados subcutaneamente em ratinhos nus e monitorados para o crescimento do tumor. (B) coloração imuno-histoquímica de secções seriadas, de tumores derivados de camundongos injetados com 1 × 10
3 ABCG2
oi SP e pelotas de células residuais de ratos injectados com 1 × 10
3 ABCG2
baixo NSP RT112 células classificadas, com H e e ABCG2 e em maior ampliação (20x). Marcadamente imunorreatividade aumentada para ABCG2 é visto no ABCG2
HISP derivado tumores. (C) a expressão do mRNA relativo de ABCG2 em tumores formados a seguir à injecção de 1 × 10
3 ABCG2
oi SP e ABCG2
baixo NSP classificadas células RT112 foi determinada utilizando PCR em tempo real. (D-F) expressão de mRNA relativa do Nanog, Notch1 e SOX2 em tumores formados a seguir à injecção de 1 × 10
3 ABCG2
oi SP e ABCG2
baixo NSP classificadas células RT112 foi determinada utilizando PCR em tempo real. (G) coloração imuno-histoquímica de secções seriadas, de tumores formados a seguir à injecção de 1 × 10
3 ABCG2
oi SP e ABCG2
baixo NSP classificadas células RT112, com Nanog, Notch1 e SOX2.
Colony Forming Ensaio
FACS células separadas foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 100 células /poço. Depois de 14 dias as colónias foram fixadas com fixador de Carnoy e coradas com violeta de cristal a 0,4% (w /v) para contagem de colónias utilizando ColCounter (Oxford Optronix), omitindo 64 colónias de células uma vez que representam colónias cedo abortivos. Colony eficiência formando (CFE,%) foi calculada como [(no. Colónias contadas /n. Células semeadas) × 100].
Ciclo Celular
FACS células classificadas foram coradas com DAPI para celular análise do ciclo usando kit 2step DNA CyStain (Partec). iodeto de propídio (2 ug /ml) fechado células viáveis. Para discriminar detritos e dobletes nuclear, as células foram fechado no FSC e SSC. Citometria de fluxo de software ciclo celular (CellQuest Pro, BD Biosciences) foi utilizado para calcular o conteúdo de DNA e calcular estatísticas subG1, G1, S-fase e fase G2M.
In vivo
tumorigenicidade
As experiências com animais foram realizados e conduzidos de acordo com as diretrizes regulamentares. Vinte e três ratos fêmeas atímicos CD1 nu (Charles River, UK) foram injetados com RT112 SP e NSP classificadas células no tecido subcutâneo flanco direito. O crescimento tumoral foi monitorado por dois medição dimensional com compassos de calibre eletrônicos com volume tumoral calculado utilizando a fórmula
a
2
×
b /2
, onde
um
é o menor medição e
b
o maior. As experiências ratos foram terminados quando os tumores cresceram até um máximo de 750 mm
3. Os tumores foram removidos e metade para estudos de imuno-histoquímica e estudos de PCR em tempo real.
imunohistoquímica
parafina fixadas em formalina incorporado material de arquivo de pacientes submetidos à ressecção endoscópica de tumor de bexiga ou cistectomia radical foi acessado para estudos de imuno-histoquímica com o consentimento apropriado informado e aprovação regulamentar ético. No total, 148 casos NMIBC foram coradas com anti-ABCG2 (1:250; clone BXP-21, Millipore) e anti-p-ERK (1:100, E-4, Santa Cruz Biotechnology) antes da incubação com anti secundário de cabra biotinilado -mouse anticorpo IgG (DAKO). Imunorreactividade foi visualizada usando Vectastain Avidina Biotina Kit Complex (Vector Laboratories) e 3’3′-diaminobenzidetetrahydrochloride. Scoring foi inicialmente avaliada pela porcentagem e intensidade da coloração. No entanto, a grande maioria dos núcleos expressa coloração epitelial uniforme com uma intensidade única, com coloração heterogéneo presentes em apenas alguns poucos casos. Nestes núcleos, a intensidade com 50% de área de coloração foi feita como a pontuação. A marcação foi revisto e marcou de forma independente por três avaliadores que foram cegos aos dados clínicos para dar pontuações médias de intensidade de coloração de ausente (0), fraco (1), moderada (2) ou forte (3). Xenotransplantes também foram coradas com anti-Nanog (1:5000, Sinalização celular), anti-Notch 1 (1:500, C-20, Santa Cruz Biotechnology) e anti-SOX2 (1:500, Millipore).
Western Blotting
As células foram lisadas em tampão de amostra de SDS (Tris 0,125 M pH 6,8, SDS a 2%, glicerol a 10%, 10% β-mercaptoetanol e 0,01% de azul de bromofenol) e analisados por SDS-PAGE em 12% de géis de poliacrilamida, seguida por transferência para nitrocelulose membrana Hybond ™ (Fisher Scientific). Os anticorpos foram utilizados nas seguintes diluições: anti-ERK 1:500 (K-23, Santa Cruz Biotechnology) e anti-fosfo-ERK 1:500 (E-4, Santa Cruz Biotechnology). anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (Dako) foram usados em 1:500 e detectados utilizando o kit de detecção de quimioluminescência aumentada (Fisher Scientific).
Análise Estatística
Para os estudos de PCR em tempo real, os dois -tailed emparelhado
t
-test foi utilizado para determinar a significância estatística ao nível de P 0,05. Para imunohistoquímica, diferenças na frequência e na expressão de ABCG2 foram examinados através de Mann-Whitney
U
teste para avaliar correlações com grau de câncer patológica e palco. sobrevida do paciente foi analisada pelo método de Kaplan-Meier com o teste log-rank e análise multivariada foi realizada utilizando o modelo de riscos proporcionais de Cox. A correlação de Pearson foi utilizado para correlacionar ABCG2 e expressão privilégio. Todos os testes foram realizados usando a versão SPSS 11.0 software de computador (SPSS, Inc.). Todos os testes foram de dois lados e um
P valor
de . 0,05 foi levado para indicar significância estatística
(A) Análise de Western blot foi realizada com fosfo-ERK1 /2 e ERK1 /2 anticorpos. (B) As células foram colocadas em RT112 FM sozinho ou na presença de U0126 (10 uM) durante 30 min antes da coloração com Hoechst 33342. O efeito de U0126 na “cauda” e “topo” compartimentos da extremidade de ABCG2
HISP
+ foi investigada. (C) CFE de ABCG2
oi células SP com concentrações crescentes de UO126 e diferentes colónias de tamanho (≥1 mm, ≥2 mm e ≥ 3 mm de diâmetro).
(A) ABCG2 expressão em urotélio normal, de baixo grau (LG) e alto grau (HG) NMIBC é tipicamente não-específica e pode ser visto nuclear e citoplasmática. (B) Correlação de ABCG2 imunocoloração intensidade com grau e estágio em NMIBC. curvas (C) de Kaplan-Meier ilustrando os resultados de intensidade ABCG2 (0, 1, 2 e 3) com recorrência e sobrevivência livre de progressão (p 0,001, Log Rank análises). curvas (D) de Kaplan-Meier que ilustra os resultados de intensidade de pERK (0, 1, 2 e 3) com sobrevivência livre de progressão (p 0,001, analisa Log Rank). (E) Correlação de ABCG2 e expressão pERK (p = 0,005, r de Pearson = 0,99).
Resultados
Células SP e ABC Transporter Expression pode ser identificado em células cancerosas da bexiga humana
Foi investigada a presença de SP em duas linhas NMIBC celulares (RT112 e RT4) e duas linhas de células CINM (J82 e 253JB-V). Após coloração com Hoechst 33342, um SP foi identificada em todas as quatro linhas de células como uma cauda distinta que se estende a partir da população principal com o baixo perfil fluorescente característico na análise de comprimento de onda duplo (Figura 1). A estratégia gating realizado foi seguido como descrito por Gołębiewska et. ai. [29] (Figura S1). discriminação apropriado de células individuais e viáveis é crucial para a caracterização SP adequada. A proporção média (± SE) de cada população de células total representada pelo SP foi de 12,8% (± 1,2%) em RT112, 15,3% (± 1,1%) em RT4, 2,7% (± 0,9%) em J82, e 1,0 % (± 0,5%) em 253JB-V. A reserpina inibidor transportador pan-ABC verificada fenótipo SP, bloqueando Hoechst efluxo e inibindo baixo fenótipo coloração vermelho /azul que caracteriza as células SP.
Foram avaliados ABC padrões de linhas celulares de cancro da bexiga usando PCR em tempo real expressão do transportador. expressões heterogéneas de vários genes de resistência a múltiplas drogas foram demonstrados na MIBC linhas de células J82 e 253JB-V. No entanto, nas linhas celulares NMIBC RT4 e RT112 maiores expressões de ABCG2 foram vistos (Figura S2).
ABCG2 é significativamente enriquecido dentro das células NMIBC SP e mantém este fenótipo
A seguir focado em NMIBC doença e examinada a expressão de ARNm relativa dos quatro transportadores ABC (ABCA2, ABCG2, MRP1 e P-glicoproteína) em fracções e RT112 RT4 SP e NSP utilizando PCR em tempo real (Figura 2A e 2B) .Os resultados demonstraram que, em adição a ABCG2 sendo o principal transportador de ABC em NMIBC, a sua expressão foi maior em células de SP em comparação com células de PNS. O papel fundamental de ABCG2 na geração de fenótipo sp foi confirmada pela perda completa da população SP após o tratamento com o fumitremorgin inibidor específico da ABCG2 C (FTC), em comparação com a ausência de efeito do tratamento com o verapamil inibidor da P-glicoproteína (Figura 2C e 2D). Em contraste, a P-glicoproteína foi o transportador ABC mais expressa diferencialmente e funcionalmente relevante na linha de células de MIBC J82 (Figura S3). Além disso, constatou-se que em células NMIBC a fração SP foi associado com apenas mais altos níveis de ABCG2 (ABCG2
oi) expressão (Figura S4).
Células SP Enriqueça para a função Stem Cell
in vitro
a seguir, comparou o potencial clonogênica de RT112 ABCG2
oi SP e ABCG2
células de baixa NSP. ABCG2
oi células SP mostrou um aumento de três vezes da média (± SE) formadoras de colônia de enriquecimento para 56,7% (± 1,6%) de 18,2% (± 0,2%) em ABCG2
células de baixa NSP (Figura 3A) . aumento similar na ABCG2
oi clonogenicidade SP comparação com ABCG2
células de baixa NSP foi demonstrado na linha adicional NMIBC células RT4 (Figura S5). Após a propagação de células não viáveis utilizando iodeto de propídio, análise do ciclo celular revelaram que uma maior proporção de ABCG2
oi células SP estavam em fase S em comparação com ABCG2
células de baixa NSP, com uma média (± SE) Os valores de 19% (± 5%) versus 5,5% (± 1) para a fase S e 68% (± 8%) em comparação com 94% (± 1%) para G1-fase, respectivamente (Figura 3B).
para considerar a capacidade de ABCG2
oi células SP repovoar o espectro fenotípico original da linha de células RT112 pai, foi realizada culturas de série e seleções de SP e frações NSP antes de voltar a coloração com Hoechst 33342 e reanalisar por fluxo citometria (Figura 3C). Os resultados mostraram que, após a primeira rodada de seleção, cultura e citometria de fluxo, as culturas derivadas de ambas as células SP e NSP cada deram origem novamente para uma distribuição semelhante de SP e células NSP. Se este processo foi então continuado com ciclos repetidos de selecção, a cultura em separado e fluir triagem de citometria de, a proporção de células derivadas de SP sub-culturas que foram localizados na fracção de SP aumentada com cada ronda, enquanto que houve uma redução marcante na fracção de SP de células derivadas de NSP sub-culturas.
Foram avaliados haste expressão do marcador celular em RT112 ABCG2
oi SP e ABCG2
baixa células NSP por PCR em tempo real (Figura S6A). ABCG2
oi células SP mostraram aumento da expressão de Nanog, Notch1 e SOX2 comparação com ABCG2
células de baixa NSP. Além disso, a expressão de marcadores da bexiga basocelulares, incluindo CK14, CD44, CD49f (α6 integrina) e CD104 (β4 integrina) também associados com o enriquecimento de CSCs, foi investigado (Figura S6B). Todos os marcadores de células basais foram expressos em ABCG2
oi SP células, mas níveis similares de expressão foram também observados em ABCG2
células de baixa NSP.
Células SP Enriqueça para a Grande tumor Iniciação Capacidade
in vivo
para investigar a capacidade comparativa de ABCG2
oi SP e ABCG2
células de baixa NSP para formar tumores viáveis
in vivo,
células classificadas de cada sub-população foram injectadas separadamente por via subcutânea em ratinhos nus CD1 e os locais de implante monitorizados para o crescimento. o crescimento do tumor rápida foi observada em 5 de 5, 5 de 5 e 3 de 3 animais após a implantação de 10
3, 10
4 e 10
5 ABCG2
oi células SP, respectivamente. No entanto, o crescimento do tumor ABCG2
lowNSP estava exausto por diluição de números de semeadura a 10
3 células, enquanto 5 de 5 camundongos enxertados com 10
3 ABCCG2
oi células SP cresceu tumores (Tabela 1). Examinando o volume médio do tumor ao longo do tempo revelou crescimento exponencial dentro do ABCG2
oi SP grupo inóculo de células em contraste com aqueles que receberam ABCG2
baixo NSP células (Figura 4A).
A análise imunohistoquímica de expressão ABCG2 em tumores , formado após a injeção de 1 × 10
3 ABCG2
oi SP células em comparação com as pelotas de células residuais (que não foram associados a qualquer crescimento ativo) colhidas de camundongos injetados com ABCG2
baixo NSP classificadas RT112 células, mostraram aumento da expressão em ABCG2
HISP comparação com ABCG2
lowNSP tumores derivados (Figura 4B).
aumento da expressão posteriormente demonstrado de ABCG2 (Figura 4C) e reconhecidos marcadores embrionárias /pluripotentes de células-tronco nanog, Notch1 e SOX2 (Figura 4D-F), que têm sido associados com a tumorigénese [30], utilizando PCR em tempo real em que os tumores formados a seguir à injecção de ABCG2
oi células SP em comparação com os sedimentos de células residuais colhidas a partir de ratinhos injetado com ABCG2
células de baixa NSP. Estes
in vivo
resultados foram consistentes com aqueles obtidos com os pais
in vitro
células cultivadas (Figura S6A) com alta expressão de marcadores de células-tronco mantida nos tumores de origem ABCG2
oi SP células que contrastam com baixa expressão na residual ABCG2
baixo NSP. De nota, a seleção das células tumorais iniciando por esta
in vivo
ensaio resultou em enriquecimento destes marcadores de células-tronco, em relação aos níveis basais
in vitro
, onde as diferenças eram de 11 vezes, 80- vezes, 44 vezes e 140 vezes para ABCG2, Nanog, Notch1 e expressão SOX2, respectivamente (p 0,05). Além disso, o aumento da Nanog, Notch1 e expressão SOX2 pelos ABCG2
xenotransplantes rato oi SP também foi observado por análise imuno-histoquímica (Figura 4G).
A inibição da ERK sinalização Atenua o Cancer SP Stem Cell Função
Nós investigamos o papel potencial da MAPK na regulação do fenótipo SP em células NMIBC RT112. Expressão de ERK, JNK e p38, bem como a via PI3K /Akt e STAT vias de sinalização foi determinada por PCR em tempo real (Figura S7A). EGFR, ERK1 e expressão ERK2 por ambos ABCG2
oi SP e ABCG2
células de baixa NSP foi documentada em níveis muito mais elevados do que os outros componentes de sinalização, sugerindo que estas enzimas eram susceptíveis de desempenhar um papel significativo na MAPK sinalização em células RT112. activação enzimática foi posteriormente explorada e vantagem foi confirmado para ser expresso constitutivamente a um nível superior em ABCG2
oi células SP (Figura 5A). Além disso, a expressão pERK elevada também foi visto nos ABCG2
hi xenotransplantes SP (Figura S7B). Para testar ainda mais a relevância da via /ERK MAPK como um alvo potencial no RT112 ABCG2
oi SP, foram avaliados os efeitos funcionais do U0126, um inibidor específico para MEK1 e MEK2. As células pré-tratadas com U0126 durante 30, 60 ou 120 minutos, não tinham expressão de ERK fosforilada detectável, confirmando, assim, a inibição da activação de ERK, mesmo na presença do estímulo de EGF (Figura S7C). Além disso, não houve nenhuma alteração significativa em células positivas para PI com o tratamento de U0126 (p = 0,38) após coloração com Hoechst 33342 (Figura S7D). Subdividiu a fracção ABCG2
HISP em células situadas na parte superior da cauda e as células localizadas na extremidade da cauda (Figura 5B), uma vez que foi relatado que as células na ponta da cauda SP, que têm a maior Hoechst 33342 capacidade de efluxo (Hoechst
baixo), altamente enriquecido a população de células-tronco [31]. O tratamento com o inibidor MEK teve um efeito inibidor significativo sobre as células localizadas no fim da cauda da ABCG2
HISP, reduzindo a ABCG2
HISP por 2,5 vezes (5,8% para 2,3%). Em contraste, o inibidor só reduziu o ABCG2
HISP na extremidade não-cauda cerca de 1,5 vezes (2,8% a 1,9%). Estes dados mostram que U0126 também está exercendo o seu efeito sobre ABCG2
hi Hoechst
células de baixa. O tratamento com U0126 também causou uma inibição dose-dependente da CFE em RT112 ABCG2
oi SP e ABCG2
células de baixa NSP (Figura S7E). Como temos mostrado que ABCG2
células oi SP podem dar origem tanto a células NSP (Figura S7F) e
células de baixa NSP têm níveis muito baixos de Perk, a supressão de ABCG2
baixa de células NSP ABCG2 SP e CFE parece ser indireta através dos efeitos do U0126 no ABCG2
células SP hi. De nota, a inibição preferencial das colónias maiores, mais indicativo do crescimento CSC, foi visto que a presença de colónias ≥3mm foi inibido completamente em 10
-6 M (Figura 5C). Estes dados mostram que o ABCG2
fracção SP oi é, pelo menos em parte, mantida por via de MAPK /ERK, que por sua vez, mostrámos para manter os ABCG2
células de baixa NSP.
Expressão de ABCG2 na clínica do cancro de bexiga se correlaciona com Grade, Palco, recorrência e de progressão Sobrevivência livre e Expressão pERK
Para determinar o significado clínico da nossa
in vitro
e
in vivo
resultados de linhas de células, foi investigada a expressão de ABCG2 em secções de cancro da bexiga humano. As secções de tecido a partir de um painel de 148 NMIBC (Tabela S2 ilustra características clínicas) foram processados para imuno-reactividade para ABCG2 (Figura 6A). positividade ABCG2 foi detectada em 143 (97%) casos, e para comparação, uma secção de urotélio normal é incluído, o que demonstra uma maior intensidade de expressão ABCG2 basal, que está de acordo com a evidência emergente para uma célula-tronco basais [32]. Pontuações médias de intensidade de imunocoloração para ABCG2 foram mostrados para ser associado com a fase precoce invasiva, PTA (n = 87) versus pT1 (n = 61), e o aumento do grau do tumor, de baixa qualidade (n = 93) em função do grau elevado (n = 55) (p 0,05) (Figura 6B). Mediano de acompanhamento foi de 59 meses (intervalo inter-quartil = 48.3-96.3 meses), e 31 casos (21%) apresentaram recorrência da doença e 23 casos (16%) apresentaram progressão da doença. Correlações com tempo de recorrência e sobrevida sem progressão (PFS) revelou resultados piores associados com o aumento da expressão ABCG2 como ilustrado com curvas de Kaplan-Meier e Log-Rank análises (p 0,001) (Figura 6C). Estas correlações manteve-se estatisticamente significativa quando estratificada por grau, palco e presença de CIS (p 0,001). Usando Cox análise multivariada, que incluiu as variáveis de classe, palco e intensidade da imunomarcação ABCG2, revelou que a expressão ABCG2 permaneceu um preditor independente de progressão da doença (p 0,001; RR = 5,1; IC95% = 2,6-9,9). Além disso, o aumento da expressão pERK também foi associado com piores resultados (log-rank p = 0,001) (Figura 6D). Além disso, uma correlação positiva foi demonstrada entre ABCG2 e expressão pERK (p = 0,005, r de Pearson = 0,99) (Figura 6E).
Discussão
Os recentes avanços no isolamento e caracterização de CSCs putativos proporcionaram conhecimentos interessantes para a base de carcinogénese e levou ao aumento optimismo para o desenvolvimento da terapia do cancro orientada de forma mais eficaz. Estudos têm apresentado dados convincentes que demonstram que um número de cancros humanos seguir o modelo de CSC, por meio de que uma pequena subpopulação de células dentro de um tumor é capaz de iniciação do tumor e responsável pelo crescimento do tumor e a recorrência [8], [9]. A existência de células de tumor com o aumento potencial de iniciar foi recentemente descrito no cancro da bexiga humano [33] – [35] e SP tem sido demonstrada em amostras de pacientes de cancro da bexiga [19]. Neste estudo, caracteriza CSCs bexiga utilizando SP e explorou sua modulação por via de MAPK /ERK sinalização.
Em busca de uma hierarquia CSC no cancro da bexiga humana, os nossos
in vitro
estudos mostraram ABCG2
oi células SP mostrou um aumento de três vezes na colónia eficiência formando. Estes dados foram confirmados por nossos
In vivo
estudos em que ABCG2
oi células SP foram tumor iniciando em comparação com ABCG2
células de baixa NSP que apresentavam perda de crescimento do tumor em 1 × 10
3 diluição célula. Estas observações destacar o enriquecimento de CSCs dentro dos ABCG2
seleções oi SP. transplantes de série subsequentes seria mais apoiar uma relação hierárquica CSC nestes tumores. No entanto, temos tido uma abordagem análoga realizando seleções série e
in vitro
culturas de ABCG2
oi SP e ABCG2
baixas culturas NSP demonstrado a capacidade de ABCG2
oi células SP para repovoar o espectro fenotípica original da linha celular RT112 pai. Serial selecções de ABCG2
células de baixa PNS foi enfraquecimento no potencial para regenerar ambas as populações de diluição, indicando a capacidade para seleccionar ou gerar CSCs.
ABCG2 foi demonstrado que é o principal determinante molecular do fenótipo SP [26]. De fato, encontramos o SP de NMIBC RT112 e as células RT4 tiveram maior expressão de mRNA ABCG2, foi completamente revogada pelo inibidor específico-ABCG2 FTC e continha o top 5% de ABCG2
hi células que expressam. Correlação com os resultados NMIBC clínicos revelou ABCG2
oi imunocoloração para ser associado com piores desfechos clínicos de recorrência e progressão do câncer, indicando um papel para CSCs no desenvolvimento de cancro da bexiga. Curiosamente, a SP de linha celular de MIBC J82 teve maior expressão de P-glicoproteína e foi inibida pelo verapamil, um inibidor da P-glicoproteína-specific. Os níveis de ARNm da glicoproteína-P foram encontrados como sendo elevados em tumores de bexiga de alto grau [36]. Além disso, a patologia molecular de NMIBC é distinta da MIBC [20].