Abstract

osso células-tronco mesenquimais derivadas da medula (MSCs) são capazes de migrar para tumores, onde promovem tumorigênese e câncer metástase. No entanto, o fenótipo molecular das MSCs recrutados no microambiente do tumor e os programas genéticos subjacentes ao seu papel na progressão do câncer permanece em grande parte desconhecido. Ao utilizar um sistema de co-cultura navio parede rotativo tridimensional em que MSCs humanas foram cultivadas isoladamente ou em contacto estreito com linhas de células LNCaP, C4-2 ou câncer de próstata PC3, estabelecemos

em

in vitro

pares de derivados normais e associados ao câncer MSC para estudar a resposta estromal de MSCs ao câncer de próstata. Observamos que MSCs cancro da próstata associado adquiriu um maior potencial de diferenciação adipogênica e exibiu uma forte capacidade de promover a migração de células de câncer de próstata e invasão comparação com MSCs normais tanto

in vitro

e em modelos animais experimentais. A adipogénese reforçada e as propriedades pró-metastáticos foram conferidas pelos elevados níveis de secreção de IL-6 por MSC associados a cancro e eram reversíveis por funcionalmente inibição de IL-6. Descobrimos também que a IL-6 é um gene alvo direto para o microRNA let-7, que foi regulada negativamente em MSCs associados ao câncer. A sobre-expressão de let-7 através da transfecção de let-7 precursores diminuiu expressão de IL-6 e reprimiu a actividade potencial e de promoção da metástase adipogénica de MSC associados a cancro, o que foi consistente com a inibição de IL-6 a actividade da luciferase 3’UTR . Por outro lado, o tratamento de MSC com normais let-7 inibidores resultou em efeitos semelhantes aos observados com a IL-6. Tomados em conjunto, os nossos dados demonstram que as MSCs de co-evoluir com células de cancro da próstata no microambiente tumoral, e a regulação negativa da let-7 pelo MSC-cancro associado regula positivamente a expressão de IL-6. Esta regulação positiva desencadeia adipogênese e facilita a progressão do câncer de próstata. Estas descobertas não só fornecer importantes insights sobre a base molecular das interações tumor-estroma, mas também abrir caminho para novos tratamentos para câncer de próstata metastático

Citation:. Sung SY, Liao CH, Wu HP, Hsiao WC, Wu IH, Jinpu, et ai. (2013) Perda de let-7 microRNA regula positivamente a IL-6 em células mesenquimais-tronco derivadas da medula óssea desencadeando uma Reactive Estromal Resposta ao câncer de próstata. PLoS ONE 8 (8): e71637. doi: 10.1371 /journal.pone.0071637

editor: Ching-Ping Tseng, Chang Gung University, Taiwan

Recebido: 18 de abril de 2013; Aceito: 30 de junho de 2013; Publicação: 19 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Sung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações NSC 101-2314-B-039-007, NSC 99-2320-B-039-029-MY3 e NSC 99-2632-B-039-001-MY3 do Conselho Nacional de Ciência, em Taiwan, conceder DOH102 -TD-C-111-005 do Departamento de Taiwan da Saúde ea Fundação Universidade Cancer via Sinf do MD Anderson Cancer Center, nos EUA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o osso é o segundo local mais comum de metástase de câncer humano [1], e também contribui diretamente para a mortalidade por câncer de próstata e morbidade, com mais de 85% dos pacientes que morrem de câncer de próstata têm metástases ósseas [2] , [3]. A qualidade de vida de pacientes com câncer de próstata pode ser significativamente comprometido por metástases ósseas através do desenvolvimento de dor óssea, fraturas ósseas associadas a cancro e compressão da coluna vertebral, osso de metástases evocadas neuropatia craniana da base de síndromes crânio, anemia e infecção [4] [5]. Apesar das complicações graves de cancro da próstata metástases esqueléticas, tem havido poucos avanços na área terapêutica para prevenir ou diminuir as lesões [6]. É fundamental que uma sólida compreensão da fisiopatologia do processo metastático esquelético câncer de próstata é desenvolvido para fornecer a base para a criação de estratégias para impedir ou diminuir a sua ocorrência e complicações associadas.

A investigação mostrou que a tumor-microambiente interações são cruciais na oncogênese e progressão do câncer, como descrito pela primeira vez em 1889 por Paget que propôs que a semeadura de células cancerosas metastáticas depende do microambiente do órgão host (o conceito “semente e solo”) [7]. Embora a maioria das células hospedeiras no estroma possuem determinadas capacidades-supressora de tumor, progressão de carcinomas de tumores malignos de alto grau é acompanhada por profundas mudanças histológicas no estroma associado ao tumor. Estas alterações incluem estromal mudança fenotípica celular, a remodelação da matriz extracelular e indução da angiogênese [8], [9]. O desenvolvimento de um microambiente estromal alterada em resposta ao carcinoma é uma característica comum de muitos tumores e é susceptível de promover a tumorigénese. Durante o processo de invasão do cancro da próstata, por exemplo, células de cancro epitelial têm a capacidade de promover a chamada resposta de estroma “reactivo” através da transdiferenciação de fibroblastos normais para o fenótipo de miofibroblastos reactivo. Ao contrário de fibroblastos normais, miofibroblastos reativas conduzir mudanças mais genéticos e expressão de genes em células de câncer de próstata, permitindo o crescimento e sobrevivência do tumor e disseminação para órgãos distantes, com efeitos letais [10] – [13]. Gene perfil de expressão de amostras clínicas revelaram alterações genéticas simultâneas e independentes nas células epiteliais do estroma e câncer [14], [15], confirmando a co-evolução de respostas celulares de cancro e estromais. clínicopatológicos estudos também têm demonstrado um papel crítico para a estroma reactivo no resultado pós-operatório de pacientes [16] – [18]. A comunicação intercelular intrincado entre os elementos epiteliais e estromais sugere a importância das vias de epigenética na facilitação da progressão do cancro da próstata, em vez de um processo directo simplesmente atribuído a células cancerosas por si só.

Em modelos de rato, bem como em seres humanos têm relatado que as células estromais de tumor podem ser derivadas de células progenitoras derivadas de medula óssea que podem ser mobilizadas para a circulação, migram para tumores, incorporar no microambiente tumoral, e contribuir para o crescimento de vários tumores [19] – [21]. Osso células estaminais mesenquimais derivadas da medula (MSCs) são células precursoras mesenquimais multipotentes que contribuem para a manutenção e regeneração de uma variedade de tecidos conjuntivos, incluindo osso, tecido adiposo, cartilagem, músculo e [22]. Recentemente, as MSCs que circulam foram mostrados para integrar e persistem no estroma do tumor [23], proporcionando uma plataforma para novos selectiva

In vivo

entrega de agentes anticancerosos a tumores invasivos e metástase [24] – [27] . As interacções entre o MSC e células tumorais não estão limitados a homing mas também parecem induzir efeitos mais adversos. Muitas observações indicam que, no microambiente tumoral, as MSCs têm várias funções que promovem o crescimento tumoral, incluindo a expressão de factores de crescimento [28], a promoção da formação de vasos de tumores [29] e a criação de nichos de células estaminais do cancro [30]. No entanto, o fenótipo molecular das MSCs recrutados no microambiente do tumor e os programas genéticos subjacentes à sua propriedade na progressão do cancro continua a ser principalmente desconhecido. Entender como MSCs recém-contratados são alterados durante a progressão do tumor e como elas influenciam reciprocamente progressão neoplásica pode levar ao desenvolvimento de novas terapias destinadas a reduzir a formação de metástases.

No presente estudo, nós nos concentramos em definir se MSCs da medula óssea “co-evoluir” com células epiteliais de cancro da próstata através da interação tumor-estroma recíproco. Os mecanismos moleculares papel e específicas das MSCs reativas na progressão do câncer de próstata também foi elucidada.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Os estudos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da China Medical University (IACUC # 101-76-N). Todos cirurgia foi realizada sob Zoletil (tiletamina-zolazepam) anestesia a uma dose de 20 mg /kg por injecção intraperitoneal. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

linhas celulares e Cultura de Células

Todos os meios de cultura de células e reagentes foram adquiridos a Invitrogen (Carlsbad, CA). As linhas de células de cancro de próstata LNCaP, C4-2 e PC3 foram usadas em estudos anteriores [13], [31] e cultivadas em meio suplementado com T 5% de soro fetal de bovino (FBS). MSC de osso humano derivadas da medula (hMSCs) e as células epiteliais da próstata humana normais (PrEC) adquiridos a partir de Lonza (Rockland, ME) foram mantidas em MSCGM ™ e PrEGM ™, respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante (Lonza). A linha celular de MSC derivadas de medula óssea humana 3A6 [32] foi mantida em meio DMEM-LG, suplementado com 10% de FBS. Para co-cultura tridimensional (3-D), 1 × 10

7 3A6 células foram cultivadas isoladamente ou misturado com um número igual de células LNCaP, as células PC3 C4-2 ou num recipiente de parede rotativa sistemas (RWV) (Synthecon, Houston , TX), seguindo o protocolo estabelecido anteriormente [33], com ligeira modificação. Resumidamente, a suspensão de célula única foi adicionado aos recipientes que foram então cheias com 10 ml de meio composto por meio de T e DMEM-LG (01:01). A rotação dos vasos foi inicialmente regulada para 15-20 rpm e, em seguida, aumentada para manter agregados de células em suspensão livre. O meio foi trocado a cada 3 dias. Para isolar células 3A6 de tumoroids quiméricas 3-D, os agregados celulares foram colhidas a partir do RWV e dissociados com tripsina a 0,25% após 2 semanas de co-cultura. 3A6 células foram seleccionadas por selecção de antibiótico com 800 ug /ml de G418 durante 1 semana.

A diferenciação das MSCs

3A6 MSC células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 10

4 células /cm

2 para a indução da diferenciação osteogénica e adipogênica sob condições de cultura específicas. Para a diferenciação osteogénica, as células foram cultivadas em meio de diferenciação osteogénica composto de DMEM-LG com FBS a 10%, 10 nM de dexametasona, 50 ug /ácido ascórbico ml, e 10 mM de β-glicerofosfato durante 14 dias e, em seguida, submetido a Vermelho de Alizarina S coloração, como previamente descrito [32]. Para a diferenciação adipogênica, as células foram cultivadas em meio de diferenciação adipogênica composto por DMEM-LG, suplementado com 10% de FBS, 100 nM de dexametasona, mM de 3-isobutil-1-metilxantina 0,45, 10 ug /ml de insulina, e 50 ug /ml de indometacina para o 21 dias, e, em seguida, submetido a Oil Red O coloração. A formação de adipócitos foi monitorizada pelo aparecimento de gotículas lipídicas sob um microscópio. Para quantificar a coloração, Oil Red-O foi extraída com isopropanol contendo 4% de Nonidet P-40 e medida como absorvância a um comprimento de onda de 510 nm. Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

-PCR quantitativo em tempo real

O ARN celular total e enriquecido espécies de ARN pequenas que contenham microARN (miARN) foram isolados a partir de cultura células utilizando o kit de isolamento miRvana miARN (Ambion, Austin, TX) seguindo o protocolo do fabricante. O ADNc foi sintetizado a partir do ARN enriquecido pequena e o ARN total recozido com haste-laçada iniciadores de transcrição (RT) e iniciadores aleatórios, respectivamente, e a transcrição reversa com transcriptase reversa de MMLV reverso (Invitrogen). Quantitative PCR foi realizada utilizando o kit TaqMan LightCycler mestre 480 com miRNA- ou iniciadores específicos do gene e a correspondente sonda universal Sonda biblioteca (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha). Os iniciadores de haste-laçada temperatura ambiente, os iniciadores de PCR e sondas foram desenhadas e as sequências são mostradas na Tabela S1. A reacção de PCR em tempo real foi realizado de acordo com as instruções do fabricante, e foi descrito num estudo anterior [34]. U6 pequeno RNA nuclear e proteína de choque térmico de 90 kDa 1, beta (HSPCB) foram utilizados como genes de limpeza para normalizar a expressão de cada miRNA e gene, respectivamente.

citocinas Antibody matriz e ELISA

os níveis de várias citocinas em meio condicionado de expressão foram medidos utilizando uma matriz de anticorpo humano de citocinas C Série kit 2000 (RayBiotech, Norcross, GA), tal como previamente descrito [27]. interleucina 6 humana (IL-6), os níveis da proteína no meio condicionado foram quantificadas utilizando kits de ELISA comerciais (eBioscience, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Oligonucleótido Transfecção

3A6 células eram semeadas a 2 x 10

5 placas células /poço em 6 poços e incubadas durante a noite. As células foram transfectadas quer com pré-miARNs (controlo negativo pré-miR e pré-miR-deixou-7c) (Ambion, Austin, TX), ou os inibidores de LNA ™ miARN (controlo negativo anti-miR e anti-miR-let-7 ) (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) numa concentração final de 10 nM ou 30 nM, respectivamente, utilizando o reagente de transfecção DharmaFECT (Dharmacon, Lafayette, CO) de acordo com as instruções do fabricante.

vectores repórteres de Ensaio da luciferase e

os oligonucleótidos do elemento de reconhecimento putativo deixou-7c, quer de tipo selvagem ou a sequência mutante, nos nucleótidos 316-322 da região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) da IL-6 humana do gene foram concebidos com flanqueando os locais HindIII e Spel e sintetizados. Após a hibridação dos oligonucleótidos sentido e anti-, os fragmentos de DNA resultantes foram clonadas no vector PMIR-report-Luc (Ambion), após digestão com HindIII e Spel. Os plasmídeos resultantes PMIR-report-Luc foram misturados com pCMV-β-gal (galactosidase) a uma razão molar de 05:01 e foram co-transfectadas com o pré-miARNs em células HEK 293. Após 24 h de incubação, prepararam-se os extractos celulares e para a luciferase de β-gal ensaios de actividade, usando o sistema de ensaio de luciferase e β-galactosidase Enzyme Assay System (Promega, Madison, WI). A actividade luciferase relativa foi calculada dividindo-se as unidades de luz relativas luciferase pelo valor correspondente para a atividade β-gal presente em cada amostra.

In vitro

migração e invasão Ensaio

3A6 hMSCs ou derivados (2 × 10

5 células) foram cultivadas na câmara inferior de transwells isento de soro com meio RPMI-1640 (Invitrogen). Após 24 h de incubação, as células cancerosas 2 × 10

5 próstata em isento de soro RPMI-1640 foram adicionadas à câmara superior contendo um filtro de policarbonato de 8 mícrons de poros que foi revestido com (invasão) ou sem (migração) Matrigel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Após 16 h de incubação, as células na superfície inferior da membrana foram coradas com violeta de cristal e contadas sob um microscópio Zeiss Axiovert 200 fluorescente (Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY) com uma objectiva de 10x.

Estudos em Animais

Seis semanas de idade camundongos nu masculina (BALB /cAnN.Cg-Foxn1nu /CrlNarl) foram obtidos a partir do animal Centro Nacional Laboratory (Taipei, Taiwan). 1 × 10

6 células PC3, quer sozinhos ou misturados com igual número de 3A6

RWV ou 3A6

células PC3 em 100 ul de PBS, foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos (

N =

10 em cada grupo). as medições de volume de tumor foram colhidas semanalmente. Os ratos foram sacrificados 10 semanas após a inoculação de células e tumores foram animado para exame histopatológico.

Imunohistoquímica

proteína específica foi detectada em secções de tumor usando um Sistema de Detecção de Polymer Novolink (Leica Microsystems, Newcastle Upon Tyne , UK) seguindo as instruções do kit, como descrito anteriormente [35]. Os anticorpos monoclonais de ratinho contra Ki-67 e CD31 foram adquiridos da Leica Microsystems e diluída 1:100 e 1:200, respectivamente. Para detectar os lípidos, as lâminas de tecidos foram desidratados com absoluta propileno glicol durante 5 min e corados com uma solução de vermelho de óleo de 0,5% de O durante 48 h. As secções de tecido foram contra-coradas com hematoxilina.

Análise Estatística

Todos os dados são apresentados como a média ± SD salvo indicação em contrário. Diferenças entre os grupos foram analisadas usando o Student bicaudal

t

-teste ou one-way ANOVA para comparações múltiplas. A

p

-valor menor que 0,05 foi definido como estatisticamente significativo.

Resultados

Criação de pares combinados de normal e MSC Cancer-associado da quimérico próstata Tumoroids Sob 3- D RWV Condições

de acordo com vários relatórios anteriores que MSCs possuem capacidade migratória preferencial intrínseca a alguns tumores epiteliais, demonstramos a capacidade de migração de MSCs derivadas da medula óssea humana para células cancerosas da próstata, mas não é normal células epiteliais da próstata em um

in vitro

modelo de células co-cultura (Fig. 1A). Para melhor compreender se as MSC derivadas de medula óssea humana recrutados “co-evoluir” com células de cancro da próstata no microambiente tumoral, uma linha celular imortalizada humana MSC 3A6 [32] foi cultivado sozinho ou com LNCaP dependente de androgénios, o androgénio-independente C4-2 Sub-linha, ou PC3 metastática óssea células cancerosas da próstata em condições de cultura RWV 3-D previamente estabelecidos, recapitulando a

in vivo

tumor microambiente [13]. Descobrimos que as células, quer em monocultura ou em condições de co-cultura, formaram 3-D-agregados de esferas como espontaneamente (Fig. 1B). Notavelmente, enquanto 3A6 coculturing com células LNCaP (3A6 /LNCaP) ou C4-2 (3A6 /C4-2) formados agregados maiores do que a monocultura 3A6 (3A6 /3A6), um número significativamente reduzido e o tamanho dos agregados foram observados no cultivo grupo de 3A6 e PC3 (células 3A6 /PC3). Para identificar os tipos de células que estão presentes nos agregados, alguns dos agregados celulares foram submetidos a análise histomorfológica. coloração intensa do núcleo celular rico em cromatina (Figura 1C;. H E) e a imunorreactividade positiva do epitelial marcador de células de E-caderina (Fig 1C;. IHC) foram detectados em agregados colhidas a partir de 3A6 /LNCaP, 3A6 /C4- 2 e 3A6 grupos de cultura /PC3, mas não em agregados de 3A6 células cultivadas sozinho. Este achado confirmou o crescimento 3-D de tumoroids quiméricas constituídas por células de câncer de próstata e MSCs sob estas condições co-cultura.

(A) de resposta migratória de MSCs humanas ao meio, as células normais da próstata epiteliais (Prec) e de próstata linhas celulares de cancro (DU145, PC3 e LNCaP). células que migraram através da membrana de transwells foram coradas com violeta de cristal 8 h após o plaqueamento de células. A superfície inferior da membrana foi fotografado (100x), e uma imagem representativa de cada condição é mostrada na parte superior. Os dados quantitativos são representados como a média ± DP do número de células por campo de alta potência (100X) em experiências em triplicado. (B) macroscópica (superior) e visão microscópica (parte inferior) de agregados celulares em condições de cultura 3-D RWV de 3A6 células sozinho (3A6 /3A6) ou misturado com LNCaP (3A6 /LNCaP), C4-2 (3A6 /C4 2) ou PC3 (3A6 /PC3) células. (C) Detecção de componentes celulares mistos nos 3-D tumoroids próstata cultivadas por H E e coloração imuno-histoquímica da caderina-E (E-Cad) nas seções agregadas celulares

Nós ainda mais isolado. as células 3A6 de agregados de monocultura e cada um dos tumoroids próstata quiméricos (3A6 /LNCaP, 3A6 /C4-2 e 3A6 /PC3). Os resultantes 3A6 derivativos que representam as linhas de células geneticamente relevantes normais MSC e próstata associados ao câncer MSC foram designados como 3A6

RWV e 3A6

LNCaP, 3A6

C4-2 e 3A6

PC3, respectivamente. A pureza destes derivados 3A6 foi confirmada avaliando marcadores de superfície MSC, incluindo CD105, CD166, CD44 e CD29. Não houve diferenças significativas nos níveis de expressão foram encontrados em comparação com as células 3A6 parentais que foram cultivadas em placas de plástico de entre todas as passagens 15 (Figs. 2A, 2B e na Tabela S2). A ausência de contaminação de células do cancro da próstata também foi demonstrada pela ausência de E-caderina células que expressam (Fig. 2C). Estas linhas de células normais e emparelhados associados a cancro da próstata MSC foram usadas para posterior caracterização.

(A) análise de citometria de fluxo de antigénios de superfície celular de 3A6 parental e os seus derivados isolados a partir de 3-D agregados de células cultivadas RWV. Os histogramas exibir os perfis de fluorescência de 3A6 derivados coradas com anticorpos contra os antigénios indicados e o respectivo anticorpo de controlo do isotipo (linha preta). Os níveis de antigénios individuais de expressão foram quantificadas como a razão entre a fluorescência de canal médio do anticorpo de controlo e o anticorpo específico. As barras de erro indicam SD de medições em triplicado. (B) Análise de imunotransferência da expressão de CD105 nos derivados de 3A6. Os níveis de proteína EF1-α são mostrados a variar em quantidades de carga. (C) análise de citometria de fluxo do marcador E-caderina epitelial em 3A6 derivados e seus parceiros de co-cultura correspondentes de linhas celulares de cancro da próstata. linhas pretas representam controlos isotípicos.

Prostate Cancer influencia o Compromisso Lineage de MSCs osso Barrow-derivadas após o contato Coculture

Em primeiro lugar, investigou se o câncer de próstata tem o potencial para dirigir os destinos de diferenciação do osso MSC derivadas da medula após o contato físico a longo prazo. Nós descobrimos que 3-D cultivadas 3A6 derivados, independentemente de se eles foram isoladas de agregados celulares homotípicas ou tumoroids próstata quiméricos, mantido propriedades MSC e foram capazes de se diferenciar em osteoblastos e adipócitos em cima da cultura na mídia diferenciação adequada (Fig. 3) . No entanto, um aumento da tendência para a diferenciação adipogênica, o qual foi indicado pela acumulação de lípidos aumentada (Fig. 3A, a fig. S1A) e maior expressão de específicos de adipócito marcadores de adiponectina (AdipoQ) e proteína de desacoplamento 1 (UCP1) (Fig. 3B) foi encontrada em todos os três derivados 3A6 associados ao câncer com indução supremo visto em 3A6

PC3, quando comparado com 3A6

RWV ou parentais células 3A6 normais. Por outro lado, embora Alizarina coloração S vermelho para mineralização da matriz (Fig. 3C, a Fig. S1B) concomitante com genes específicos de osteoblastos fosfatase alcalina (ALP) e osteocalcina (OC) (Fig. 3D) expressão mostrou um pequeno aumento do actividade osteogénica de derivados de 3A6 associados ao câncer, uma tendência inversa entre osteogênico e diferenciação adipogênica foi encontrado entre estas linhas celulares. Não houve diferença significativa na taxa de crescimento entre 3A6

RWV e derivados de 3A6 associados ao cancro (Fig. S2), que se pode descartar a possibilidade de que o potencial de diferenciação alterado é uma consequência da capacidade de proliferação alterada das células.

3A6 derivados foram cultivadas em osteogénico ou médio adipogênica para avaliar a sua capacidade de diferenciação multilinhagens. células 3A6 parentais crescidas na ausência de meio de diferenciação (-DM) foram utilizadas como o controlo não-induzidas. coloração representativas de (A) coloração com óleo vermelho O para determinar o teor de gotículas de lípidos após 21 dias de diferenciação e (C) vermelho de alizarina S para detectar a mineralização óssea após 14 dias de cultura em meio osteogénico-indução. Ampliação: 100x. (B) Análise de qRT-PCR da expressão de marcadores comum adipogénese e genes marcadores (D) osteoblastos. Os valores são expressos como quantidades de ARNm normalizados em relação ao gene de manutenção HSPCB, e as barras de erro representam DP de três experiências independentes. *

P Art 0,05; **

P

. 0,001 entre 3A6 normais

RWV e derivados 3A6 associados ao câncer

MSCs associados ao câncer exercer uma maior capacidade de Aceleração do Crescimento do cancro da próstata e progressão de MSCs normais

a seguir, analisados ​​e comparados o efeito biológico correspondente ao potencial pró-metastático de 3A6 normal com 3A6 associado a um cancro no cancro da próstata. A capacidade migratória e invasiva de LNCaP, C4-2 e células cancerosas da próstata PC3 em resposta a sugestões do 3A6 associado a um cancro correspondente

LNCaP, 3A6

C4-2 e 3A6

PC3, respectivamente, ou o 3A6

células RWV normais, foi avaliada através de ensaios de câmara de Boyden. Como mostrado na Figura 4, todos os três derivados de 3A6 associados ao cancro exercida significativamente maiores efeitos pró-metastáticos através da promoção da migração de células de cancro da próstata (Fig. 4A) e invasão (Fig. 4B), com um aumento médio de 2 e 3 vezes na número de células movem-se para a câmara de fundo, respectivamente, quando comparada com a de 3A6

RWV células normais.

Migração (a) e (B) a invasão das células cancerosas da próstata normais indicados para a 3A6

RWV e os derivados de 3A6 associados ao cancro correspondentes foram analisados ​​por ensaio Transwell após 8 h e 20 h de incubação, respectivamente. Os dados estão representados como a média ± DP do número de células por campo de alta potência (100X) em experiências em triplicado. **

P Art 0,001. A imagem representante de cada condição é mostrada na parte inferior.

Para validar ainda mais o comportamento avançado de promoção do tumor de MSCs associados ao câncer de câncer de próstata

in vivo

, nós injetado subcutaneamente PC3 células sozinho ou misturado com qualquer 3A6 normais

RWV (3A6

RWV /PC3) ou 3A6

células PC3 associados ao câncer (3A6

PC3 /PC3) em ratinhos nus e avaliaram o impacto da 3A6 células em tumores PC3. Num estudo paralelo, 3A6

RWV e 3A6

sup células PC3 foram injectados por si só, e o resultado confirmou a propriedade de não tumorigénica 3A6 derivados (dados não mostrados). Embora ambos 3A6

RWV e 3A6

PC3 não teve efeito sobre o crescimento de células PC3

in vitro

(Fig. S3), foi observado um aumento significativo do volume do tumor em 3A6

PC3 /PC3 mas não 3A6

xenotransplantes RWV /PC3 (Fig. 5A). A maioria dos tumores PC3 na ausência de 3A6 permaneceu circunscrito, ao passo que os tumores PC3 crescido juntamente com 3A6

RWV ou 3A6

PC3 exibido um padrão de crescimento infiltrativo, com invasão do estroma circundante e músculo subjacente (Fig. 5B, H e). As células tumorais altamente proliferativas e invasivos foram confirmadas por Ki-67 e foram associados com alta densidade de microvasos (Fig. 5B, CD31). Estas características invasivas são mais obviamente visto nas 3A6

xenoenxertos PC3 /PC3. Notavelmente, um dos 10 ratinhos que receberam o 3A6

PC3 /xenoenxertos PC3 desenvolveram metástases do pulmão (Fig. 5C), enquanto não há metástases foram observadas tanto no grupo com tumores de células PC3 sozinhos ou aqueles com células PC3 misturado com o normal 3A6

células RWV. Além disso, de acordo com o

in vitro

encontrar que os derivados de 3A6 associados ao câncer têm maior potencial de diferenciação adipogênica de 3A6 normais

RWV, Oil O vermelho coloração revelou um aumento da quantidade de acúmulo de lipídios nas secções de tumor de 3A6

PC3 /PC3 comparada com a de 3A6

RWV /PC3 (Fig. 5B, Oil red O).

ratinhos nus foram implantados subcutaneamente com células de cancro da próstata PC3, quer sozinho (PC3) ou misturado com 3A6 normais

RWV (PC3 + ​​3A6

RWV) ou 3A6 associado a um cancro

células PC3 (PC3 + ​​3A6

PC3) no flanco (

n = 10

para cada grupo). cinética de crescimento do tumor (A) foram medidos ao longo de 10 semanas de seguimento e são apresentados como as mudanças de dobragem em comparação com a semana 1 depois da implantação de células. *

p Art 0,05 em relação grupo controle PC3. (B) do painel Representante da histológica H E coloração, coloração imuno-histoquímica para o marcador CD31 proliferação celular marcador ki-67 e vascular, e coloração O vermelho óleo para vacúolos lipídicos (vermelho) de secções de tumores subcutâneos. metástases (C) pulmonares observados por histológica H E de coloração de secções de tecido (40x) de 3A6

PC3 animais PC3 co-inoculado. área do tumor foi circulada e indicado.

IL-6 Contribui para a Reactive estroma fenótipo das MSCs associada ao cancro

Para identificar os fatores candidatos responsáveis ​​pelas atividades do estroma reativas de câncer associado MSCs, matrizes de anticorpo citocina humanos foram usados ​​para comparar os perfis de expressão de citocinas de meio condicionado coletados de 3A6 normais

RWV e

LNCaP, 3A6

C4-2 e 3A6

células PC3 associados ao câncer 3A6. Entre 174 citocinas foram testados, IL-6, foi significativamente maior em todos os três dos derivados de 3A6 associadas a cancro, em comparação com 3A6

RWV (Fig. 6A). Os dados quantitativos obtidos a partir de um ensaio ELISA (Fig. 6B) confirmou os níveis de proteína IL-6 elevados em 3A6

LNCaP, 3A6

C4-2 e 3A6

células PC3 que corresponde a um aumento de 145%, 204% e 1,403%, respectivamente, acima da 3A6

RWV (112 pg /ml).

(a) perfil de meio condicionado obtido a partir da expressão de citocinas normais 3A6

RWV e o cancro da próstata -associated 3A6

LNCaP, 3A6

C4-2, e 3A6

PC3 foi analisado usando uma matriz de citocinas Human Antibody C Series 2000. A auto-radiografia de um conjunto de matriz VI contendo IL-6 pontos (rectangular caixas) é apresentada. (B) Detecção quantitativa do nível de expressão de IL-6 pelo ensaio de ELISA. Os dados representam as médias ± DP de determinações em triplicado. (C) resposta quimiotáctica de células PC3 induzidas pela IL-6 recombinante humana (rIL-6). Os dados estão representados como a média ± DP do número de células por campo de alta potência (100X) em experiências em triplicado. *

P Art 0,05, **

P Art 0,001

vs meio sem soro

sozinho.. (D) Inibição da migração das células PC3 para meio 3A6

PC3 condicionado pelo anticorpo anti-IL-6. O meio condicionado a partir de 3A6

sup células PC3 foram pré-tratados com a concentração indicada de anticorpo de ratinho anti-IL-6 e, em seguida, carregada na câmara inferior de transwells. O tratamento com 30 ug /ml de IgG de ratinho (mIgG) foi um controlo negativo. *

P Art 0,05, **

P Art 0,001

vs IgG de rato

.. (E) A indução da adipogénese de 3A6

RWV células por IL-6 humana recombinante, e a inibição (F) da adipogénese de 3A6

sup células PC3 por anticorpo anti-IL-6 na concentração indicada. As células foram coradas com óleo vermelho O para visualizar gotículas lipídicas após 21 dias de incubação. A imagem representativa (100x) de cada condição é mostrada na parte superior. As células coradas foram quantificados usando um método de extração de corante e de dados estão representados como a média ± DP de três experiências independentes. **

P Art 0,001

vs grupo controle IgG de rato

Nós examinou se IL-6 está envolvida na indução da migração de células de câncer de próstata.. por 3A6 associado a um cancro. Descobrimos que exógeno IL-6 humana (rIL-6) induziu uma (6C Fig.) Aumento na migração de células Transwell PC3 dependente da dose. Além disso, o número de células PC3 que migraram para o meio condicionado 3A6

PC3 na câmara inferior foi inibida em 23% e 36%, quando o meio condicionado foi pré-tratada com um anticorpo neutralizante de IL-6 em concentrações de 10 ug /ml e 30 ug /ml, respectivamente (Fig. 6D).

o papel da IL-6 na adipogénese melhorada das MSCs-cancro associado foi também avaliada. 3A6

RWV células normais foram induzidas para se diferenciarem em células com ou sem adipog�icas rIL-6 adicional. *

P Art 0,05; *

P Art 0,05;