Abstract

Alto grau de carcinoma seroso (HGSC) é a forma mais comum e mais mortal de ovário Câncer. No entanto, é em grande parte assintomática em seus estágios iniciais. Estudar a origem ea progressão precoce desta doença é, portanto, fundamental na identificação de marcadores para a detecção precoce e fins de rastreio. À base de tecido de imagem espectrometria de massa (MSI) pode ser empregue como uma forma isenta de análise de mudanças metabólicas localizadas entre tecido saudável e canceroso directamente, no início da doença. Neste estudo, descrevemos os resultados MSI de camundongos

Dicer-Pten

duplo knockout (NSO), um modelo de rato reproduzindo fielmente a natureza clínica de HGSC humano. Usando fatoração de matriz não-negativo (NMF) para a análise sem supervisão de ionização dessorção electrospray (DESI) conjuntos de dados, regiões de tecido são segregados com base em componentes espectrais de uma forma imparcial, com alterações relacionadas com HGSC destaque. Os resultados obtidos através da combinação de NMF com DESI em MSI revelou várias espécies metabólicas elevados no tecido do tumor e /ou em torno quisto cheio de sangue, incluindo as ceramidas, esfingomielinas, bilirrubina, sulfato de colesterol, e várias lisofosfolípidos. Vários metabólitos identificados no estudo de imagem também foram detectados em níveis alterados dentro do soro em um estudo metabolômica anterior do mesmo modelo de rato. Como um exemplo de fluxo de trabalho, características identificadas neste estudo foram usadas para construir um modelo OPLS-DA capaz de discriminar entre ratos NSO com tumores e controles em estágio inicial com uma precisão até 88%

Citation:. Paine MRL, Kim J, Bennett RV, Parry RM, Gaul DA, Wang MD, et al. (2016) Total Reprodutiva Sistema Non-Negative Matrix Factorization Espectrometria de Massa Imagiologia de um em estágio inicial Ovarian Cancer Modelo rato. PLoS ONE 11 (5): e0154837. doi: 10.1371 /journal.pone.0154837

editor: Shengtao Zhou, West China Second Hospital, Universidade de Sichuan, na China

Recebido: 28 Dezembro, 2015; Aceito: 20 de abril de 2016; Publicado em: 09 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Paine et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos imaging arquivos de dados estão disponíveis no banco de dados figshare (https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.3171715.v1)

Financiamento:. Cancer Research Fund ovário concessão (OCRF) Programa de Desenvolvimento de Projetos ( http: //http: //www.ocrf.org) e um Grant Desafio do Rivkin Fundação Marsha (http: //http: //www.marsharivkin.org). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

alto grau de carcinoma seroso (HGSC), um subtipo de câncer de ovário também conhecido como câncer de ovário seroso de alto grau, é responsável por 70% de todas as mortes de câncer de ovário e no entanto a origem ea progressão precoce desta mortal doença ainda é pouco compreendido. [1-4] testes de despistagem de confiança na prática clínica estão actualmente indisponíveis, eo curso assintomático por estágios iniciais da doença tornar a detecção precoce de HGSC extremamente difícil. Consequentemente, a maioria dos casos HGSC ( 95%), e, por extensão, a maioria dos casos de cancro do ovário, são diagnosticados em estágios avançados que levam a taxas de-aproximadamente sobrevida em 5 anos pobres 44,6% para todos os casos diagnosticados durante 2004-2010 [1. , 5-7] no entanto, quando o câncer é diagnosticado cedo e está confinado ao local do tumor primário, a taxa de sobrevida em 5 anos aumenta para mais de 90%. [8] portanto, é imperativo que os métodos de detecção precoce são desenvolvidos para combater ovário a mortalidade do cancro.

a identificação de alterações bioquímicas dentro dos tecidos de início até HGSC de fase tardia poderia proporcionar um meio para a selecção de marcadores que podem ser monitorados de sangue ou de urina para detecção e diagnóstico precoce. Um dos principais desafios associados com esta abordagem, no entanto, é a dificuldade em encontrar pacientes com câncer de ovário em estágio inicial, como estágios iniciais são assintomáticas. mouse modelos recentes de câncer de ovário, com HGSC originários da trompa de Falópio ou ovários, apresentam uma oportunidade única para superar este desafio. [9-11] Quando dois genes críticos são condicionalmente desativada (

Dicer

flox /flox

Pten

Flox /Flox

Amhr2

cre /+), estes () ratos NSO duplo knockout desenvolver HGSCs originou-trompas de falópio, que depois se espalhou para o ovário antes de metástase em toda a cavidade abdominal, causando ascite e levando à morte. [9] em alternativa, os ratinhos duplo-mutante que transportam p53 mutante e

Pten

eliminação produzir HGSCs ovário-originado, bem como não-HGSCs no ovário com trompas de falópio normais. [10] Além disso, os ratos triple-mutantes, (

p53

LSL-R172H /+

Dicer

Flox /Flox

Pten

Flox /Flox

Amhr2

cre /+) que incluem p53 mutante, as mutações mais frequentemente observadas em HGSC humano (~ 97%), também desenvolvem Falópio-tube originou HGSC com o padrão idêntico de metástase como camundongos NSO. Embora ambos os modelos NSO e TKO duplicar igualmente bem a natureza clínica de HGSC humano, o modelo NSO foi também caracterizado ao nível molecular, com NSO HGSC exibindo semelhança molecular para HGSC humano. Portanto, neste estudo foram selecionados camundongos NSO para uma investigação mais aprofundada usando imagens baseada em espectrometria de massa analisa.

Na espectrometria de massa imaging (MSI), espectros de massa são registrados em pontos espaciais discretas em toda a amostra de tecido, levando a datacube uma com um espectro de massa para cada (x, y) do pixel. Bidimensional imagens de cores falsas que mapeiam a distribuição espacial de analitos específicos são criados a partir desses dados. [12] Dois métodos MSI bem estabelecidas que foram aplicados a estudos de câncer são de matriz assistida a laser dessorção /ionização (MALDI), [ ,,,0],13-18] e ionização dessorção electrospray (DESI). [19-25] Especificamente para o cancro do ovário, vários estudos MALDI MSI foram publicados com foco em proteínas e péptidos de identificação de biomarcadores. [26-29] Apenas um relatório por Liu et al investigou o papel potencial de metabolitos usando MSI. [30] neste estudo, as experiências foram dirigidos por MALDI análise do transcriptoma e centrou-se especificamente na detecção de sulfatidos, uma subclasse de glicoesfingolípidos. DESI MSI, por outro lado, apenas foi aplicado ao estudo das alterações de nível molecular observado entre pré- e pós-ovulação, mas não para a detecção precoce do cancro da biomarcador. [31]

Dada a vasta quantidade de informação química gerada em MSI, extraindo as informações mais biologicamente relevante relacionada a um fator específico pode não ser simples, exigindo inspeção visual e comparação de centenas a até milhares de imagens para cada experimento. Para simplificar a análise de dados MSI, a comparação dos espectros a partir de múltiplas regiões ou várias amostras é possível usando seleção de região de interesse (ROI). [32] comparações ROI são simples, com média de espectros obtidos em cada pixel de uma região selecionada, e são melhor adequado para análises histológicas onde as fronteiras são bem definidas. No entanto, nos casos em que os limites histológicos são menos claras ou quando nova hipótese biológica estão sendo gerados, definindo manualmente ROI de pode ser um desafio. Na investigação da progressão da doença em grandes cortes de tecido, por exemplo, marcadores químicos podem ser escassamente distribuídos e em baixas abundâncias, tornando a sua detecção pela seleção ROI difícil.

métodos semi-supervisionado que empregam algoritmos de agrupamento que atribuem automaticamente segmentação mapas de acordo com os padrões de moléculas co-localizado pode ser empregue em tais situações. No entanto, estes métodos ainda dividir os dados em segmentos espaciais discretas e exigir que o usuário inspecionar muitas imagens de íon de indivíduo para confirmar se corresponde com o segmento correspondente. [33] métodos não supervisionado com base em algoritmos estatísticos são, portanto, preferível para a mineração de grande porte, heterogêneo de dados amostras de tecido, que requerem intervenção humana mínima. [34, 35] Tais algoritmos têm sido investigados para análise de conjuntos de dados MSI incluindo análise de componentes Principais (PCA) [36], máxima Autocorrelação Factorization [37], K-means [38] e distorcido C -Means [39] clustering, probabilístico Análise semântica latente [40], e Factorization Non-Negative Matrix (NMF) [41]. A comparação da correlação de Pearson de imagens de componentes de saída contra exemplos de imagens verdadeiras mostrou que de todos estes métodos, NMF apresentou a maior correlação média da imagem. [35] Além disso, por causa do built-in restrições de não negatividade, as imagens do componente NMF são facilmente interpretados e mais adequado para os dados de espectrometria de massa do que outros métodos estatísticos multivariados, tais como PCA. [42, 43]

Aqui nós seguimos em nosso estudo metabolômica soro dos camundongos

Dicer-PTEN

NSO com um estudo DESI MSI do sistema reprodutivo completa do mesmo modelo de rato. [44] DESI MSI análise de dados multivariados foi realizada com uma nova versão do omniSpect [45], agora capaz de lidar com grandes (~ TB) conjuntos de dados MSI. Ao separar os dados MSI para vários componentes NMF via omniSpect, características que representam mudanças metabolômica entre tecidos saudáveis ​​e cancerosas foram prontamente visualizados. O correspondente NMF “componente espectros”, descrevendo essas imagens foram então estudadas, identificando espécies químicas alteradas no microambiente tumoral HGSC, vários dos quais também tinham sido detectados anteriormente no nível sérico. [44]

Materiais e Métodos

Dicer-Pten Double-Knockout (Dicer-Pten NSO) Ratos

Dicer-Pten

NSO (

Dicer

Flox /Flox

Pten

Flox /Flox

Amhr2

cre foram gerados por acasalamento os machos (

Dicer

Flox /Flox

Pten

Flox /Flox

Amhr2

cre /+) com fêmeas (

Dicer

Flox /Flox

Pten

flox /flox). Feminino

Dicer

Flox /Flox

Pten

Flox /Flox (um genótipo não transportar

Amhr2

cre + /) ratos foram usados ​​como controlos. Todos os ratinhos foram obtidos a partir de reprodução in-house no Baylor College of Medicine e foram alojados em um biotério com temperatura controlada de 21 ° C. Eles foram alimentados 5053 irradiado PicoLab Rodent Diet 20 e tinha acesso a água potável fornecida em garrafas.

Dicer

Flox /Flox

Pten

Flox /Flox

Amhr2

cre /+ camundongos NSO utilizados neste estudo desenvolvem ascite como tumores metástase . Uma vez que os ratinhos começam a mostrar sinais de ascite, eles foram monitorizados diariamente. Os ratinhos foram recomendados para a eutanásia quando o volume de ascite atingiu 10% do peso corporal do animal. Todos os ratos utilizados neste estudo (10 no total) foram sacrificados antes de atingir o limite para a eutanásia através de uma inalação overdose de dióxido de carbono para evitar sofrimentos desnecessários, de acordo com o protocolo de animais (AN716) aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal (IACUC) no Baylor College of Medicine.

Preparação de amostras

todo o sistema reprodutivo de ratos NSO (incluindo útero, trompas e ovários) foram excisadas e flash congelado a -80 ° C. O tecido excisado intacto foi incorporado em uma solução aquosa de gelatina (10% w /v) e carboximetil celulose (5% w /v) e congeladas a -80 ° C. blocos de tecido embebido foram colocados na câmara de um crióstato Cryostar NX70 (Thermo Scientific Inc., San Jose, CA, EUA) durante 30 min e depois seccionados a 20 uM espessura tanto com o bloco de corte e bloco de amostra mantida a -20 ° C . As secções de tecido foram montadas em Superfrost degelo Além disso Micro Slides (VWR International LLC., Radnor, PA, EUA) e mantido a -80 ° C até serem analisadas.

Dessorção Ionização por Electrospray-Espectrometria de Massa de imagem

imagens DESI-MS foram adquiridos utilizando uma fonte de iões de costume-construído consistindo de um Omni pulverizador DESI pulverizador (Prosolia Inc., Indianapolis, IN) capaz de ajustes finos utilizando fases manuais e plataformas multi-eixos (Thorlabs, Inc., Newton, NJ). As seguintes variáveis ​​geométricas e experimentais DESI-MS foram otimizados para o experimento de imagem: altura do pulverizador de ponta acima da superfície (5 mm), ângulo de incidência (55 °), distância pulverizador-dica de MS de entrada (15 mm), altura de entrada acima superfície ( 1 mM), spray de solvente (metanol), taxa de fluxo solvente (5 mL min

-1), nebulização de gás (azoto), a pressão do gás de nebulização (100 psi), e a tensão de pulverização (-5 kV) . A entrada do espectrómetro de massa usado foi especificamente concebido para imagiologia DESI-MS e fica saliente de 18 cm a partir da frente do instrumento, permitindo o acesso a superfícies de amostra maiores

.

Enquanto o pulverizador DESI e MS foram realizadas entrada estacionária, a amostra a ser trabalhada foi movido em um “pente” percurso em forma, permitindo que o pulverizador DESI para varredura da superfície da amostra inteira em 2-dimensões utilizando um OptiScan II motorizado estágio do microscópio (Prior Scientific Inc., Rockland, MA), controlada por um programa Labview VI . descrito anteriormente [19, 45] velocidade o palco estava montado para 160 mm s

-1 no

x

-Dimensão com uma etapa de linha de 200 mm na

y Restaurant – dimensão. Os espectros de massa negativo-íon foram adquiridos em um Exactive Além disso espectrômetro de massa Orbitrap (Thermo Scientific, San Jose, CA) durante o intervalo de

m /z

400-1000 no modo centróide depois de optimizar as seguintes variáveis ​​experimentais: massa resolução (17.500 a

m /z

200), alvo de controle automático de ganho (1e

6 íons), microscans por digitalização (2), a tensão é-lens (75 V), tempo máximo de injecção (100 ms), e a temperatura capilar (250 ° C).

Processamento de dados

o arquivo de dados de imagens MS como uma única aquisição, contínua, juntamente com o tempo LabVIEW e arquivos de posição de saída foram enviados para o servidor web-based omniSpect (https://cs.appstate.edu/omnispect).[45] a partir da posição estágio gerado pelo LabVIEW e informações de cronometragem, omniSpect cria um cubo de imagem de linha-a-linha usando espectros de massa coletada no primeiro passar ao longo do caminho em forma de pente. Os espectros de massa de originais são interpolados linearmente dentro de uma grade regularmente espaçados ao longo do eixo-x. [46]

Para espectros recolhidos, omniSpect primeira estima um perfil completo usando um comum logaritmicamente espaçadas

m /z

escala para todas as varreduras e aplicando uma pequena janela Gaussian em torno de cada pico. Utilizou-se um desvio padrão de

m /z

0,001 e uma bin-largura

m /Tablet z 0,0005 em

m /z

850 para estes dados. Em geral, a redução do bin de largura permite que o centro de Gaussian para representar com mais precisão o centro de pico de dados centróide (

i

.

e

., O experimental

m /z

value) com caixas que rodeiam a ser preenchido para acomodar deslocamentos de massa ao longo do experimento. Por conseguinte, o desvio padrão corresponde à variação tolerada deste deslocamento de massa e representa a largura do pico esperado se os dados foram recolhidos em modo de perfil. A precisão dos dados centroided é configurável na versão mais recente do omniSpect (https://cs.appstate.edu/omnispect/) com três configurações predefinidas:

m /z

± 0,1, 0,01 e 0,001. Ao mais alto de precisão, esta abordagem gera cubos de dados com dimensões muito grandes, mas os dados muito esparsas. Por exemplo, os dados MSI ratinho típico produzido um cubo de imagem de tamanho [805 × 59 × 2.556.741], que exigiria 904 GB se armazenados como valores de precisão dupla. Porque apenas 0,06% dos elementos são diferentes de zero, usando um escasso resultados de representação matriz em arquivos que necessitam de menos de 2 GB de memória.

Dado um cubo de dados MSI, modelos NMF cada espectro componente como a combinação linear não-negativo de cada imagem ion componente como a combinação linear não-negativa de imagens de origem espectros de origem e. Por exemplo, a fonte de espectros numa dada amostra de tecido pode pertencem a diferentes combinações de iões ou “componentes”, sendo produzido em vários tipos de tecidos, ocupando cada uma delas diferentes, mas correlacionadas, possivelmente distribuições espaciais. NMF recupera as distribuições espectros componente não-negativo e espaciais, minimizando a diferença entre a modelados e os dados observados.

Primeiro, os dados do cubo 3-D é convertida em uma matriz 2-D por vectorizing as coordenadas de pixel em uma única dimensão. O utilizador selecciona o número de componentes para extrair e NMF estima-los. Entre os muitos algoritmos para NMF, usamos a abordagem dos Mínimos Quadrados (ALS) alternada para minimizar a norma Frobenius [47]: onde V representa a matriz de dados, W representa as imagens do componente e H representa o espectro de massa do componente. Cada coluna da linha W e correspondente de H representa a distribuição espacial e espectros de massa a partir de um componente, respectivamente. Seu produto, WH, representa a combinação linear de componentes que aproxima os dados. O algoritmo começa por inicializar H com valores positivos. Em seguida, ele resolve para o W que minimiza

D Compra de H fixo usando a solução de mínimos quadrados: onde # representa o pseudoinverse Moore-Penrose. Quaisquer valores negativos em W são substituídos com zeros e o processo é repetido para H. Especificamente,

D

é minimizada para o novo valor de W:

Novamente, os valores negativos são substituídos com zeros, e o processo é repetido, alternando entre W e H até a convergência. Depois de estimação, imagens componentes são representados como duas dimensões parcelas de cores falsas e a abundância relativa de íons dentro do espectro estão normalizados para a base de pico dentro do conjunto de componentes NMF. [47]

Análise de Dados

características espectrais de massa do quarto componente NMF foram cruzadas com a lista extraído e curadoria de características espectrais obtidos após a análise UPLC-MS de soro de 14 tumor em estágio inicial camundongos (ET) NSO e 11 controles. [ ,,,0],44] características espectrais UPLC-MS foram extraídos a partir dos dados utilizando software MZmine 2.0 [48] e o alinhamento cromatograma envolvidos, identificação e integração de picos, extracção da área dos picos e normalização após conservação dos matriz de dados. Conservação dos dados consistiu na remoção de sinais que estavam presentes nas amostras em branco, o solvente, ou não estavam presentes em, pelo menos, 50% das amostras de soro. características do espectro de massa de sobreposição entre o componente NMF selecionado ea lista UPLC-MS curadoria foram usadas para construir um modelo para a amostra discriminação de classe via ortogonais mínimos quadrados parciais de análise discriminante (OPLS-DA) usando MATLAB (MATLAB versão 7.13.0, The MathWorks, Natick, MA com PLS_Toolbox v.6.71, Eigenvector Research, Wenatchee, WA).

resultados

Quatro

Dicer-PTEN

NSO ratos na idade de 8 meses foram sacrificados eo órgãos reprodutivos intactas foram recolhidos. Um ratinho exibiu um grande tumor primário com um quisto cheio de sangue, no final de uma trompa uterina e um ovário saudável com um pré- ou cisto não canceroso no outro corno uterino (Fig 1A). Esta amostra foi selecionada para análise MSI como foi a hipótese de que pela imagem do ovário saudável, cisto pré ou não canceroso e tumor madura juntos, poderiam ser feitas comparações espectrais directa entre as diferentes regiões de tecido. Diferindo componentes espectrais detectado, particularmente as localizadas dentro da região do tumor /cisto, poderia, então, ser caracterizada e avaliados quanto ao seu papel biológico ou como potenciais marcadores de doença.

(a) A fotografia de uma secção de tecido fino de um NSO rato sistema reprodutivo descongelamento montado sobre uma lâmina de vidro. (B) Uma única imagem componente NMF representando os dados do modo de iões negativos DESI-MS para o sistema reprodutivo do rato NSO e (c) o espectro NMF correspondente. A imagem corrente total de iões (TIC) para os dados do modo de iões negativos DESI-MS e (e) o espectro de TIC correspondente.

Uma imagem DESI-MS modo de iões negativos foi adquirida (d) a partir de uma secção de espessura de 20 ^ M do sistema reprodutivo completa excisado a partir do ratinho NSO acima mencionado. Fig 1 mostra uma imagem óptica da amostra de tecido junto com a imagem de cores falsas e espectros correspondente tanto para o cronograma total de íons (TIC) eo resultado NMF único componente. Comparação das imagens e espectros de ilustrar o quão perto o algoritmo ALS pode aproximar os fatores cubo de dados e, portanto, o quão bem os resultados NMF representam os verdadeiros dados. As imagens apresentadas na Figura 1B e 1D são semelhantes, mas não idênticas, como NMF aproxima cada espectro nesta imagem de uma versão em escala de um componente de espectro. Regiões da imagem componente NMF que não combinam com a imagem TIC indicar aquelas regiões têm espectros que diferem do espectro de TIC. Por exemplo, a região do tumor /cisto à direita mostra uma intensidade mais elevada na escala de cores falsas na imagem TIC, mas o espectro médio para essa região não é modelado bem pelo espectro “médio” para toda a imagem. Portanto, em comparação, região /cisto do tumor é representado com menor intensidade relativa na escala de cores falsas na imagem NMF único componente. No entanto, os espectros na Figura 1C e 1E são quase idênticos com listas de pico e as abundâncias relativas conservadas. Progressivamente segmentar os dados em dois ou mais componentes utilizando NMF podia, portanto, proporcionar resultados significativos sobre diferenças biológicos relacionados com a progressão da doença, revelando estas diferenças espectrais. Determinar o número ideal de componentes NMF, de modo a modelar verdadeira variância biológica, rejeitando o ruído indesejado, a variação técnica e artefatos é, portanto, fundamental para compreender o nível de informações úteis contidas nesses dados.

Fig 2A e 2C mostram os resultados de dividir o cubo de dados em dois componentes de NMF. A imagem na Figura 2A que se assemelha a da Fig 1B com o pico de base a

m /z 885,5436

dominando o espectro correspondente para as duas imagens. A massa exacta deste pico sugere que corresponde a [MH]

– ião de um fosfatidilinositol (PI) com 38 átomos de carbono no total e 4 duplas ligações totais nas cadeias acilo (Theo [MH]

-;.

m /z

885,5499). Esta espécie lipídica é uma das espécies de lípidos ácidos mais abundantes presentes nas membranas das células de mamíferos e é rotineiramente detectada quando se realiza MSI de tecidos de mamíferos. [49] A diferença mais notável entre as Figs 2A e 1B representa a intensidade de sinal reduzido na Fig 2A dentro do região /cisto tumor. Figura 2C mostra o segundo componente NMF e revela um forte contraste com o primeiro componente FNM, com aumento da intensidade de sinal na região do tumor /cisto e diminuição da intensidade na região de ovário. Figura 2D representa o espectro correspondente para a imagem da Figura 2C, revelando as espécies que contribuem para o aumento da intensidade do sinal na região do tumor /cisto. Três espécies principais foram observadas na figura 2D em

m /z

572,483, 682,589 e 684,595. Para as espécies a

m /z 572,483 e 684,595

, foi observado um pico de M + 2 numa proporção relativa abundância de 3: 1, o que sugere a presença de um átomo de cloro dentro de cada espécie. Para

m /z

682,589, o sinal de M + 2 sobrepõe-se com a espécie em

m /z

684,595. As espécies em

m /z

684,595 tem uma abundância relativa muito maior do que o esperado para o

37Cl isótopo de

m /z

682,589. Portanto, os íons em

m /z

684,595 são atribuídos a uma espécie química separados com possível contribuição de um

37Cl isótopo. Curiosamente, estes três iões também foram detectados em um estudo que investigou extractos de lípidos celulares de linhas de células de tumores de murinos por ESI-MS e foram identificados como o [M + Cl]

– iões de C16, C24: 1 e C24: 0 ceramidas (Théo.

m /z

572,4815,

m /z 682,5911

, e

m /z

684,6067, respectivamente). [50] elevação desses três metabolitos ter sido referida como estando envolvida na apoptose de células dendríticas induzidas por tumor,-regulação para baixo da fosfoinositida 3-quinase (PI3K). [50] ao libertar estes compostos de sinalização imunossupressor, o tumor cria um microambiente favorável através do qual ele pode subtrair-se o hospedeiro de resposta imunitária e proliferar. [51]

as imagens componentes NMF resultantes (a) e (c), e os espectros correspondente (b) e (d) a partir de dividir a-ião negativo aquisição modo DESI-MS para dois componentes NMF. (E) A imagem de TIC a partir do mesmo conjunto de dados que mostram a região de interesse (ROI) selecionada manualmente para o tumor em estágio inicial e as áreas de cistos cheios de sangue (oval vermelho) e (f) o correspondente espectro média do ROI. (G) A imagem TIC que mostra a região de interesse (ROI) selecionados para o site em estágio inicial do tumor somente (oval vermelho) e (f) o correspondente espectro média do ROI.

região-de-interesse (ROI) os espectros a partir do tumor combinada de fase inicial e a região quisto cheio de sangue (Figura 2E) e o tumor de fase inicial, por si só (Figura 2G) foram extraídos a partir do cubo de dados usando um script MATLAB para comparação à imagem componente NMF correspondente. Ao seleccionar manualmente um ROI para uma região específica do tecido, um espectro médio é gerado a partir de espectros para cada pixel no interior da região seleccionada. O segundo espectro NMF componente (Figura 2D) e o espectro de ROI (Figura 2F) partilham um elevado grau de similaridade, com todas as principais iões detectados no espectro de ROI também presentes no espectro componente FNM, embora com pequenas diferenças na abundância relativa . As principais diferenças observadas entre Fig 2D e 2F surgir devido a NMF dando maior ênfase às combinações de espécies detectadas com maiores graus de variação de outras regiões da imagem. Para confirmar que os picos principais identificados na Figura 2D e 2F são, na verdade, presente na região do tumor e não está simplesmente relacionado com as diferenças biológicas entre o sangue e tecido sólido, um espectro de ROI do tumor na fase inicial, sem o quisto cheio de sangue é mostrado na Fig 2H. O espectro de ROI correspondente contém todos os picos presentes acima de 5% de abundância relativa dentro Fig 2D. No entanto, na figura 2H esses mesmos picos estão presentes muito mais baixos abundância relativa, devido aos lípidos da membrana altamente abundantes,

i

e

, PI.. (38: 4) em

m /z

885,54. O método ROI fornece uma representação mais precisa das todas as espécies presentes na região selecionada; No entanto, NMF pode isolar espécies que distinguem entre as regiões, potencialmente auxiliando na descoberta de espécies com relativamente baixas abundâncias que podem ser alterados. Este atributo é fundamental na tentativa de identificar a progressão da doença através do tecido sem intervenção do usuário supervisionado para definir limites entre tecido doente e saudável.

Dividir o conjunto de dados em três, quatro e cinco componentes NMF (S1 e S2 figos, e Figura 3, respectivamente) segrega progressivamente os sinais que são distintamente associados com a região do tumor /cisto do resto do tecido saudável. O que emerge é uma imagem representando principalmente o ovário saudável, uma ou mais imagens (dependendo do número de componentes selecionados) exibindo diferentes distribuições de iões ao longo do útero e dos ovários saudável, e uma imagem que mostra as espécies elevadas na região do tumor /cisto. Os espectros correspondente à imagem de componente de ovário (Fig 3C) que actua como a nossa amostra de controlo pseudo-para esta experiência é dominado pelo ião a

m /z 885,5436

com todos os outros iões observados em uma abundância relativa de 5% ou menos. A fatoração NMF progressiva dos sinais que contribuem para o útero (Fig 3A, 3E e 3I) mostram uma abundância relativa mais baixa do ião a

m /z 885,5436

do que Fig 3C. Além disso, a contribuição relativa maior de outros íons nestes espectros é observado, em particular os da região lipídico entre os

m /z

600-1000 de potenciais fosfatidiletanolaminas (PE;

m /z

716.5247, 722,5070, 746,5053, 766,5324 e 794.5395), fosfatidilserinas (PS;

m /z

788,5369, 810,5229, 834,5229), fosfatidilglicer�s (PG;

m /z

747,5108), e fosfatidilinosit�s (PI;

m /z

833,5120, 857,5111, 909,5489). [49]

dos cinco imagens componentes NMF, Fig 3A apresenta a maior intensidade na região do tumor. No entanto, a Fig 3A mostra também uma elevada correlação relativamente ao componente espectros de NMF (Fig 3B) durante a maior parte da secção de tecido. Embora os picos na Figura 3B são elevados na região do tumor, eles não são necessariamente biomarcadores ideais para diferenciar entre o tumor e os tecidos saudáveis. Isto é suportado pela maioria dos picos identificados na Figura 3B sendo lípidos da membrana da célula de mamífero comuns que são conhecidos como sendo elevados devido a um aumento da taxa de síntese de lípidos nos tecidos cancerosos. [52] Pelo contrário, a Fig 3G mostra uma muito maior em relação diferença entre o tumor região /cisto e o restante da secção de tecido. É verdade que as intensidades mais elevadas e a maioria dos mais intensos pixels são observados no quisto mas há ainda um número significativo de pixels com intensidades elevadas na região do tumor. Como a imagem do componente na figura 3G mostra quase exclusivamente a região do tumor /cisto com contribuições mínimas de outras áreas de tecidos, este componente deve ser altamente representativo de mudanças metabólicas dentro do microambiente do tumor. Os três componentes NMF restantes descrevem regiões presumivelmente não-cancerosas do tecido (

i

.

e

., Ovário saudável e maior parte do útero). Portanto, a imagem do componente na figura 3G é esperado para conter contribuições mínimas de espécies químicas não específicas para a biologia do cancro, com o correspondente espectro mostrado na Fig 3H.

O desempenho de NMF como um algoritmo de segmentação sem supervisão aplicado a dados MSI foi avaliada através da comparação com um algoritmo de agrupamento mais típicos tais como K-Means clustering. Os K-means resultados de segmentação do conjunto de dados MSI para

k

= 5 clusters é mostrado na Fig S3. Quatro dos cinco agrupamentos K-means foram espacialmente e espectralmente muito semelhante aos resultados observados NMF na figura 3, com o quisto cheio de sangue, de ovário, e tecido remanescente todos segmentado em grupos separados. Para a análise K-means, um dos aglomerados continha grandes contribuições do sinal de fundo e, por conseguinte, que a química do cluster correlacionado espacialmente com a região fora do tecido biológico. A segmentação da região de fundo não foi observado nos resultados NMF, em vez do útero foi separada em três segmentos (em comparação com dois com o agrupamento K-means). É evidente que NMF é mais adequada para a análise de dados MSI como NMF fornece o grau de correlação de cada pixel para a aproximação espectral definido para cada um dos componentes, ao passo que K significa que apenas dá uma indicação binário para cada inclusão pixels para que cluster específico. Assim imagens NMF fornecer um descritor mais informativo para os dados MSI do que K-Means clustering.

Para ilustrar o poder seletiva de NMF, iões detectados dentro do espectro do tumor em uma abundância de ≥ 5% em relação ao pico de base são