Abstract
marcas CD44 células-tronco semelhantes a células em vários tipos de tumores, incluindo o câncer colorretal (CRC), enquanto que a expressão de CD44 aberrante transmite aumento cancerígeno, invasivo e potencial metastático. Dados anteriores indicam que CD44 é um alvo direto de repressão da transcrição mediada por p53 no cancro da mama. Desde inativação
p53
mutações são eventos genéticos frequentes na CRC estes poderiam desencadear a expressão de CD44. No presente estudo, portanto, explorou a relação entre
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estado mutacional e expressão de CD44 em uma coorte de 90 CRCs primárias localizadas e estudaram o efeito da ativação de p53 induzida por radiação na expressão de CD44. Curiosamente, observou-se que, em contraste com o cancro da mama, perda da função
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mutações não foram associados com a expressão de CD44 elevada no câncer de cólon. Além disso, o ADN-danos induzidos pela activação de p53 não resultou em repressão da expressão de CD44, nem em células cancerígenas do cólon, nem nas células epiteliais intestinais normais. Nossos dados demonstram que a expressão de CD44 em células epiteliais intestinais normais e malignas não é regulado por p53, o que implica que a regulação deste alvo terapêutico potencialmente importante é o tecido e do tipo de câncer específico
Citation:. Zeilstra J, Joosten SPJ, Vermeulen G, Koster J, Medema JP, Versteeg R, et al. (2013) a expressão de CD44 em Intestinal epitélio e câncer colorretal é independente do estado p53. PLoS ONE 8 (8): e72849. doi: 10.1371 /journal.pone.0072849
editor: Kanaga Sabapathy, Centro Nacional do Câncer, Singapura
Recebido: 01 de março de 2013; Aceito: 15 de julho de 2013; Publicação: 29 de agosto de 2013
Direitos de autor: © 2013 Zeilstra et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação holandesa Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
CD44 compreende uma família de adesão de células e moléculas de sinalização que exercem efeitos pleiotrópicos sobre processos biológicos importantes incluindo a proliferação, a sobrevivência, a migração, epitelial para mesenquimal (EMT), e metástases do cancro (revisto por Zoller [1]) . Na mucosa intestinal, CD44 é um importante alvo directo da sinalização de Wnt e está proeminentemente expresso nas células estaminais intestinais [2] – [4]. Há evidências de que CD44 está envolvido na iniciação e progressão de tumores intestinais e o desenvolvimento de metástases [1], [3], [5] – [9]. Além disso, a expressão proeminente do CD44 é uma característica marcante de células altamente tumorigénicas CRC [10]. Por conseguinte, foi demonstrado recentemente que
CD44
é parte de um gene assinatura células estaminais intestinal que prevê a recidiva da doença em pacientes com CCR [11]. Esta assinatura foi especificamente associada com células de CRC dotados com um elevado potencial de iniciar tumor, bem como a capacidade de auto-renovação a longo prazo. Assim, CD44 representa um potencial alvo terapêutico para o tratamento de CRC e é, portanto, importante compreender as diferentes mecanismos subjacentes à regulação do CD44. Na maioria dos casos de CRC, a expressão do CD44 é aumentada como resultado de desregulado a sinalização de Wnt /β-catenina [2], [12]. No entanto, há ampla evidência de que outras vias e mecanismos ainda-não identificados contribuem para a regulação do /β-catenina expressão do gene alvo Wnt em tumores intestinais [13]. A proteína p53 supressor de tumores é um factor de transcrição que desempenha um papel crítico na supressão de cancro. Em resposta ao stress oncogénica, tais como danos no ADN, a proteína p53 activado liga-se a locais de ADN específica da sequência, regulando desse modo a transcrição de uma vasta gama de genes alvo envolvidas no controlo do ciclo celular e sobrevivência de sinalização [14]. inactivação mutacional do
gene p53
é um evento genética frequente na progressão de muitos tipos de tumores humanos, incluindo cancro da mama e cancro colorectal (CRC) [15]. Recentemente, foi demonstrado que a p53 transcricionalmente reprime
expressão de CD44
em ambas as células epiteliais mamárias normais e derivadas de tumores através da ligação directa ao
CD44
promotor [16]. Esta regulação dependente de p53 de CD44 foi observada em ambas as glândulas mamárias humanas e de rato, indicando uma função evolutivamente conservadas. Importante, a sub-regulação da expressão de CD44 foi encontrado para ser um pré-requisito para a regulação do crescimento dependente da p53 e indução de apoptose em epitélio mamário [16]. A interação funcional semelhante entre p53 e CD44 também pode ocorrer em células epiteliais do intestino e tumores. Para explorar se a expressão de CD44 é controlada pela proteína p53 no CRC, analisou uma coorte de carcinomas do cólon primário para
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estado mutacional e expressão de CD44. O nosso estudo revela que a perda de função de p53 não está associado com a expressão de CD44 em elevado CRC. Além disso, foi demonstrado que a activação de p53 do tipo selvagem não é capaz de reprimir a expressão de CD44 em células de cancro de cólon humano, bem como em culturas primárias de rato intestinais Organóides cripta-vilosidade.
Materiais e Métodos
ética Declaração
o estudo envolvendo amostras de biópsia humanos foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki e aprovado pelo comitê de ética local da Universidade de Amsterdam, AIEC (Algemene Instellingsgebonden Ethische Commissie). Os pacientes assinaram termo de consentimento para a recolha de amostras.
amostras de tumor, p53 mutação e análise de expressão gênica Ensaio
A coorte do estudo consistiu de 90 estágio clínico II AJCC CRC submetidos à cirurgia curativa intencionalmente na Academic Medical Center (AMC) em Amsterdão, Países Baixos, nos anos de 1997-2006 [17]. tecido fresco congelado representativas do tumor foi cortado em secções de 20 um de espessura que foram imediatamente colocadas em reagente TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Breda, Holanda), após o que o RNA total foi extraído. carga tumoral foi analisada rotineiramente por um patologista experimentado.
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estado mutacional foi determinada utilizando RT-PCR. Em suma, 2 ug de RNA total foi transcrito no sentido inverso, 25 ul de volume de reacção usando pdN6 (Amersham Biosciences, Roosendaal, Holanda) e transcriptase MMLV (Gibco BRL, Breda, Países Baixos). A PCR foi realizada em 1 ul de molde de ADNc utilizando polimerase Taq Platinum (Invitrogen Life Technologies). iniciadores Oligo estão listados na Tabela 1. Os produtos de PCR foram amplificados por 35 ciclos de 45 s a 95 ° C, 45 s a 60 ° C e 1 min e 30 s a 72 ° C, e foram sequenciados directamente usando o kit de Big Dye Terminator (Amersham) em conjunto com sentido ou anti-sentido iniciador oligo. As sequências foram analisadas utilizando o software CodonCode alinhador (CodonCode Corp., Dedham, MA). Os níveis de expressão do gene nos tumores foram avaliados usando o 2.0 plataforma matriz Affymetrix GeneChip Genoma Humano U133 Plus (Affymetrix, Santa Clara, CA). RNA purificado foi processado, hibridizado, e verificados de acordo com o protocolo do fabricante. Os dados foram analisados utilizando o pacote de software R2 (https://r2.amc.nl), um aplicativo de análise de microarray baseado na web desenvolvido por J. K. Dados MAS5 foi normalizada e os valores de expressão foram transformados Log2. A significância estatística foi avaliada utilizando análise de uma via de variância (ANOVA). conjuntos de sondas testadas foram:
CDKN1A
(
p21
), ID: 202284_s_at;
MDM2,
229711_s_at; e
CD44,
209835_x_at. Outra sonda define ensaiar
CD44
produziu resultados semelhantes, por exemplo; 204489_s_at,
P Art 0,01 e 210916_a_at,
P
. 0,01)
Imunohistoquímica
tecido tumoral embebido em parafina foi corado usando mAb de murganho p53 primário anti-humano (Dako, Glostrup, Dinamarca) e mAb de murganho primária de CD44 anti-humano (VFF18) que reconhece o CD44v6 [18]. A ligação do anticorpo foi visualizada utilizando o sistema de detecção Powervision poli-HRP (ImmunoVision Technologies, Daly City, CA) e DAB + (Dako). A intensidade (I) da coloração foi pontuada em escalas semiquantitativos como se segue: “0”, sem reacção; “1”, a reação fraca; “2”, a reacção moderada; e “3”, a reacção forte. A medida do sinal foi pontuada como percentagem das células positivas (P). pontuação global de coloração foi calculada multiplicando a intensidade da percentagem de células positivas (Pontuação = P * I; máximo = 300). O teste exato de Fisher foi utilizado para análise estatística (
P Art 0,001).
Cultura de Células, Immunoblotting e em tempo real transcrição reversa-PCR
células RKO foram cultivadas em meio 5A de McCoy supplementented com 10% de FCS até subconfluentes. Rato pequeno criptas intestinais foram isolados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Amsterdam, DEC (Dier Ethische Commissie) e cultivadas durante uma semana como descrito por
Sato et al
. [19]. As culturas foram expostas a uma única dose de 10 Gy a partir de uma fonte de radiação
137Cs γ-raios, a uma taxa de dose de 0,8 Gy /min ou incubadas com 500 ng /mL neocarzinostatina (NCS), quer em combinação com 10