Abstract

Fundo

células-tronco cancerosas (CSCs) são um subconjunto de células tumorais com capacidade de auto-renovação e gerar as diversas células que compõem o tumor. O objetivo deste estudo é avaliar o valor prognóstico da CSCs em uma população altamente homogênea de estágio II de câncer de cólon.

Métodos

pacientes com câncer de cólon II Cem estágio tratados pela mesma equipe cirúrgica entre 1977 e 2005 foram analisados ​​retrospectivamente. Nenhum dos pacientes recebeu quimioterapia adjuvante. expressão Inmunohistochemistry de CD133, NANOG e CK20 foi marcado, usando quatro níveis: 10%, 11-25%, 26-50% e 50% de positividade. Kaplan-Meier teste de análise e log rank foram utilizados para comparar a sobrevivência.

Resultados

A idade média dos pacientes foi de 68 anos (pacientes tinham entre 45-92 anos de idade) e acompanhamento médio se foi 5,8 anos. Houve doença recorrente em 17 (17%); expressão CD133 (definida por 10% de positividade) foi mostrado em 60% dos tumores, em 95% para 78% e NANOG para CK20. Não houve correlação entre os níveis de expressão de CD133, NANOG ou CK20 e sobrevida livre de recidiva (RFS) ou sobrevida global (OS). No entanto, uma correlação estatisticamente significativa foi encontrada entre os fatores estabelecidos patológicos prognósticos e RFS e OS.

Conclusões

Stem quantificação celular definido pelo CD133 e expressão NANOG não tem correlação com a RFS ou OS nesta coorte da Fase II do cancro do cólon

Citation:. Vaz MA, Martinez JC, Devesa JM, Trill JD, Abraira V, Riquelme A, et al. (2014) Valor Prognóstico de quantificação de células-tronco na Fase II cancro do cólon. PLoS ONE 9 (2): e88480. doi: 10.1371 /journal.pone.0088480

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de setembro de 2013; Aceito: 08 de janeiro de 2014; Publicação: 21 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Vaz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do cólon é uma das causas mais comuns de. morte por cancro em todo o mundo e sobrevivência é afetado por recidiva local, bem como o desenvolvimento de doença metastática.

a teoria de células-tronco do câncer baseia-se no pressuposto da existência de uma pequena população de células iniciadoras de câncer, que é exclusivamente responsável pelo crescimento e manutenção de todo o tumor. Estas células têm uma taxa proliferativa baixo, elevada capacidade de auto-renovação e propensão para se diferenciarem em células tumorais em proliferação activa e que são resistentes à quimioterapia e à radiação. Estas células têm sido relatados em diferentes tipos de câncer.

Os resultados recentes da pesquisa sugerem que o modelo de células-tronco do câncer também se aplica para o carcinoma de cólon. Ricci-Vitiani e O’Brien informou que as células positivas CD133 no câncer colorretal apresentam as propriedades das células cancerosas, iniciando com a auto-renovação e alto potencial tumorogénicos. Estes CSCs expressam marcadores de pluripotência, como CD133 e NANOG e não expressam marcadores de diferenciação como cytokeratin20 (CK20) [1], [2], [3].

O potencial valor prognóstico da CSCs em câncer colorretal tem sido estudada com resultados conflitantes. No entanto, algumas destas séries foram baseados em situações que envolvem heterogéneos, cancro rectal e do cólon e diferentes estágios tumorais (I-IV). O objetivo deste estudo é avaliar o valor prognóstico da CSCs em uma população altamente homogênea de estágio II de câncer de cólon.

Materiais e Métodos

Um total de 100 amostras patologicamente confirmados foram obtidos a partir de cólon pacientes com câncer em estágio TNM II, que foram tratados cirurgicamente, entre 1977 e 2005 no Hospital Universitário Ramon y Cajal. Para reduzir os efeitos de tratamento adjuvante no prognóstico nenhum dos pacientes incluídos receberam quimioterapia adjuvante. Todos os pacientes foram acompanhados por sobrevida livre de recidiva e sobrevida global. O período de acompanhamento foi calculado a partir da data da cirurgia até 2010. A recorrência foi definida como re-aparecimento do tumor inicial; e ambos metástase ou recorrência local foram consideradas evidências de recidiva do tumor. A sobrevivência global foi definida como o tempo desde a cirurgia à morte ou no momento em que o paciente foi gravada para ser vivo última. Neste estudo também foram registrados fatores clínicos prognósticos conhecidos. pacientes de alto risco foram considerados como sendo aqueles com, pelo menos, uma das características seguintes: menos de 12 nódulos linfáticos presente na amostra cirúrgicos, T4 tumorais, invasão e linfovascular tumores pouco diferenciados. A classificação TNM foi utilizado para o estadiamento patológico e a classificação da Organização Mundial da Saúde foi utilizado para a classificação patológica. A pesquisa tem aprovação do comitê de ética (hospital Ramon y Cajal University). consentimento informado por escrito foi obtido para o uso da amostra na pesquisa.

exame histológico

Os espécimes foram recuperados a partir dos arquivos de patologia do Hospital Universitário Ramon y Cajal, Madrid, Espanha, e histologicamente revisto. Os blocos de parafina foram recuperados para a construção de matrizes de tecido contendo 1,5 mm de diâmetro cilindros de tecido de câncer de cólon e amostras de controlo. Cada bloco de parafina de arranjo de tecido continham pelo menos 2 amostras de cada caso, a fim de ter um controlo transversal de expressão do sinal. Foram seleccionadas as áreas mais representativas de cada tumor para o estudo. tecido linfóide reactivo (amígdalas) foram usados ​​como controlos negativos da expressão e incorporado por triplicado em cada arranjo de tecido. Características histopatológicas foram revisados ​​independentemente. Isto foi seguido pela observação comum em um microscópio multihead, onde as discrepâncias foram resolvidas.

imuno-histoquímica (IHQ)

Anti-CD133 Coelho Monoclonal Antibody (Cell Signaling Technology) e NANOG humana policlonal de cabra formiga ( Novus Biologicals), foram usadas para identificar os marcadores de células estaminais. Anti-Cytokeratin20 (CK 20) do rato Anticorpo Monoclonal (Dako, Dinamarca), foi utilizado para avaliar as células epiteliais diferenciadas. coloração imuno-histoquímica foi realizada seguindo o método de coelho /rato Dako real En Vision (Dako, Dinamarca). Como um controlo positivo da expressão padrão e a especificidade do sinal, utilizou-se secções de tecido do cérebro de feto humano, incluindo o epitélio neuro cérebro ventricular. Este foi o primeiro lugar onde a expressão de CD133 foi detectado na borda apical de células neuroephitelial [4]. Mais tarde, a libertação de partículas de membrana CD133 positivo, foi observada nos fluidos do corpo humano e fluidos diferentes ventriculares, incluindo intestino [5]. A incubação com um anticorpo não relacionado foi empregado como um controle de preservação e recuperação antigênica. A incubação omitindo o primeiro anticorpo foi utilizado como um controlo negativo de uma coloração não específica do sistema de detecção.

Exame imuno

análise imuno-histoquímica foi feito a partir de secções de tecido embebidas em parafina, que incluíam as áreas tumorais mais representativas . CD133, NANOG e CK20 foram analisados. Os tumores foram atribuída uma pontuação semi-quantitativa, utilizando quatro níveis: 10%, 11-25%, 26-50% e 50% de positividade. Nós definimos uma amostra a ser positivo se houvesse . Células positivas 10%

Análise Estatística

A análise de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar a sobrevida específica para o câncer e os grupos foram comparados com o teste de log-rank. procedimentos estatísticos foram realizados com o programa SPSS versão 15.0, e p 0,05 foi considerer estatisticamente significativa. Todas as análises foram realizadas utilizando o Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Software.

Resultados

Achados clínicopatológicos

Os achados clínico-patológicos estão listadas na Tabela 1. A idade média dos os pacientes foi de 68 anos (pacientes variam de 45 a 92 anos), 53% eram do sexo masculino e 47% eram do sexo feminino.

conhecido achados clinicopatológicos alto risco de recorrência foram registrados, definida por menos de 12 linfonodos presentes na peça cirúrgica, tumores T4, invasão linfática e tumores pouco diferenciados, e os pacientes foram classificados na categoria de alto risco se havia um ou mais desses fatores de risco ou na categoria de baixo risco se não houvesse fatores de risco. Cinquenta e dois por cento eram de alto risco e 48% eram pacientes de baixo risco. Trinta e cinco por cento dos pacientes tiveram 12 linfonodos na peça cirúrgica. Apenas 4% eram T4, 9% dos pacientes tinham histologia pouco diferenciado e 11% tinham invasão linfática. No momento da última seguimento 17% dos pacientes tinham doença recorrente e 61% estavam vivos; 36% estavam mortos, 16% de câncer colorretal e 20% de outras causas.

O CD133 Antigen Localização em Colon Cancer

O padrão de reactividade inmunohistochemical positiva para CD133 observada em células gliais periventriculares (controle casos) (Fig. 1), é em manter à observada em estudos anteriores [5], e actua como um controlo positivo da especificidade do sinal. O antigénio CD133 foi anteriormente mostrado para ser localizado em Protusões da membrana plasmática apical da linha celular de cancro culturas Caco-2 [5].

Foi observada uma coloração polar de CD133 confinadas à célula apical luminal superfície das glândulas de câncer colorretal. Geralmente várias células positivas CD133 foram agrupadas. expressão CD133 tendiam a ser pronunciado perto da margem invasiva dos tumores.

expressão da proteína CD133 foi observado na borda apical de células de câncer de cólon e glândulas, frequentemente derramamento de detritos CD133 positivo nas glândulas luminais (Fig. 2 ). grupos ocasionais de células neoplásicas mostraram expressão citoplasmática inteiro positivo (Fig. 3).

Nenhum sinal positivo CD133 foi encontrada em nenhuma das amostras de tecido da amígdala, nem na superfície da mucosa deles, utilizado como controlo negativo. Esta regra a possibilidade de falsos positivos, ou a ligação não específica do anticorpo CD133 usado, para mucosas /espaços luminais.

Ao olhar para secções de tecido consecutivos, comparamos CD133 e expressão da proteína CK20 (Fig. 4 ). Campos contendo células positivas CD133 normalmente mostrou a expressão da proteína CK20 fraco ou não, enquanto que as áreas com alta expressão de CK20 eram geralmente CD133 negativo. No entanto grupos de células neoplásicas que expressam simultaneamente CD133 e CK20 foram mostrados, bem como (Fig. 5).

imuno-CD133 Expressão

expressão CD133 foi detectado em 100% dos pacientes . Quarenta por cento dos pacientes tinham 10% de positividade; 22% dos pacientes tiveram 11-25% de positividade; 6% dos pacientes tiveram 26-50% de positividade e 22% dos pacientes tiveram . 50% de positividade

Todos os 100 pacientes foram acompanhados pela sobrevivência para analisar a expressão de CD133 como fator prognóstico. O período médio de acompanhamento foi de 5,8 anos. Dos 100 pacientes, 16,3% morreram de seu câncer e 20,4% de outras causas. Houve 7 casos de recidiva local, 11 casos de metástases à distância.

curvas de sobrevida livre de recorrência não foram diferentes entre os diferentes níveis de expressão de positividade CD133. curva de Kaplan-Meier para a sobrevida global não apresentaram diferenças estatísticas entre os diferentes grupos (fig. 6).

Expression NANOG

NANOG expressão nuclear e citoplasmática foi detectada em 99% dos pacientes . Cinco pacientes tinham 10% de positividade; 9 pacientes tinham 11-25% de positividade; 34 pacientes tiveram 26-50% de positividade e 51 pacientes tiveram 50% de positividade. A coloração positiva foi observada principalmente no que as células epiteliais neoplásicas, muitos deles coincidentes com as células positivas CD133. No entanto, NANOG positiva /CD133 células neoplásicas foram negativos bem como mostrado. Além disso, a expressão NANOG também foi observado em células do estroma neoplásicas (dados não mostrados).

Kaplan-Meier para a recorrência e sobrevida global não apresentaram diferenças estatísticas entre os diferentes níveis de expressão (Fig. 7).

CK20 expressão

expressão CK20 foi detectada em 78% dos pacientes. Vinte e dois por cento dos pacientes tinham 10% de positividade; 29% dos doentes tinham 11-25% de positividade; 26% dos pacientes tiveram 26-50% de positividade e 23% dos pacientes tiveram . 50% de positividade

curva de Kaplan-Meier para a recorrência e sobrevivência não apresentaram diferenças estatísticas entre os diferentes grupos de expressão

.

A relação entre clinicopatológicas conhecidos fatores de alto risco para os pacientes, definido como tendo pelo menos um dos seguintes: menos de 12 linfonodos presentes na peça cirúrgica, tumores T4, invasão linfática e tumores pouco diferenciados e recorrência e sobrevivência eram analisados. Uma correlação estatisticamente significativa foi encontrada entre os fatores conhecidos clínicos e RFS e OS (p = 0,034) (Fig. 8).

Discussão

CD133 é o epitopo de uma forma glicosilada de prominin-1 humana, que é um membro da glicoproteína transmembranar pentaspan [1], e a expressão de CD133 foi relatado estar localizado em células neonatal e adulto precursores normais, bem como células de cancro iniciar [2], [3]. Notavelmente, prominin-1 está especificamente associada com Protusões membrana plasmática [4]. Com efeito, durante a neurogénese, partículas que expressam CD133 foram mostrados na lumina tubo neural, em que a libertação de partículas de membrana que expressa CD133 parece ser um evento difundido [6]. Além disso, o CD133 humano haste de antigénios das células também é expresso por células epiteliais humanas diferentes, incluindo intestino, e direccionada para Protusões membrana plasmática [5].

CD133 é presentemente considerado um marcador útil para identificar CSCs em cancro colo-rectal. É de interesse quanto a saber se as células positivas CD133 pode ser considerada um factor de prognóstico. Este estudo analisou imunohistoquímica expressão CD133 e avaliou a sobrevivência em uma grande série de estágio II de câncer de cólon e descobrimos que a expressão CD133 não foi um fator de risco independente associado com recorrência ou sobrevida do paciente.

A relação entre a expressão de CD133 e prognóstico em carcinomas colorectais foi examinada anteriormente. Horst

et al

relataram que a expressão CD133 é um marcador independente de prognóstico [7] que este tipo de correlação não foi observado por Kojima

et al

[8]. No entanto, algumas destas séries foram baseados em situações que envolvem heterogéneos, cancro rectal e do cólon e diferentes estágios tumorais (I-IV). Li

et al

analisaram um grupo IIIB homogênea (104 pacientes) e mostrou que as células cancerosas positiva CD133 contribuiu para a progressão do cancro do cólon [9]. Nian-Hua Zang

et al

analisaram um grupo de fase II e câncer de cólon III fundar uma sobrevivência correlação negativa em pacientes com co-expressão con CDXCR4 e CD133 [10].

A discrepância entre os diferentes estudos pode ser derivada da quantidade inadequada paciente e o estádio do tumor mista (fase I a IV e cancro do cólon e rectal).

por outro lado, é improvável que os CSCs pode ser caracterizado por um único marcador . propriedades semelhantes a células estaminais foram recentemente relatados em células negativas para CD133, também. Portanto, as células tumorais positivas para CD133 podem não representar toda a população de iniciação de cancro. Uma combinação de marcadores de superfície celular é necessária para a definição de células estaminais de cancro do cólon. No entanto, a população de células estaminais do cancro é heterogéneo. Por conseguinte, os níveis de expressão dos diferentes marcadores de células estaminais do cancro é variável, como um resultado da diversidade função biológica de cada um deles.

NANOG, um factor de transcrição homeodom�io, é um regulador essencial para a promoção da auto -renewal de células estaminais embrionárias e a inibição da sua diferenciação. Estudos anteriores indicaram que NANOG é expresso em células de cancro do cólon, e sugeriu que a sua expressão contribui para a proliferação de células de cancro do cólon [11]. Além disso, vários estudos têm mostrado que NANOG regula diversas funções de desenvolvimento de câncer, como a proliferação de células tumorais, fármaco-resistência e comunicação célula cancerosa com o estroma circundante, levando a célula motilidade, a transição epitelial-mesenquimal e evasão imune [12].

decidimos analisar NANOG nesta coorte de pacientes. NANOG e CD133 expressão foi observada no mesmo subconjunto de células neoplásicas. No entanto, os níveis de expressão NANOG foram maiores do que os de CD133, tal como determinado por positiva /CD133 células neoplásicas NANOG negativos, que foram mostrados como bem. Além disso, a expressão NANOG também foi observado em células do estroma, provavelmente relacionado com a função de comunicação microambiente.

Nós não encontraram correlação entre CD133 ou expressão NANOG e sobrevivência (sobrevivência livre de doença e sobrevida global).

Portanto, CD133 células positivas em si pode não ter capacidade biológica associada com potencial de malignidade do câncer colorretal.

estudos anteriores, usando suspensões de células de amostras de cancro do cólon demonstrou que células positivas CD133 foram CK20 negativo [3]. Em nossa coorte de 78% das amostras foram positivas CK20 (definido por 10% de positividade), e também não foi encontrada correlação com a sobrevivência

Vários fatores podem explicar as discrepâncias com relatórios anteriores: a.) Misturados estágios tumorais onde analisamos uma forma muito homogénea, b) anticorpos diferentes usados ​​para a detecção da molécula de CD 133. Com efeito, diferentes resultados podem ser obtidos usando anticorpos diferentes [13], [14] c) diferentes critérios utilizados para identificar e coloração positiva diferente de corte utilizado para discriminar tumores positivos e negativos. Em nosso estudo nós estabelecemos quatro níveis de positividade: 10%, 11-25%, 26-50% e 50%. Outros considerado positivo se 50% de positividade, (Horst

et al

), 10% (Kojima

et al

) ou 5% (Li

et al

), d) inadequado do paciente coorte, isto poderia explicar os resultados negativos para a correlação de tal coorte com baixa expectativa de recorrência, resultando apenas em um 17% dos casos. No entanto, poderíamos demonstrar uma correlação com fatores clínico-patológicas conhecidas e sobrevivência.

Além disso, observou-se um alto nível de CD133 e positividade NANOG neste grupo de paciente em um estágio mais inicial, 60% CD133 positividade. Além disso, em 22% foi superior a 50%. Também descobriu que 94% NANOG positividade e 51% eram maiores do que 50%. Estes resultados vão contra com os encontrados por Li

et al,

em que até 40% dos casos em estágio IIIB teve 5% de positividade

Este comportamento inesperado de expressão CD133 encontrado em. o nosso estudo, a maior em tumores estágio inferior do que em lesões mais avançadas, tem sido observada em outros relatos [15]. Esta distribuição é consistente com os resultados anteriores em um mouse modelo de cólon carcinogênese [16] e em cancros do cólon primários humanos [16]. No rato cólon carcinogênese têm sido observados um aumento significativo da expressão de CD133, avaliada por imuno-histoquímica, em lesões neoplásicas início que tendem a diminuir com o desenvolvimento do tumor [17] e um aumento da expressão CD133 foi relatada em Dukes A comparação com Dukes B e C cancros do cólon [16]. Estudos anteriores relataram que a intensidade de CD133 é a célula dependente do ciclo e aumentou CD133 células positivas estão correlacionados com aumento do conteúdo de ADN, e todos estes resultados estão em acordo com a capacidade proposto da proteína para identificar especificamente as células de início de tumor que está relacionado com a crescimento tanto da doença primária e metastática [18] e, portanto, principalmente envolvidos nas fases mais ativas de desenvolvimento do tumor.

Esta expressão CD133 diferente por diferentes fases também tem sido sugerido por Shmelkov

et al

, que propõe que durante a metástase, as células de tumor positivas CD133 gerar células negativas para CD133, que são mais agressivos e também capaz de iniciar tumores em ratinhos nus. Os autores relataram que 40% dos tumores metastáticos em seu estudo foram CD133 negativas [19].

Em conclusão, neste estudo de 100 fase II, os doentes com cancro do cólon, Stem quantificação celular definido pelo CD133 e expressão NANOG não tem correlação com RFS ou OS. No entanto, uma correlação com fatores patológicos prognósticos estabelecidos foi encontrado. Portanto, nossos resultados sugerem que CSCs não pode desempenhar um papel importante nas fases iniciais do câncer de cólon.

Reconhecimentos

Agradecemos Drs Y Castro e ME Fernandez-Santos PhD, para a leitura do manuscrito e fornecer conselhos úteis e idéias. MA Gonzalez-Nicolas Licenciatura A Acosta Licenciatura contribuiu com sua excelente assistência técnica na realização dos experimentos de coloração em amostras cerebrais fetais para o estudo de expressão CD133, bem como por seus comentários e interpretação precisa.