Abstract

Fundo

radiofrequência (RFA) é um dos terapias curativas para o carcinoma hepatocelular (HCC), no entanto, acelerada progressão do HCC residual após incompleta RFA tem sido relatada com mais frequência. O mecanismo molecular subjacente a este fenómeno continua a ser elucidado. Neste estudo, foi utilizado um HCC ortotópico modelo de ratinho nu incompleta RFA para estudar o potencial invasivo e metastático do câncer residual, bem como o mecanismo correlacionada.

Métodos

O incompleta RFA ortotópico ratinho nu modelos foram estabelecidos utilizando linha de alta potencial metastático de células HCC HCCLM3 e baixa linha de células HCC potencial metastático HepG2, respectivamente. As alterações na morfologia celular, motilidade, metástase e epitelial-mesenquimal (EMT) de transição, e marcadores de células HCC moleculares após

in vitro

e

in vivo

foram observados intervenção RFA incompleto.

resultados

pulmonar e metástase intraperitoneal foram observados em um

in vivo

estudo. O mecanismo subjacente pró-invasiva de RFA incompleta pareceu estar associado com a promoção EMT, incluindo a sub-regulação de E-caderina e a sobre-regulação de N-caderina e vimentina. Estes resultados estão de acordo com o

in vitro

resposta das células HCC para aquecer intervenção. Outros estudos demonstraram que a β-catenina foi um fator fundamental durante este curso e bloqueio de β-catenina reduzida metástase e EMT fenótipo alterações nas células HCCLM3 tratados termicamente

in vitro

.

Conclusão

incompleta RFA reforçado o potencial invasivo e metastático do câncer residual, acompanhando as mudanças fenotípicas EMT-como pela ativação de sinalização β-catenina em células HCCLM3

Citation:. Zhang N, Wang L, Chai ZT, Zhu ZM, Zhu XD, Ma DN, et ai. (2014) Incomplete Ablação por Radiofreqüência Melhora a capacidade de invasão e metástase do câncer residual do carcinoma hepatocelular celular HCCLM3 via Ativando β-catenina Sinalização. PLoS ONE 9 (12): e115949. doi: 10.1371 /journal.pone.0115949

editor: Terence Lee, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 14 de junho de 2014; Aceito: 27 de novembro de 2014; Publicação: 26 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (número de concessão: 81372314).; Fundo de Shanghai Natural Science for Scholars Juventude (12ZR1442300); Projeto Nacional Chave de Doenças Infecciosas (2012ZX10002012-004). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) é o quinto câncer mais comum no mundo ea terceira principal causa de morte relacionada ao câncer [1]. Embora a ressecção cirúrgica é a modalidade de tratamento padrão para HCC, a sua utilização é geralmente limitada porque a maioria dos pacientes, mesmo com pequena HCC, têm associado a disfunção hepática grave [2], [3]. O transplante de fígado fornece um tratamento alternativo para pequenas HCC irressecável, no entanto, a escassez de enxertos hepáticos limita a aplicabilidade desta abordagem [4]. Devido a estas circunstâncias, várias técnicas não cirúrgicas foram introduzidas para tratamento de HCC, tais como a ablação por radiofrequência (RF), injecção percutânea de etanol (PEI) e terapia de coagulação microondas (MCT) [5], [6]. Entre essas técnicas, RFA é atualmente a opção de tratamento mais amplamente utilizado devido à sua simplicidade, segurança, capacidade de invasão mínima, repetibilidade e menor tempo de internação [4]. RFA é considerada a melhor opção para HCC irressecável em pacientes com não mais que três nódulos hepáticos, um tumor no máximo 3 cm de diâmetro, e com função preservada hepática (Child-Pugh A e B) [7], [8]. No entanto, um dos principais desafios com RFA é o tecido do tumor residual e recorrência local após tratamento local, foi relatado que as taxas de recorrência pós-RFA variar 49-74% [9] – [11]. Além disso, a recidiva tumoral local após RFA apresentou um crescimento mais invasivo, invasão vascular mais e menos diferenciação em comparação com tumores de pacientes sem RFA [12].

O caminho /β-catenina Wnt é uma via de sinalização importante na HCC [13], [14]. Tem sido relatado que um terço do HCC estão associadas a expressão anormal de β-catenina [15]. β-catenina (CTNNB1), é uma molécula central na via de sinalização Wnt, e é uma proteína multifuncional envolvida na adesão célula-célula, a transdução de sinal, a regulação da proliferação e diferenciação celular. A nossa equipa tinha provado que a hipóxia poderia induzir a superexpressão β-catenina e /ou acumulação intracelular em quatro linhas celulares HCC através do mecanismo de degradação endógena, e hipóxia pode também reforçada invasivo

in vitro

e metástase

-regulação para baixo in vivo Compra de células Hep3B e MHCC97 [16]. Mutações nos membros da via /β-catenina Wnt também resultar na activação aberrante de genes alvo, incluindo aqueles que codificam para activadores de transição epitelial-mesenquimal (EMT) [17]. EMT desempenha um papel central nas fases críticas do desenvolvimento embrionário e contribui para os processos fisiológicos, tais como a reparação de tecidos, a regeneração e condições patológicas, incluindo a carcinogénese e fibrose. Além disso, ela também participa na disseminação intra-hepática e metástase distante durante HCC progressão [18] – [21]. β-catenina desempenha um papel crucial no aparecimento e progressão da EMT. Diversos estudos demonstraram a relação entre os sinais de β-catenina e EMT [22]. Oh et ai. relatado que a ativação β-catenina causou indução de caracol e expressão ZEB1, expressão marcador de células mesenquimais e repressão da expressão da caderina-E em algumas células epiteliais durante a patogênese da adenomiose [23]. Zhao et al. forneceram evidências de que via de sinalização Wnt /β-catenina diretamente envolvidos no EMT induzida por HIF-1α, e bloqueio de Wnt /β-catenina via de sinalização causada reversão de EMT e fenótipos mudanças metastáticos [24]. No entanto, o papel de β-catenina no cancro residual após RFA incompleta ainda não é clara. Neste estudo, observou-se que incompleta RFA reforçado o potencial invasivo e metastático do câncer residual, e examinadas alterações na expressão de β-catenina em tecidos tumorais RFA incompletos

in vivo

e em células do CHC tratados termicamente

in vitro

. Além disso, avaliamos sua importância nas mudanças fenótipo metastático induzidas pela intervenção de calor.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e Animais

células HCCLM3 com elevado potencial metastático e HCCLM3-G As células que foram HCCLM3 células transfectadas com proteína fluorescente verde, células HepG2 com baixo potencial metastático e células HepG2-G que foram as células HepG2 transfectadas com proteína fluorescente verde, foram usados ​​em

in vitro

e

in vivo

experiências, respectivamente (estabelecido no Instituto do cancro do fígado, Hospital Zhongshan, Universidade Fudan, de Xangai, China) [25]. As células foram mantidas em meio modificado de Dulbecco de Eagle (DMEM, Gibco BRL, Rockville, MD, EUA) com soro de bovino fetal a 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), 100 U /mL de penicilina a 37 ° C numa atmosfera humidificada atmosfera contendo 5% de CO

2. Macho BALB /c nu /nu ratinhos, pesando 18-20 g, a 4-6 semanas de idade, foram obtidos a partir de SLAC Animal Laboratory Co, Ltd., Shanghai, China. Todos os ratinhos foram mantidos sob condições específicas livres de agentes patogénicos. Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Comissão, da Universidade de Fudan animal Care. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento do animal experimental (S1 Checklist).

Equipamentos e Estabelecimento de Incomplete RFA modelo de camundongo ortotópico Nude

O principal equipamento utilizado foi composto pelo modelo de sistema médico RITA 1500X gerador de RF (RITA Medical Systems, Fremont, CA, EUA), de agulhas múltiplas gancho RFA retrátil (S1A Fig.) (RITA da explosão da estrela XL, angio-Dynamics, Latham, NY, EUA), e Rita aterramento pads (angio-Dynamics) .

HCC modelos ortotópicos ratinho nu humanos com células HCCLM3-G e G-células HepG2 foram estabelecidas como previamente descrito [26]. Os ratinhos nus foram divididos aleatoriamente em grupo incompleta RFA (n = 12) e o grupo de controlo (n = 12). Duas semanas após o implante ortotópico, a RFA incompleta foi realizada como se segue: após a anestesia por Pelltobarbitalum Natricum com administrada por injecção intraperitoneal (50 mg /kg), o animal foi colocado numa placa de metal condutora com os membros fixos e placa dispersiva RITA foram aderidas para a parte traseira deste da placa de metal para assegurar uma boa condutividade eléctrica. Em seguida, a cavidade abdominal de rato foi aberto e exposto o tumor ortotópico no lóbulo esquerdo do fígado (S1B, C Fig.). O centro de uma recta da agulha RITA foi inserido no xenoenxerto e solução salina normal foi gotejada sobre o local da punção para manter boa condutividade. Considerando-se o peso e o volume de ratinhos nus, RFA foi realizada com um protocolo de energia mais baixo, com a potência de 5W e a duração de cerca de 30 segundos, a fim de manter a existência de cancro residual. Após RFA, a cavidade abdominal dos ratos foi fechado com 5-0 não absorvíveis. Os ratos no grupo de controle foram sham-operado através da inserção de uma agulha de RFA no tumor sem a realização da ablação.

parâmetros avaliados

Três semanas após o procedimento RFA, seis ratos de cada grupo foram sacrificados para avaliar o crescimento de tumores e metástases. O mais longo (a) e menor (b) diâmetro tumoral foram medidos e o volume do tumor foi calculado da seguinte forma: O volume do tumor (mm

3) = A (mm) x b (mm) x b (mm) /2 [ ,,,0],27]. Os pulmões foram removidos e as imagens da proteína fluorescente (GFP) focos metastáticos -positivas verdes foram obtidos (estereomicroscópio; Leica, Wetzlar, Alemanha). Os tecidos de pulmão foram seccionados e H E de coloração foi realizada para confirmar os resultados anteriores. metástases intraperitoneal foi observado por imagem fluorescente.

Intervenção de calor

in vitro

células HCCLM3 e células HepG2 foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 5 × 10

4 células /poço. Após 24 h, as placas foram seladas com parafilme e submerso num banho de água regulado para a temperatura alvo durante 10 min. As temperaturas para células alvo HCCLM3 e células HepG2 foram de 39 ° C, 42 ° C, 45 ° C e 41 ° C, 44 ° C, 47 ° C, respectivamente. Enquanto isso, o controlo da temperatura foi de 37 ° C.

proliferação celular, migração e invasão Ensaio

As células de carcinoma hepatocelular foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 3 x 10

3 /bem. Após 24 h de incubação, as placas de células HCCLM3 e células HepG2 foram selados e aquecidos num banho de água durante 10 min a 39 ° C, 42 ° C ou 45 ° C e 41 ° C, 44 ° C ou 47 ° C, respectivamente . Após incubação durante 24 h, 48 h e 72 h, a proliferação foi medida usando um kit de contagem celular (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japão), como previamente descrito [28].

A migração celular e invasão foram avaliadas por Transwell Os ensaios (Corning). Resumidamente, 8 × 10

4 células em DMEM isento de soro foram semeadas para dentro da câmara superior de cada poço de placas de 24 poços contendo membranas de dimensão de poro de 8,0 uM. DMEM contendo soro fetal bovino a 10% (FBS) foi adicionada à câmara inferior de cada poço. Após 48 h, as células que tinham atingido a parte inferior da membrana foram coradas com Giemsa (Sigma), contados em 200 × ampliação em cinco áreas seleccionadas aleatoriamente por poço. O ensaio de invasão de células foi realizada de forma semelhante, excepto que 80 mL de Matrigel (0,8 mg /ml, BD Biosciences) foi adicionada a cada poço antes de 6 h as células foram semeadas sobre a membrana.

morfológica celular de observação e de imunofluorescência confocal a coloração

as morfologias das células de carcinoma hepatocelular foram observadas utilizando microscopia de fase (Leica). A imunofluorescência foi realizada como descrito anteriormente com algumas mudanças [29]. As células cultivadas foram cultivadas em placas de cultura celular e, em seguida, lavadas e fixadas. As células foram então incubadas com anticorpos primários para E-caderina, N-caderina, vimentina e β-catenina (1:200, Abcam, Hong Kong), e anti-ratinho-FITC, anti-coelho FITC e /ou tetrametil rodamina conjugada com isotiocianato de anticorpos secundários (Invitrogen). As imagens fluorescentes foram feitas usando um microscópio confocal (Olympus).

Transient transfecção de siRNAs

Para examinar melhor o papel funcional da β-catenina em comportamento maligno induzida pelo calor de células HCCLM3, transitória transfecção foi realizada em HCCLM3 células com pequena interferência RNA (siRNA) visando mRNA CTNNB1 (siCTTNB1, Gene Parma, Xangai, China) ou transfecção simulada (Gene Parma). As células foram transfectadas com um ARNsi de controlo ou um usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) em meio OPRI-MEM (Gibco) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência de β-catenina siARN foi: 5’GGGUUCAGAUGAUAUAAAUTT3 ‘

em tempo real quantitativa de Reacção transcrição reversa em cadeia da polimerase (RT-PCR)

Os procedimentos de RT-PCR utilizados foram descritos noutro local. [30]. As sequências dos iniciadores utilizados para determinar a expressão dos genes alvo são as seguintes: caracol, 5′-TGCAGGACTCTAATCCAAGTTTACC-3 ‘(para a frente), e caracol, 5′-GTGGGATGGCTGCCAGC-3′ (inverso); Slug, 5’-GGTCAAGAAGCATTTCAAC-3 ‘(para a frente), e Slug, 5′-CTGAGCCACTGTGGTCCTTG-3′ (reverso); Twist, 5’-TGTCCGCGTCCCACTAGC-3 ‘(para a frente) e Twist, 5′-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGGA-3’ (reverso).

Western Blot Assay

Os procedimentos de Western blot utilizados estão descritos em outros lugares [31]. Os anticorpos primários utilizados, incluindo:. anti-E-caderina, o anti-N-caderina, anti-vimentina, anti-β-catenina, anti-Ciclina D1 (Abcam) e anti-β-actina (Boster, Wuhan, China)

imunohistoquímica

O tecido tumoral foi fixado, incorporado e cortado com 5 mm de espessura. coloração imunohistoquímica de E-caderina, N-caderina, vimentina e β-catenina foi realizada tal como descrito previamente [30]. resultados de coloração foram avaliadas sob um microscópio de luz com uma ampliação de × 200.

Análise Estatística

As comparações estatísticas foram realizadas utilizando

t

teste de Student quando os dados foram distribuídos normalmente ou as análises não-paramétricas de Mann-Whitney U-test quando os dados não foram distribuídos normalmente. Os cálculos foram feitos usando SPSS 20.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, EUA). Os resultados foram considerados estatisticamente significativos a um

p valor

de . 0,05

resultados

proliferação intervenção Calor promovido, invasão e migração de células HCC

in vitro

o

in vitro

ensaio de proliferação de células demonstraram que os HCC tratados termicamente tinham proliferação significativamente maior do que no controlo (Fig. 1A), em especial a 45 ° C para a célula e HCCLM3 47 ° C por célula HepG2. No ensaio de migração de células, todas as células HCCLM3 tratados termicamente exibiu significativamente maior potencial de migração do que no grupo de controlo. (33,40 ± 2,16, 45,00 ± 3,21, 86,20 ± 3,39

vs.

19,00 ± 2,00), as células HepG2 tratadas com 44 ° C e 47 ° C apresentaram maior potencial de migração do que no controle (18,00 ± 1,52, 33,80 ± 2,63

vs.

11,60 ± 1,07) (Fig. 1B). No ensaio de invasão de células, as células tratadas com HCCLM3 42 ° C e 45 ° C demonstraram a capacidade invasiva aumentada (18,40 ± 0,87, 29,00 ± 1,82

vs. 5,60 ± 1,03

), as células HepG2 tratadas com 44 ° C e 47 ° C exibiram capacidade invasiva significativamente maior (12,20 ± 1,56, 19,40 ± 1,50

vs.

2,80 ± 0,67) (Fig. 1B).

(A) células HepG2 e HCCLM3 foram cultivadas com ou sem a intervenção de calor. Os 24 h, 48 h e 72 h a viabilidade celular de células de carcinoma hepatocelular foram medidos utilizando o ensaio de CCK8. intervenção de calor promovida de forma significativa HCCLM3 e células HepG2 proliferação. (B) O ensaio transpoço demonstraram que as células HCCLM3 e HepG2 tratados termicamente se observado aumento na migração e invasão capacidade em comparação com os controles.

intervenção Calor confere características mesenquimais para as células do CHC

in vitro

as células HCC tratados termicamente também pode obter um fenótipo de EMT-like, morfologicamente, as células HepG2 e células HCCLM3 às 48 h após a intervenção de calor de 45 ° C e 47 ° C, respectivamente, demonstraram uma forma do tipo fibroblastos irregular, em vez de uma aparência típica de paralelepípedos epitelial (Fig. 2A). Enquanto isso, western blot (Fig. 2B) e imunofluorescência (Fig. 2C) demonstraram uma redução na expressão do marcador de células E-caderina epitelial nestas células tratadas com calor, em comparação com as células de controlo. Ao mesmo tempo, uma maior expressão dos marcadores de células mesenquimais N-caderina e vimentina foram também detectados. Além disso, a expressão de ARNm dos factores de transcrição (EMT caracol, Slug e torção) foram detectados por RT-PCR. A amplificação de ARNm de Snail em células HCCLM3 tratado termicamente e de ARNm em células HepG2 Slug tratados termicamente foram estatisticamente superiores aos do controlo (Fig. 2D).

células HCCLM3 (a) e células HepG2 foram cultivadas depois 45 ° C e calor de intervenção 47 ° C, respectivamente. Alterações morfológicas consistentes com EMT (células fusiformes com perda da polaridade e da separação aumentada intercelular) foram observadas em células HCC tratados termicamente em 48 h, em comparação com aqueles no controle. Análise (B) Western Blot revelou a expressão de E-caderina, N-caderina, vimentina em células de carcinoma hepatocelular tratado termicamente e em controlos. HCCLM3 células e células HepG2 foram cultivadas 48 h após a 45 ° C e calor de intervenção 47 ° C, respectivamente. imunofluorescência (C) mostrou que as alterações nos marcadores EMT celulares em resposta ao calor como intervenção caracterizado por a sub-regulação de E-caderina e a sobre-regulação de N-caderina e vimentina, em comparação com os controlos. RT-PCR (D) revelou que a expressão de mRNA de EMT transcrição fatores relacionados Caracol, Lesma, e torção em células do CHC.

incompleta RFA inibiu o crescimento do tumor, mas promoveu capacidade de invasão e metástases à distância

em vivo

Nós desenvolvemos um método seguro e confiável para estabelecer um modelo de rato incompleta RFA ortotópico nu e este modelo animal pode ser o primeiro relatou incompleta modelo de ratinho nu ortotópico RFA acordo com a literatura no PubMed. No grupo RFA incompleta, o tamanho do tumor de HCCLM3-G e HepG2-G modelo foram 449.58 ± 143,19 mm

3 e 299.83 ± 131,45 mm

3, respectivamente, que foram menores do que os dos controles (1788,75 ± 248.53 mm

3 em HCCLM3-G e 942.67 ± 144,16 mm

3 em HepG2-G,

P

. 0,05) (Fig 3A). A taxa de metástases pulmonares no grupo incompleta RFA de HCCLM3-G (06/06) foi maior do que no grupo de controlo (06/02) (Fig. 3B). Para avaliar ainda o potencial metastático de cancro residual de HCCLM3-L após RFA incompleta, foram utilizadas secções de parafina em série do pulmão. As metástases pulmonares no grupo RFA incompleta aumentaram significativamente, em comparação com o grupo controle (29,67 ± 2,56

vs

2,50 ± 1,58,

P

. 0,001) (Fig. 3C). Por outro lado, a metástase pulmonar não foi detectada em células HepG2-L modelo, independentemente de receber ou não RFA (S2 Fig.), No entanto, RFA incompleta poderia induzir metástases peritoneais (6/6), e nenhuma metástase peritoneal foi observado no controle grupo (0/0) (Fig 3D.)

(a) no modelo HCC ortotópico, os tamanhos dos tumores no grupo RFA incompleta foram menores do que aqueles no controle (HCCLM-G:. 449,58 ± 143,19

vs

1788,75 ± 248,53,

P

= 0,002; HepG2-G: 299,83 ± 131,45

vs

942,67 ± 144,16,

P

= 0,008) . (B) Quantificação da bioluminescência mostrou que incompleta RFA acelerado metástase pulmonar em xenoenxertos HCCLM3-G, em comparação com os controlos correspondentes (setas indicam metástases pulmonares). Três tumores a partir de controlos e três tumores tratados incompletos RFA foram comparados por ambos campo brilhante (b) e fluorescência (F). A incidência de metástases pulmonares (6/6) estava aumentada no grupo RFA incompleta, em comparação com o grupo de controlo (06/02). (C) H E coloração confirmou que incompleta RFA induzida metástases pulmonares mais nos xenoenxertos HCCLM3-G (29,67 ± 2,56

vs

2,50 ± 1,58,

P

. 0,001). (D) Quantificação da bioluminescência mostrou que incompleta RFA poderia induzir metástases intraperitoneal em xenoenxertos HepG2-G (6/6), em comparação com os controles pareados (0/6) (setas indicam metástases intraperitoneal).

alterações induzidas incompletos RFA consistentes com EMT em xenoenxertos de carcinoma hepatocelular

a imuno-histoquímica exibiu a expressão de E-caderina membranosa típico nos contactos célula-célula no grupo de controlo HCCLM3-L, em contraste, incompletos tumores tratados com ARF mostrou o redução da expressão de e-caderina, bem como a sobre-regulação de N-caderina e vimentina. No modelo HepG2-L, a diminuição da regulação da expressão de E-caderina e a sobre-regulação da expressão de N-caderina, também foram observados no grupo RFA incompleta (Fig. 4A). Indução de EMT por RFA incompleto foram demonstrados em tumores de xenoenxerto de ambas as linhas celulares por Western blot, e foram caracterizados pela perda de E-caderina e a sobre-regulação de N-caderina e vimentina nos tecidos tumorais de grupo incompleta RFA (Fig. 4B). Além disso, a expressão de ARNm aumentada do factor de transcrição Snail EMT e Slug foram analisados ​​por RT-PCR em HCCLM3-G-derivado e xenoenxertos, respectivamente (Fig. 4C) HepG2-G-derivado.

(A) imuno-histoquímica revelou que a expressão de e-caderina foi reduzida no grupo incompleta RFA de ambos os modelos celulares de carcinoma hepatocelular, o nível de N-caderina em tecidos tumorais expressão foram maiores no grupo incompleta RFA do que em controlos, e no modelo HCCLM3-G, o aumento da expressão de vimentina também foi detectado no grupo RFA incompleta. (B) Western blot mostrou que as alterações de tumores residuais foram consistentes com EMT no grupo RFA incompleta (por exemplo, a sub-regulação de E-caderina e a sobre-regulação de N-caderina, vimentina) de ambos os modelos celulares de carcinoma hepatocelular. (C) RT-PCR mostrou a expressão de factores de transcrição Snail, Slug, e torção ao nível do ARNm em tecido de tumor. No entanto, apenas Snail mRNAs no modelo HCCLM3-G e mRNA Slug no modelo HepG2-G foram significativamente regulada para cima no grupo RFA incompleta, respectivamente (

P Art 0,05).

incompleta RFA induzida activação β-catenina acompanhado com EMT

in vivo

e

in vitro

de HCCLM3

Para explorar os mecanismos moleculares envolvidos na EMT de HCC tratado termicamente células, buscou-se testar se a sinalização β-catenina foi ativado. No modelo HCCLM3-L, coloração imuno-histoquímica revelou uma acumulação intracelular significativamente aumentada de β-catenina em incompleta de tumor tratado com ARF, mas não no modelo HepG2-L (Fig. 5A). Estes resultados eram consistentes com a expressão da proteína β-catenina no grupo RFA incompleta e o grupo de controlo por Western blot (Fig. 5B). A acumulação de β-catenina citoplasmática e nuclear é uma indicação de sinalização dependente β-catenina activada, por isso, analisar se a expressão aumentada β-catenina afectada actividade da via β-catenina. imunofluorescência mostrou que o aumento da expressão de β-catenina tanto em citoplasma e núcleo das células HCCLM3 tratados termicamente, em comparação com as células de controlo

in vitro

, no entanto, a mesma tendência nas células HepG2 tratadas com calor era não observada (Fig. 5C). Além disso, uma translocação intracelular acentuada de β-catenina nas células HCCLM3 tratados termicamente foi verificada por análise de mancha de Western (Fig. 5D). Para examinar o efeito da intervenção calor induzir a translocação nuclear de β-catenina na expressão do gene, que se voltou a atenção para a β-catenina via de sinalização de genes alvo a jusante de Ciclina D1. Western blot revelaram que a expressão da ciclina D1 foi também aumentado com um total superexpressão β-catenina em células HCCLM3 tratados termicamente

in vitro

(Fig. 5E).

(A) imuno-histoquímica revelou que a expressão β-catenina foi aumentada no grupo RFA incompleta de xenotransplantes HCCLM3-G (

P

= 0,002); em xenoenxertos HepG2-G, não houve diferença significativa entre os dois grupos na expressão β-catenina (

P

= 0,843). (B) Western blot mostrou que a expressão β-catenina acrescida nos tecidos do tumor após RFA incompleta quando comparada com os controlos de xenoenxertos HCCLM3-G. (C) coloração de imunofluorescência mostrou forte localização citoplasmática e nuclear de β-catenina em células HCCLM3 tratados pelo calor, e a expressão β-catenina membranoso típico nos contactos célula-célula de células em HCCLM3 controlo. No entanto, não houve diferença significativa entre os dois grupos na expressão β-catenina de células HepG2. (D) Distribuição de β-catenina no citoplasma e núcleo das células HCCLM3 foi detectado por Western blot

In vitro

. (E) a análise Western blot exibiu a expressão de um total de β-catenina e seu gene alvo a jusante da ciclina D1-de ambos duas células HCC

in vitro

.

O potencial invasão aumentada e mudanças EMT-like de células HCCLM3 tratados termicamente podem ser parcialmente atenuado pelo silenciamento β-catenina

in vitro

Para melhor elucidar se a ativação de β-catenina foi funcionalmente associado com invasão aumentada e alterações EMT-como em células HCCLM3 tratados termicamente, foi utilizado CTNNB1 siARN transfecção e examinados os seus efeitos sobre células HCCLM3. A fim de verificar os efeitos da transfecção, foram usadas imunofluorescência e Western blot. Como mostrado na Fig. 6A, a expressão membrana celular típica de β-catenina foi reduzida após a transfecção, e a proteína total β-catenina foi diminuída em células HCCLM3-siCTNNB1, em comparação com o controlo de células HCCLM3-simulada (Fig. 6B). Como mostrado na Fig. 6C, em condições normais, a diferença na penetração número de células entre as células HCCLM3-simulada e células HCCLM3-siCTNNB1 não foram estatisticamente significativos. No entanto, após a introdução da intervenção de calor, o número de células HCCLM3-siCTNNB1 em ambos array migração e invasão eram menos do que aqueles de HCCLM3-simulada células (Fig. 6C). Além disso, o silenciamento de CTNNB1 poderia influenciar a expressão do factor de transcrição EMT, RT-PCR revelou que a expressão de ARNm do caracol de células HCCLM3-siCTNNB1 tratados termicamente foi diminuída, em comparação com o homólogo em células HCCLM3-simulada tratados termicamente (Fig . 6D). A análise de transferência de Western também confirmou que a repressão de β-catenina afectou a expressão de marcadores EMT-β mediada-catenina em células HCCLM3 tratados pelo calor, e a expressão da Ciclina D1 também foi atenuada (Fig. 6E). Colectivamente, os resultados acima demonstram que a activação de β-catenina foi funcionalmente relevantes para a invasão e metástase de células HCCLM3 mediadas pela intervenção de calor.

(A) A coloração por imunofluorescência indicaram que a expressão β-catenina foi parcialmente atenuada por silenciamento de CTNNB1 em células HCCLM3. (B) Os níveis de proteína de β-catenina medidos por análise de Western blot após siCTNNB1 transfecção. (C) Imagens representativas da migração e invasão das células HCCLM3-mock e células HCCLM3-siCTNNB1 em transpoço ensaio. células HCCLM3-mock e células HCCLM3-siCTNNB1 foram cultivadas 48 h após o 45 ° intervenção de calor C e condição normal, respectivamente, RT-PCR (D) mostrou a expressão de mRNA relativa de fatores de transcrição Snail, Slug, e Twist. Western blot (E) revelou a expressão de fatores de transcrição relacionados EMT e ciclina D1.

Discussão

Actualmente, um número crescente de estudos clínicos têm identificado a rápida progressão da residual cancro após RFA incompleta no tratamento de HCC, [33] [32]. Pesquisas anteriores tinham fornecido vários mecanismos potenciais que podem ajudar a explicar esses achados. A hipertermia pode desempenhar um papel importante no crescimento rápido do HCC residual após RFA pela promoção da angiogénese do HCC residual através de HIF-1a /VEGFA [34]. Outro estudo demonstrou que suboptimal RFA crescimento acelerado HCC e se espalhou por transitoriamente induzir um fenótipo celular EMT-like e mais agressivo [35]. No presente estudo, nós introduzimos RFA em um modelo de rato HCC nu ortotópico e demonstrou a importância do tratamento incompleto RFA no crescimento do tumor e invasão. Embora os volumes de tumor de xenoenxerto foram reduzidos após o tratamento RFA incompleta, os tumores residuais mostraram capacidades mais invasivas em ratinhos tratados com ARF incompletos, como indicado pelo aumento pulmonar ou metástases intraperitoneal. Por outro lado,

in vitro

células HCC tratados termicamente apresentaram aumento da motilidade e invasão. Estes resultados foram consistentes com os resultados de estudos anteriores usando outros modelos de cancro em animais. Em um modelo murino de translação, Kroeze et ai. identificado que a ablação térmica incompleta estimulou a proliferação de células de carcinoma renal residuais [36]. Ke et ai. encontrado carcinoma VX2 hepática residual após incompleta RFA poderá facilitar a sua rápida progressão em um modelo de coelho carcinoma VX2, e o volume do tumor e pulmão focais metástases de coelhos tratados com RFA aumentou significativamente [37].

Evidências crescentes tinha identificado um correlação significativa entre EMT e invasividade em vários tipos de tumores [38] – [40]. Aqui, mostramos que a intervenção calor estimulada transformação de células de carcinoma hepatocelular de um fenótipo epitelial típica para um fenótipo mesenquimal em forma de fuso, acompanhado pela diminuição da regulação de E-caderina e a sobre-regulação de N-caderina e vimentina. Outra evidência fornecida por xenoenxertos em ratinhos nus após RFA incompleta foi a de que alterações nos níveis de proteína destes marcadores EMT também foram detectados. Além disso, nós também analisou os fatores de transcrição regulado para cima EMT em tumores RFA incompletos e em células do CHC tratados termicamente. Estes resultados, combinados com os resultados de estudos anteriores mencionados acima, ainda identificados que o “interruptor caderina” do tecido de tumor pode ser desencadeada por RFA incompleta que levam a metástases potencial reforçada.

Para compreender o mecanismo molecular do relação entre a intervenção de calor e as mudanças de fenótipo celular, focamos nossa atenção em β-catenina. Como um factor crucial na via de sinal de Wnt, β-catenina desempenha um papel importante na progressão do carcinoma hepatocelular, o desenvolvimento, as alterações fenotípicas e carcinogénese. β-catenina mutação é um factor que pode ser crucial para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular. As mutações envolvendo a via /β-catenina Wnt parecem ser um dos acontecimentos genéticos mais frequentes que contribui para a carcinogénese do fígado e progressão [41]. A desregulação da β-catenina pode promover a carcinogénese; camundongos heterozigotos para LKB1 supressão mostrou uma progressão acelerada para HCC quando acasalado com ratos mutantes-catenina beta adenovírus-inducible [42]. Enquanto isso, alguns relatórios tinha implicado que a mutação β-catenina foi um mecanismo bastante comum das neoplasias do mouse hepatocelular, incluindo adenomas e carcinomas [43]. Por outro lado, a correlação entre a via de sinalização β-catenina e EMT tem sido verificada em vários estudos.