Humana

Abstract

Na câncer humano, expressão do

let-7

família é significativamente reduzido, e isto está associado com os tempos de sobrevivência mais curtos em pacientes. No entanto, os mecanismos que conduzem à

let-7

downregulation em câncer ainda são em grande parte obscura. Uma vez que uma alteração no número de cópias é uma das causas da desregulamentação gene no câncer, examinamos número de cópias alterações do

let-7

família em 2.969 amostras de cancro de uma alta resolução dataset matriz SNP. Descobrimos que houve uma redução no número de cópias de

let-7

genes de uma maneira específica do tipo de câncer. É importante ressaltar que a eliminação focal de quatro

let-7

membros da família foi encontrado em três tipos de câncer: meduloblastoma (

deixe-7a-2 Comprar e

deixe-7e

), mama câncer (

deixe-7a-2

), e do ovário (

deixe-7a-3 Twitter /

let-7b

). Por exemplo, o locus genómica que alberga

deixe-7a-3 Twitter /

let-7b

foi eliminada em 44% das amostras de doentes com cancro do ovário. Também encontramos uma correlação positiva entre o número de cópias de expressão 7b deixá-

let-7b

e amadurecer

no câncer de ovário. Finalmente, mostramos que a restauração do crescimento do tumor de ovário

let-7b

expressão drasticamente reduzida

in vitro

e

in vivo

. Nossos resultados indicam que a supressão do número de cópias é um importante mecanismo que conduz à regulação negativa da expressão de específico

let-7

membros da família no meduloblastoma, mama e cancro do ovário. Restauração da

let-7

expressão em células tumorais poderia fornecer uma nova estratégia terapêutica para o tratamento de câncer

Citation:. Wang Y, Hu X, Greshock J, Shen L, Yang X, Shao Z, et al. (2012) DNA genômico número de cópias Alterações da

let-7

Família em cancros humanos. PLoS ONE 7 (9): e44399. doi: 10.1371 /journal.pone.0044399

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de fevereiro de 2012; Aceito: 06 de agosto de 2012; Publicação: 06 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada, no todo ou em parte, pela National Institutes of Health Grant R01-CA142776 (LZ), P50-CA83638-7951 Projeto 3 (LZ), Departamento de Defesa Grant W81XWH-10-1-0082 (LZ), ea Fundo Ovarian Cancer Research (LZ). ZS foi apoiado pelo Conselho de Bolsas China. JT foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant 5K12HD000849. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

Conflito de interesses:. LZ é membro do Conselho Editorial PLoS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A caracterização de mutações heterocrônicos em

Caenorhabditis elegans

revelou um evolutivamente via genética conservada que orquestra ao calendário de divisões celulares e destinos celulares, conforme apropriado para a fase de desenvolvimento do organismo [1] – [5]. Nesta via, o microARN (miARN)

let-7

controla a progressão de eventos de temporização, assegurar que a saída do ciclo celular e diferenciação terminal ocorrer no momento correcto [6], [7]. O

let-7

genes alvo

lin-28

(uma proteína de ligação a RNA) e

lin-41

(a ubiquitina ligase putativo) bloco

let- 7

maturação e interagir com as proteínas Argonaute, respectivamente. Estes genes heterocrônicos parecem formar interruptores biestáveis ​​através de loops de feedback reguladoras dupla negativa [2] – [5]. Expressão de

LIN28

e

LIN41

é altamente restrita em estágios indiferenciados, como em células estaminais embrionárias, embriões e certas células-tronco /progenitoras somáticas. Por outro lado, a sua miARN reguladora,

let-7

, mostra um padrão de expressão temporal recíproca que é aumentado dramaticamente durante a diferenciação e desenvolvimento, e que é amplamente expressos em tecidos adultos [2] – [5]. Treze membros da

let-7

família foram identificados no genoma humano [7] [8], que exibem as duas funções distintas e sobrepostas [8].

O papel da

let-7

no câncer foi descoberto pela primeira vez por Johnson

et al.

quando eles descobriram que o

let-7

família regula negativamente

deixe-60 /RAS

em

C. elegans

através da ligação a múltiplos

let-7

locais complementares em sua região 3 ‘não traduzida (3’UTR) [9]. Além disso, após ter constatado que

let-7

expressão é menor nos tumores de pulmão do que em tecido pulmonar normal, enquanto

RAS

proteína é significativamente mais elevada em tumores de pulmão, eles propuseram que

let- 7

é um gene supressor de tumor [9], o que é consistente com as observações clínicas anteriores em cancro do pulmão [10]. redução da expressão de

let-7

tem sido associada com a sobrevivência pós-operatória encurtado em pacientes com câncer de expressão [7], [11], [12], e forçada de

let-7

membros da família pode suprimir o crescimento de células cancerosas tanto

in vitro

e

in vivo

[13] – [16]. A função inibitória da

let-7

família em cancro tem sido corroborada por um número de grupos e em vários tipos de tumores [7], [11], [12]. É provável que

let-7

executa estas funções, visando vários genes. Por exemplo,

let-7

inibe muitas proteínas oncogênicas bem caracterizados, incluindo

KRAS

[9], [17], [18],

HRAS

[9] [17], [18],

HMGA2

[18] – [21],

c-Myc

[22], e

NF2

[23]. Além disso,

let-7

como alvo genes do ciclo celular múltiplos associados, incluindo

Cdc25A

[24],

CDK6

[24], e

CDK4

[25], bem como

Ciclina A

[25],

D1

[25],

D2

[24], e

D3

[25 ]. Finalmente,

let-7

reprime a expressão do fator de reprogramação

LIN28

que funciona para bloquear a diferenciação e manter populações de células-tronco do câncer [26].

Uma vez que foi encontrado que os cânceres humanos mostram uma expressão significativamente reduzida do

família deixá-7

, e que esta está associada com menor período de sobrevivência nestes doentes [7], [11], [12], a caracterização dos mecanismos levando a

let-7

downregulation no câncer tem significado clínico importante. Uma das causas da desregulamentação em genética do cancro é uma alteração no número de cópias de um dado somática de genes [27]. Também tem sido relatado que os números de cópias de miARN pode ser alterada durante a tumorigénese [28], [29]. Isso nos levou a examinar se a cópia do número do

let-7

família foram alteradas no câncer.

Resultados

Alguns deputados do

let-7

Família tem Eliminações em Copiar número no meduloblastoma, cancro da mama e cancro do ovário

Para determinar o número de cópias do

let-7

membros da família, analisamos uma alta resolução SNP array (matriz Affymetrix 250 K Sty) conjunto de dados, Tumorscape, criado pelo Instituto Broad do MIT e Harvard [27]. Quatorze tipos de cânceres humanos (um total de 2.969 espécimes de tumor) foram incluídos em nosso estudo (Tabela 1). Os dados brutos segmentada do SNP matrizes anteriores foram recuperados e analisados ​​de acordo com um protocolo padrão fornecida pelo banco de dados Tumorscape [27] e visualizado pelo Integrative Genomics visualizador (IGV) (Figura 1) [30]. As regiões genômicas, onde as alterações no número de cópias ocorreu significativamente mais frequentemente do que a taxa de fundo foram identificados usando o algoritmo GISTIC [31]. Os seguintes termos, que foram definidas pela base de dados Tumorscape [27], foram utilizados para descrever os nossos resultados. Frequência indica a fracção de cancros que apresentam amplificação /deleção no locus genómica que alberga um determinado

let-7 gene

. Os valores q baixos (limite superior = 0,25) sugerem que amplificações /eliminações neste locus são significativos e enriquecida por pressões seletivas

Os dados brutos segmentadas a partir das matrizes SNP (cancro da mama, n = 293;. câncer de ovário , n = 110; desordem mieloproliferativa, n = 215) foi obtida a partir da base de dados Tumorscape, analisada, então visualizadas por Integrative Genomics Viewer. Painel esquerdo: todo genoma visão ampla dos perfis no número de cópias de doença mieloproliferativa, câncer de mama e câncer de ovário (localizações genômicas estão à esquerda; amostras tumorais estão na parte superior). O vermelho representa a amplificação e azul representa a eliminação. Painel direito:. perfis número de cópias do cromossomo 22 na região do

deixe-7a-3 Twitter /

let-7b

conjunto

como mostrado na Figura 2, o

let-7

família está presente como treze membros situados em oito loci no genoma humano [7], [11], [12]. Todos os oito loci genômicos foram analisados ​​em nosso estudo. A maioria dos membros da família, como

deixe-7a-1 |,

deixe-7F-1,

e

let-7d

, o cluster juntos. (A

let-7

genes são designados pela inclusão de uma carta para designar uma sequência madura distinta, e um número para indicar que a mesma sequência madura está presente em loci genómico distinto.) Em resumo, verificou-se que quatro

let-7

loci abrigar cinco

let-7

membros mostrou deleções significativas no número de cópias de uma maneira específica do tipo de câncer (Figura 2). eliminações de foco destes

let-7

membros da família foram encontrados em três tipos de câncer: meduloblastoma (

deixe-7a-2,

frequência de 25%;

deixe-7e,

freqüência de 9%), câncer de mama (

deixe-7a-2,

frequência 47%), e do ovário (

deixe-7a-3 Twitter /

let-7b,

frequência de 44%). Isto sugere que genômicas supressões no número de cópias focal de

let-7

pode desempenhar um papel importante durante tumorigênese nos tipos de câncer acima. Além disso, duas eliminações não focais (

deixe-7a-3 Twitter /

let-7b,

frequência de 40%;

let-7

g, frequência de 36%) também foram encontrados no câncer de mama, e supressões não focais individuais foram encontradas no melanoma (

deixe-7a-2,

frequência 43%) e carcinoma do pulmão de não-pequenas células (

deixe-7e,

frequência de 31%). Finalmente, apenas um

let-7

membro da família,

let-7i

, foi encontrada para ser amplificado (no carcinoma do pulmão de células não-pequenas). No entanto, esta foi apareceu um nível braço cromossoma amplificação, não focal, indicando que pode ser um “passageiro” alteração genética. Tomados em conjunto, os nossos dados indicam que uma redução no número de cópias de determinado

let-7

genes membro da família foram freqüentes em meduloblastoma, mama e cancro do ovário.

Resumo do número de cópias de DNA alterações

let-7

família em 14 tipos de cânceres humanos (n = 2.969). O

let-7

família é composta por treze membros localizados em oito loci do genoma humano. Muitos deles, como

deixe-7a-1 |,

deixe-7F-1 | e

let-7d

, aglomerado em conjunto (A). q-valores baixos (limite superior = 0,25) sugerem que amplificações /eliminações neste locus são significativos e enriquecida por pressões seletivas. verde escuro representa deleção focal da

família deixá-7

.

Copy Number Alteração do

let-7b

está positivamente correlacionada com maduro

let- 7b

expressão em cancro do ovário

Para determinar se as alterações no número de cópias de

let-7b

afetar madura

let-7

expressão no câncer, examinamos um câncer de ovário conjunto de dados do Cancer Genome Atlas (TCGA) [32], porque este conjunto de dados genômica independente contém dados combinados em ambos número de cópias do genoma (matriz SNP) e de expressão miRNA madura (array miRNA) a partir de uma grande colecção de amostras de tumores de ovário humano. 3 dados de nível (segmentado de dados de matriz SNP e dados de matriz miRNA normalizados) foi recuperado do TCGA [32]. Foram identificados um total de 537 tumores com os dados de ambos os SNP e matrizes de miRNA. Consistente com os dados da nossa análise Tumorscape, houve uma supressão no número de cópias no

deixe-7a-3 Twitter /

let-7b

lugar nas amostras de pacientes com câncer de ovário (Figura 3A ). Uma vez que a madura

let-7

uma sequência é codificada por três

let-7 of a genes, que estão localizados em três locos cromossômica diferente, não poderíamos examinar a correlação entre o número de cópias e expressão para

deixe-7a-3

. Assim, analisamos a correlação entre eliminações no

deixe-7a-3 Twitter /

let-7b

lócus e expressão de maturidade

let-7b

neste conjunto de dados. Como mostrado na Figura 3 B e C, a expressão de maturidade

let-7b

foi significativamente e positivamente correlacionada com

let-7b número

cópia em amostras de cancro do ovário (p 0,0001, R = 0,46, n = 537). Nós não encontrou uma correlação entre quaisquer outras

let-7

membros da família com o

let-7b número

cópia (Figura 3D). Isto demonstra que a redução do número de cópias de

let-7b

leva a uma redução na expressão de maturidade

let-7b

no câncer de ovário.

Nível 3 (segmentado dados de matriz SNP e dados da matriz de miRNA normalizados) foi recuperado do TCGA. Foram identificados um total de 537 tumores com ambos os dados matrizes miRNA SNP e. Painel esquerdo A.: todo genoma visão ampla de perfis do número de cópia em câncer de ovário (localizações genômicas estão à esquerda; amostras tumorais estão na parte superior). O vermelho representa a amplificação e azul representa a eliminação. Painel direito: perfis número de cópias do cromossomo 22 na região do

deixe-7a 3-

/

let-7b

cluster. mapa B. Heat of madura

let-7

níveis de expressão da família em espécimes TCGA combinados. As amostras são dispostas na mesma ordem que os dados de SNP. C. correlações entre

let-7b número e cópia

DNA amadurecer

let-7b

níveis de expressão em cancro do ovário do conjunto de dados TCGA. D. As correlações entre a

número e expressão cópia

DNA níveis de miRNA madura de 7b deixá-other

let-7

membros da família em câncer de ovário do conjunto de dados TCGA.

Restauração de

let-7b

Expressão reduz significativamente o crescimento do tumor de ovário

in vitro

perda de focal no número de cópias do

let-7

família membros em meduloblastoma, mama e cancro do ovário sugere fortemente que

let-7

pode ter um papel importante na tumorigênese. Portanto, restaurando a sua expressão podem suprimir o crescimento do tumor nestes cancros. Para testar esta hipótese

in vitro,

we transfectadas duas linhas de células de cancro do ovário, A2780 e 2008, com a imitar um 7b deixá-

(a oligonucleotídeo ARN de cadeia dupla). Uma linha celular epitelial humana cultivadas superfície do ovário (mangueira) foi utilizado como um controlo, e o crescimento das células foi monitorizado por meio de um ensaio MTT. Às 72 horas pós-transfecção, verificou-se que o

let-7b

imitam reduziu significativamente o crescimento de células em que as células cancerosas (Figura 3 A e B). Não houve redução no crescimento celular observado nas células de controlo (Figura 4C). Isto sugere que a restauração da

let-7b expressão

em células tumorais pode ter grande potencial terapêutico para o tratamento de câncer de ovário.

O

let-7b

controle de mímica e oligo (30 nM) foram usados ​​para transfectar a, 2008 (B) e a mangueira (C) células por lipofectamina A2780 (a). O crescimento celular foi monitorada por um ensaio MTT.

Restauração de

let-7b

Expressão reduz significativamente ovário Tumor Crescimento

in vivo

para avaliar o

in vivo

potencial terapêutico do

let-7b

mímica, um modelo do rato do cancro do ovário fase tardia ortotópico foi gerado por injeção intraperitoneal de 10 × 10

6 câncer de ovário ( A2780) células em ratinhos nus fêmea (Figura 5A). Após duas semanas, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos, a serem tratados quer com o

let-7

mímica ou o oligonucleótido de controlo por injecção i.p. injecção. Os ratinhos foram tratados de três em três dias para um total de quatro tratamentos (Figura 5A), e os nódulos tumorais foram colhidas três dias após o último tratamento (Figura 5B). Verificou-se que o peso dos nodos de tumor foi significativamente reduzido nos ratos tratados com o 7b deixou-

mímica em comparação com os controlos (Figura 5 B e C). Nós também monitoraram a atividade

let-7b endógena usando um

let-7b repórter

luciferase constitutivamente expresso que continha as sequências complementares para

let-7

na 3’UTR [33 ], [34]. Nós consistentemente descobriram que o tratamento com o 7b deixá-

imitam diminuiu significativamente a atividade da luciferase

in vivo

em comparação com o grupo controle (Figura 5 D e E). Finalmente, descobrimos que o tratamento com o

let-7b

imitam aumentou significativamente a 7b deixá-

níveis de expressão no tratamento em comparação com o grupo controle (7,03 ± 5,73 vezes, p = 0,047) . Enquanto isso, os níveis de expressão de mRNA bem conhecido

let-7

genes alvo, tais como

CCND1

,

Cdc25A

,

HMGA2

,

IL6

e

LIN28B

foram significativamente diminuiu

let-7b

tratamento mímica. Tomados em conjunto, isto demonstra que o

in vivo

entrega de um

let-7b

mímica pode funcionalmente restaurar

let-7

expressão e notavelmente reduzir o crescimento do tumor em um pré- modelo animal clínico de câncer de ovário.

Linha do tempo do transplante de células tumorais através de injecção intraperitoneal, tratamento de imagem, e recolha de amostras de tumor no modelo do rato do cancro do ovário fase tardia ortotópico. nódulos B. Tumor recolhido de cada ratinho três dias após o último tratamento. C. Síntese dos pesos dos nodos de tumor a partir de cada ratinho. D. endógena

let-7b

actividade em cada rato como monitorado por um

let-7b sensor de

luciferase. E. Resumo da intensidade luciferase durante o tratamento.

Discussão

O

let-7

família é uma das primeiras famílias supressores de tumor miRNA mostrado ser envolvidos no câncer humano. Expressão dos membros do

let-7

família tem sido relatada a ser significativamente regulada negativamente em vários tipos de câncer, e isso diminuiu

let-7

expressão tem sido correlacionada com resultados clínicos mais pobres. Dois mecanismos moleculares têm sido propostas que podem levar a regulação baixa global das

let-7

expressão no câncer. Em primeiro lugar, as proteínas chave na via biogénese de miARN, tais como Dicer e Drosha, pode ser notavelmente desregulado no cancro [35]. Isto pode resultar numa regulação negativa não selectiva, global de miARN, incluindo a família deixou-7. Além disso, tem sido demonstrado que a proteína de ligação a ARN,

LIN28,

que inibe selectivamente algumas famílias de miARN, incluindo o

let-7

família [36] – [41], é activado numa grande percentagem de doentes com cancro [42] – [51]. No entanto, os dois mecanismos acima não podem explicar a constatação de que, na maioria dos tipos de câncer, somente alguns

let-7

membros da família são reprimidos. Por exemplo, a expressão de

let-7

um,

let-7

c, e

let-7

g foram encontrados para ser reprimidos seletivamente no cancro da mama [ ,,,0],52], sugerindo que existem outros mecanismos independentes que afectam a expressão de cada indivíduo

let-7

membro da família.

avanços recentes em tecnologias de caracterização do genoma de alto rendimento revelou que os genomas de cancro são altamente desordenada, com extensas mudanças na estrutura dos cromossomas e número de cópias do gene. Também tem sido relatado que os números de cópias miARNs são normalmente alteradas de cancro humano [28], [29]. Por exemplo, o

mir-16-1 /mir-15a aglomerado

no cromossoma 13q14 foi suprimida em mais de 50% dos pacientes com leucemia linfocítica crónica [53]. Além disso, a ampliação do

C13orf25 /mir-17~92

cluster no cromossomo 13q31-32 tem sido relatada em pacientes com linfoma [54], [55]. No presente estudo, mostramos que três

let-7

loci, que abrigam quatro

let-7

membros (

deixe-7a-2

,

deixe-7a-3

,

let-7b

, e

deixe-7e

), têm deleções no número de cópias de uma maneira específica do tipo de câncer em meduloblastoma, cancro da mama, e cancro do ovário. Mais importante ainda, foi confirmada a correlação entre a

let-7

copiar alterações numéricas e amadurecer

let-7 expressão

no câncer de ovário. Estes resultados indicam que a supressão do número de cópias é um importante mecanismo que conduz à regulação negativa da específica

let-7

membros da família em pelo menos estes três tipos de cancros humanos. No entanto, este mecanismo é do tipo de câncer provável específica, uma vez que não encontramos significativas alterações no número de cópias do

let-7

família em outros tipos de câncer, como de cólon e próstata.

importante, reduções focais nos números de cópias do

let-7

família sugerem que a supressão da

let-7

pode desempenhar um papel importante durante tumorigênese, e sugere que o restabelecimento da expressão destes

let-7

membros da família pode ser uma nova estratégia para o tratamento de meduloblastoma, cancro da mama e cancro do ovário. Atuais rápidos avanços na terapia oligonucleotídeo /nanopartícula criar otimismo realista para o estabelecimento de miRNAs como uma nova e potente alvo terapêutico e /ou modulador resistente à quimioterapia no câncer. Para testar esta hipótese, entregamos um pequeno RNA imitar para

let-7b

, o mais frequentemente suprimida

let-7

membro da família em pacientes com câncer ovariano, a células de cancro do ovário

em vitro

e

in vivo

. Descobrimos que restauração da

expressão let-7b

crescimento do tumor drasticamente inibida. De acordo com as nossas observações, restauração de

let-7

expressão também tem sido mostrado para reduzir o crescimento tumoral em modelos pré-clínicos de outros tipos de cancro, tais como cancro do pulmão [13] – [16], em que

let-7

família está globalmente diminuiu [9], [10]. Dado que

let-7

inibe simultaneamente múltiplas vias oncogênicas que estão envolvidos na maioria dos passos de tumorigênese (como

RAS, MYC

, e

HMGA2)

, restauração de

let-7

expressão em células tumorais fornece uma nova estratégia terapêutica para tratar o câncer. Curiosamente, descobrimos que nosso

let-7b

tratamento não afetou significativamente o crescimento normal do ovário células epiteliais da superfície, sugerindo que o tratamento para restaurar

let-7

expressão pode ser menos tóxico do que a quimioterapia tradicional. Este achado pode ser devido ao fato de que as células normais já expressam níveis mais elevados de endógena

let-7

e, portanto, a entrega de adicional

let-7

não aumenta significativamente a sua actividade silenciamento de genes em as células normais. Outra explicação pode ser que o contexto celular jusante é diferente nas células tumorais versus células normais. Por exemplo, alguns alvos diretos de

let-7,

como

LIN28, RAS, MYC

e

HMGA2,

não são expressos ou ativados nas células normais, mas são genes do “driver” que promovem o crescimento celular em tumores

foi demonstrado por laboratórios independentes que a repressão nos seus níveis de expressão do gene alvo por miARNs é relativamente leve [56] – [59]., embora cada um miARN pode especificamente e, simultaneamente, atingir centenas de ARNm transcritos [56], [59]. Em consonância com esse comportamento comum de miRNAs, que mostrou que os níveis de múltipla expressão mRNA bem conhecido

let-7

genes alvo, tais como

CCND1

,

Cdc25A

,

HMGA2

,

IL6

e

LIN28B

foram significativamente diminuiu

let-7b

tratamento mímica (todos p 0,05). No entanto, os efeitos da repressão sobre os níveis de mRNA por

let-7b Quais são tipicamente modesta (de 58,0% ± 0,03% a 78,9% ± 0,08%). Ele poderia trazer benefícios terapêuticos importantes para o

let-7b terapia

de substituição em comparação com as estratégias baseadas siRNA: Em primeiro lugar, os efeitos colaterais da restauração da

let-7b

em pacientes com câncer pode ser leve e limitado. Em segundo lugar, vários oncogênicos genes /vias, como a regulação do ciclo celular, DNA danos resposta, a diferenciação de células-tronco do câncer e inflamação poderia ser alvo simultaneamente. Em concordar com esta hipótese, na verdade, não encontramos que o

let-7b terapia

substituição afetados significativamente no crescimento das células epiteliais normais na dose terapêutica (Figura 4C). Além disso, miARNs incluindo

let-7

regular negativamente a expressão do gene alvo por dois mecanismos principais, ou seja, ARNm de clivagem (nível de transcrição) e /ou de repressão de translação (nível da tradução), de uma maneira específica da sequência [7] [8], [11], [12]. Esta poderia ser uma outra explicação porque só encontrada repressão modesto da expressão do gene alvo, em que os níveis de mRNA foram detectados por em tempo real de RT-PCR. Finalmente, a dosagem para

let-7b

entrega no presente estudo foi determinado por uma experiência de dose-dependente. Utilizou-se a dose mínima resposta funcional (30 nM) durante os nossos ensaios em tempo real de RT-PCR. Quando aumentamos a dose de

let-7b

entrega, encontramos os efeitos do

let-7b terapia de reposição

em seus genes-alvo foram notavelmente aumentada.

Tem foi bem demonstrado que os adultos

let-7

expressão é um biomarcador robusto para prever o resultado clínico em pacientes com câncer. Por exemplo, uma revisão sistemática de 43 estudos publicados mostra que

let-7

é o miRNA com mais frequência e significativamente associada com os resultados clínicos em pacientes com câncer [60]. Para examinar a correlação entre o

let-7b /deixe-7A3

alterações no número de cópias do cluster (supressão vs não-supressão) e evolução clínica dos pacientes, um total de 491 em estágio avançado (estágio III e -IV ) tumores com informações de sobrevivência bem anotada foi examinado por análise de sobrevivência de Kaplan-Meier. No entanto, não encontramos correlação significativa entre os

let-7b /deixe-7A3

alterações no número de cópias do cluster e sobrevida global neste conjunto de amostras (p = 0,343). Este resultado indicou que o número de cópias de DNA alteração não é a única razão pela qual o madura

let-7

expressão é reduzida em câncer. Em concorda com esta observação, nós e outros grupos independentes relataram que miRNA desregulamentação no cancro do ovário humano foi conduzido por múltiplos mecanismos [29], [61], [62]. Em primeiro lugar, foi demonstrado que a maioria dos miARNs primárias são transcritas a partir do promotor de pol II e regulada por factores de transcrição. Vários exemplos mostram miRNA desregulamentação no cancro do ovário pela desregulação da transcrição têm sido relatados. Em segundo lugar, estudos recentes sugerem que alterações epigenéticas desempenham um papel crítico na desregulamentação expressão miRNA em cancros do ovário humanos. Em terceiro lugar, a mutação também pode contribuir para a regulação negativa de miRNAs maduros. Finalmente, as proteínas chave na via biogênese miRNA pode ser disfuncional ou desregulamentado no cancro, e pode aumentar tumorigênese. Portanto, desregulamentações de transcrição, alterações epigenéticas, mutações, alterações no número de cópias de DNA e defeitos na maquinaria da biogênese miRNA poderiam contribuir cada um, quer isoladamente, mas mais provavelmente em conjunto, ao

let-7

desregulamentação família em câncer humano [29 ], [61], [62]. No presente estudo, nós relatamos que

let-7b /deixe-7a3

conjunto excluído no percentual superior a 40% dos cânceres de ovário e de mama. Nós acreditamos que é um dos mecanismos importantes para diminuir

let-7

expressão nestas doenças, embora outros mecanismos, tais como desregulamentação transcrição, alterações epigenéticas, mutações e deficiências do mecanismo biogênese miRNA são necessários para ser ainda caracterizada em cancros do ovário e da mama.

Materiais e Métodos

SNP e miRNA Microarray Recuperação de dados e Análise

os segmentares dados brutos dos microarrays SNP (Affymetrix 250 matriz K Sty) foi baixado do banco de dados Tumorscape (criado pelo Instituto Broad do MIT e Harvard) [27] e analisadas seguindo um protocolo padrão fornecido pelo Tumorscape, então visualizada usando o Integrative Genomics Viewer (IGV) (Figura 1) [30]. Quatorze tipos de cânceres humanos (um total de 2.969 espécimes de tumor) foram incluídos em nosso estudo (Tabela 1). Os 3 dados de nível (segmentado de dados de matriz SNP e dados de matriz miRNA normalizados) foi baixar a partir do Cancer Genome Atlas (TCGA) conjunto de dados [32], e um total de 537 tumores com ambos dados de matriz miRNA SNP e foram identificados. As regiões genômicas em que alterações no número de cópias ocorreu significativamente mais frequentemente do que a taxa de fundo foram identificados usando o Genomic identificação de alvos significativos em Câncer algoritmo (GISTIC) [31]. As informações para os tipos de tumores dos espécimes do banco de dados Tumorscape estava disponível no portal do Tumorscape (https://www.broadinstitute.org/tumorscape) [27]. Mama e tumores ovarianos informação clínica estava disponível a partir dos perfis publicados (GSE7545 e GSE19399) [27], [63], [64]. Todas as amostras de cancro do ovário TCGA são tumores de ovário seroso de alto grau, que foram coletadas de pacientes recém-diagnosticados com adenocarcinoma seroso do ovário que foram submetidos à ressecção cirúrgica e não receberam tratamento prévio para a sua doença, incluindo quimioterapia ou radioterapia. Todos os casos tiveram que ser de histologia serosa, mas foram recolhidos independentemente da fase cirúrgica ou grau histológico. Os casos foram classificados de acordo com o sistema de estadiamento FIGO 1988. O detalhe informação clínica dos espécimes do banco de dados TCGA estava disponível no portal TCGA dados (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [32].

linhas celulares e celular Cultura

linhas de células de cancro do ovário foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e da Divisão de Tratamento do câncer and Repository Diagnóstico (DCTD) Tumor /Cell Line. Todas as linhas celulares de cancro foram cultivadas em meio RPMI 1