Abstract

esferóides multicelulares são enriquecidas em ascite de câncer epitelial de ovário pacientes (OVCA). Eles representam uma população celular invasivo e resistente à quimioterapia, fundamental para a disseminação metastática. Os mecanismos moleculares que desencadeiam a saída invasiva única célula de esferóides permanecerá enigmático. forminas MDIA são effectors Rho GTPase que são fundamentais reguladores da dinâmica do citoesqueleto de actina F. Nossa hipótese é que mDia2-driven F-actina dinâmica promover transições invasivos célula única em três dimensões esferóides clinicamente relevantes (3D) OVCA. O presente estudo é uma dissecção da contribuição da formin mDia2 F-actina factor de montagem em transições invasivos e utilizando um modelo de cancro do ovário esferóide clinicamente relevante. Nós mostramos que a atividade mDia2 RhoA-dirigida é necessária para a organização esferóide apertado, e enriquecimento de mDia2 nas saliências celulares invasivos de esferóides OVCA429 embebidos em colágeno. Esgotando mDia2 no ES-2 esferóides uma maior difusão invasiva de células individuais em forma de amebóides. Isto contrasta com esferóides tratados com controle de siRNA, onde um programa invasão mesenquimais predominaram. A inibição da outra efetoras RhoA, ROCK, não teve impacto no ES-2 formação esferóide, mas a invasão esferóide drasticamente inibida através da indução de uma morfologia muito alongada. inibição simultânea de rocha e mDia2 bloqueou a invasão de células single do ES-2 esferóides de forma mais eficaz do que a inibição da proteína quer sozinho, indicando que a saída invasiva de células amebóides de esferóides mDia2-empobrecido é dependente do ROCK. Os nossos resultados indicam que vários efectores GTPase deve ser suprimido a fim de bloquear completamente a saída invasiva de esferóides de cancro do ovário. Além disso, a interacção entre firmemente regulado ROCK e vias de sinalização mDia2 dita as capacidades invasivas e o tipo de programa utilizado invasão por células cancerosas do ovário derivado de esferóides com motilidade. Como a perda do mDia2 gene que codifica,

DRF3,

tem sido associada à progressão e metástase de câncer, nossos resultados definir o cenário para a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na saída mDia2 dependente das células invasoras de tumores epiteliais primários.

Citation: Pettee KM, Dvorak KM, Nestor-Kalinoski AL, Eisenmann KM (2014) An mDia2 /ROCK Sinalização do Eixo Regula invasiva Egress de epitelial do cancro do ovário esferóides. PLoS ONE 9 (2): e90371. doi: 10.1371 /journal.pone.0090371

editor: Pontus Aspenstrom, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 22 Outubro, 2013; Aceito: 03 de fevereiro de 2014; Publicação: 28 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Pettee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação da Universidade de Toledo (KME, ALNK), o Departamento de Defesa Prêmio do cancro do ovário Concept (KME, OC073269), o Fundo de Doações Memorial DeArce de Apoio para a Investigação e Desenvolvimento (KME) médica e do National Cancer Institute ( KME, ALNK R01CA151632). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário (OVCA) é o 5

th principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres americanas. A American Cancer Society prevê 22.000 novos diagnósticos e 15.000 mortes por câncer epitelial de ovário (EOC) em 2012. As células derivadas da conta epitélio de superfície do ovário para 90% da OVCA primária e lesões metastáticas [1]. OVCA células esfoliadas são detectados em ascites peritoneais como células únicas, pequenos agregados ou altamente ordenada e compactadas esferóides multicelulares [1] – [5]. esferóides compactadas são mal compreendidos estruturas invasivas e quimiorresistentes. adesões célula-célula, apoiado em parte por N- e E-caderina conduzir a formação e compactação de esferóides OVCA [6]. Não está claro qual pistas moleculares ou ambientais específicos contribuir para transições invasivas nos esferóides.

Um crescente corpo de evidências sugere que esferóides compactos promover metástases OVCA dentro da cavidade peritoneal.

In vitro, as células dentro

esferóides OVCA submetidos a crescimento independente de ancoragem, desagregar ao aderir à tridimensionais (3D) géis de colagénio-I e de invadir células mesoteliais subjacentes [7] – [9]. É importante ressaltar que a formação esferóide e compactação se correlacionam diretamente com a invasão [3], [4]. células OVCA humanos com a capacidade de formar esferóides compactos

in vitro

pode gerar tumores sólidos quando injetada por via intraperitoneal em ratinhos imunodeficientes. Em contraste, as células que não formam esferóides não conseguem formar tumores em ratinhos [10]. A aparente ligação entre a formação de esferóides compactas e disseminação de células OVCA invasivos sublinha a necessidade de uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares que fundamentam esses processos [11].

Em resposta a sinais extracelulares, as células cancerígenas derivadas de epiteliais pode converter a um fenótipo mesenquimal semelhante. Isto pode ser conseguido por meio de dissociação de junções apertadas e aderentes (AJ), desprendimento de células individuais a partir de folhas ou estruturas epiteliais e 3D, a migração para os tecidos adjacentes (revisto em [12] – [15]). Hallmark alterações celulares e moleculares associados à transição epitelial-mesenquimal (EMT) e invasão do estroma circundantes incluem perda de expressão da caderina-E, a regulação positiva de metaloproteases de matriz (MMP), a ativação dos reguladores da transcrição e da adopção de um fuso-like, polarizada morfologia fibroblástica. Durante a migração mesenquimais, a expansão do bordo de ataque e retração do bordo de fuga das células móveis envolve coordenar a regulação da cortical polimerização F-actina e contração actomiosina. montagem de F-actina precede a contração de promover a extensão das protuberâncias ricas em actina, e fosforilação mediada-ROCK da cadeia leve de miosina (pMLC) regula a contração actomiosina [16].

forminas surgiram como principais reguladores de F-actina e dinâmica dos microtúbulos do citoesqueleto. proteínas da família Formin são effectors Rho GTPase. Os diáfano (MDIA) forminas relacionados com mamíferos (mDia1-3) têm papéis críticos em diversas atividades celulares, incluindo a transcrição de genes, progressão do ciclo celular e tráfico de membrana. proteínas MDIA também regulam a F-actina redes essenciais para a manutenção da integridade de estruturas epiteliais multicelulares [17] – [22]. Por exemplo, a depleção de MDIA inibe a formação de junções de célula-célula em células MDCK [23], e interrompe MCF-7 monocamadas mislocalizing por E-caderina longe de contactos célula-célula [24]. Além disso, suprimindo diáfano, o homólogo MDIA em

D. melanogaster,

diminuiu pMLC em AJs e desestabiliza os limites de tecido normal e aumento protrusiveness celular [25]. Colectivamente, estes dados implicam o eixo de sinalização MDIA-Ró na organização de estruturas 3D complexos importantes para a morfogénese, e potencialmente, para a progressão do tumor.

Várias linhas de evidência sugerem que forminas desempenham papéis conservados na regulação da motilidade celular de cancro , invasão e metástase. mDia2 influencia o comportamento invasivo das células de câncer de mama, o que, em última análise depende de MMP e formação de saliências ricas em actina chamados invadopodia [26]. Interação de mDia2 com o seu regulador negativo, DIP [27], promove a transição da mesenquimais células MDA-MB-231 em células amebóides dependente da ROCHA altamente móveis e invasivos [28]. Da mesma forma, a modulação da mDia2 também afeta invasão amebóides e migração na DU145 células cancerosas da próstata [29], [30]. Um formin relacionada, mDia1 dirige a quimiotaxia de neutrófilos [31], [32], a invasão de células [33], e a migração de células T e tráfico em órgãos linfóides periféricos [34], [35]. Outros membros da família Formin, incluindo isoformas do LRF, FHOD e Formin1, também têm sido implicados na regulação da plasticidade migratório e interconversão entre mesenquimais e motilidade amebóide na mama e outras células tumorais [36] – [41].

A genes que codificam MDIA ou FMNL /FRL são frequentemente perdido nos cancros da mama, da próstata, colo-rectal, carcinomas hepáticos, e cancros hematopoiéticas [29], [30], [41], [42]. proteínas MDIA também funcionar no ovário normal, bem como cancros do ovário. Rompimento de

diáfano

está associada com falência ovariana prematura [43]. Perda de

DIAPH1 /DRF1

, o mDia1 gene que codifica, foi mostrado em um modelo de progressão OVCA [10]. Além disso, os genes que codificam mDia2 (

DIAPH3 /DRF3

) e formin 1 (

FMN1

) foram reprimidos no início de células OVCA fase tardia. Isto foi acompanhado por uma perturbação na acumulação de actina F e aumentos na deformabilidade de células [44], [45]. Tomados em conjunto, as observações anteriores sugerem um papel para a dinâmica de actina controlados MDIA na progressão da doença de ovário. Não está claro se as mudanças no estado de ativação de adesões célula-célula influência MDIA para manter a integridade esferóide OVCA, ou se a modulação da MDIA dirige as transições que fundamentam a invasão da célula para o mesotélio subjacente.

Para explorar estas questões, examinamos o papel da sinalização Rho /MDIA na migração OVCA e invasão. Nossos resultados mostram que a RhoA /mDia2 /ROCK sinalização unidades eixo transições invasivos no ES-2 células OVCA em culturas 2D e um modelo esferóide invasão 3D. A activação de RhoA foi aumentada durante a formação de esferóides, enquanto a supressão de mDia2 interrompido arquitectura esferóide. Em contraste com os efeitos da mDia2, depleção de mDia1 não teve efeito sobre a formação ou integridade dos esferóides. Quando esferóides mDia2-depletados foram incorporados em geles de colagénio-I, foi possível aumentar a invasão de células individuais através de uma transição amebóide dependente de ROCK. Estes resultados demonstram a interdependência dos mDia2 e ROCHA para a promoção de transições invasivos em esferóides OVCA.

Resultados

localização espacial das proteínas MDIA na migração de células OVCA humanos

Obtivemos um painel de linhas celulares humanas que representam OVCA vários subtipos clínicos, incluindo adenocarcinomas de células serosas e claras. Algumas destas linhas de células formar esferóides compactos (OVCA429 e Es-2), enquanto os outros formam estruturas em favo de mel mais frouxos (SKOV3) (Figura S1 e [4]). Todos os tipos de células expressaram mDia1 e mDia2, independentemente da capacidade de formação de esferóides (Figura 1A).

. mDia1 e mDia2 foram avaliadas por imunoprecipitação e /ou Western blot num painel de células humanas OVCA. Tubulina foi transferido como um controlo de carga. B. A adesão celular para BSA- ou poços Collagen-I-revestido. O experimento foi realizado em poços em triplicado e a experiência foi repetida três vezes. os valores de p são versus BSA colagénio-I para cada linha celular. Os ensaios de migração C. Transwell foram realizadas em poços em triplicado e a experiência foi repetida três vezes, durante 5 h para com SFM ou FBS a 20%. MDA-MB-231 células de cancro da mama humano são um controle migratório positivo. os valores de p são para SFM vs 20% de FBS para cada linha celular. Os ensaios de invasão D. Transwell foram realizadas em poços em triplicado e a experiência foi repetida três vezes durante 24 h a 2 mg /mL de colagénio-I géis em relação quer SFM ou FBS a 20%. As células MDA-MB-231 é um controlo positivo invasão. os valores de p são versus o SFM 20% de FBS para cada linha celular. células de E. OVCA429 migravam para 20% de FBS durante 5 h numa câmara de Dunn. mDia1, mDia2 e a arquitectura de F-actina foram visualizados por IF. Seta indica a direção do gradiente. N. S. = Não significativo. Todas as barras de erro correspondem a SDS mostrados são experiências representativas de cada ensaio.

O painel OVCA foi exibido para o adesivo, migratória e propriedades invasivas (Figura 1, B-D, respectivamente) para identificar um altamente invasivo , linha de células formadoras de esferóide. SKOV3, OVCA429 e ES-2 células foram igualmente adesivo em substratos de colágeno 2D. No entanto, o OVCA429 e células ES-2 foram mais migratório e invasivo do que a linha de células SKOV-3 em resposta a gradientes de FBS. Portanto, nossos estudos restantes foram realizadas tanto com OVCA429 ou ES-2 células.

A localização espacial de proteínas MDIA endógenos foi avaliada em migrar OVCA429 células usando uma câmara de Dunn para manter um gradiente FBS estável. Imunofluorescência (IF) foi efectuada após 5 h de migração (Figura 1E). Ambos mDia1 e mDia2 exibiu uma distribuição polarizada orientada para o gradiente FBS dentro migrando OVCA429 células (seta indica a localização gradiente). mDia1 e mDia2 localizada predominantemente para as lamelas, em oposição ao lamellapodia rico F-actina, como visto anteriormente na migração de células epiteliais [46]. Estes resultados sugerem um possível papel para mDia1 e /ou mDia2 na estabilização piscinas de actina corticais durante a quimiotaxia OVCA.

Exigência de mDia2 na migração quimiotáctica em OVCA429 células

A seguir, perguntou se a atividade da proteína MDIA e /ou expressão foram necessários para a migração quimiotáctica. A distância migraram por células OVCA429 transfectadas em uma câmara de Dunn foi quantificada por rastreamento em células vivas. As células foram modificadas para expressar tanto proteínas MDIA-YFP-fusão sozinho, ou várias combinações de controle YFP vector e proteínas marcada com Flag. MDIA sobreexpressão foi validado por Western blotting (Figura 2A). As células que expressam dominante negativo YFP-MDIA-FH2ΔN, o que interfere tanto com mDia1 e mDia2-driven montagem F-actina, [34], [47], [48] migraram mal em relação aos controles YFP. Por outro lado, as células que expressam o constitutivamente activado mDia2 M1041A [49], em que o Estado autoinhibited é aliviada, exibiu aumento da migração em relação ao YFP + 3XFLAG controles vazio vetor. mDia1 superexpressão não alterou migração celular em relação ao controle de vetores vazios. Estes dados sugerem que mDia2 autoinibição deve ser libertado de modo eficaz para a migração celular a ocorrer. Na série seguinte de estudos, o papel de mDia2 na migração quimiotáctica foi avaliada por sementeira mDia2-empobrecido em células OVCA429 transwells. Embora as células tratadas com ARNsi de controlo de lipidos e robustamente migrado para FBS (em relação aos poços de controlo sem soro), a migração foi significativamente reduzida nas células mDia2-empobrecido (Figura 2C). Colectivamente, estes dados indicam que a expressão e /ou actividade mDia2 é necessária para a migração quimiotáctica óptima de células OVCA429.

. Transfectados OVCA429 migrado para 5% de FBS. rastreamento de uma única célula viva de células transfectadas foi realizada, e distância total migrado calculado. Pelo menos 10 células foram rastreados por condição. valores de p referidas são calculadas em relação aos respectivos controles vazios do vetor. células B. OVCA429 foram transfectadas com lipídica apenas, ARNsi de controlo ou ARNsi dirigido contra mDia2 em concentrações crescentes (25, 50, 100 nM, denotados por cunhas) para ambos os 72 ou 96 h. depleção mDia2 foi confirmada por Western blot. células C. OVCA429 foram transfectadas com 100 nM de ARNsi durante 72 h, e os ensaios de migração Transwell realizada durante 5 h para uma SFM ou FBS a 10%. O ensaio foi realizado em poços em triplicado e a experiência foi repetida três vezes. Um experimento representativo é mostrado. Valor de p apresentados são de 10% FBS tratado de controle vs. células mDia2-empobrecido. Todas as barras de erro correspondem a SDS para essa experiência representativa.

O RhoA /mDia2 sinalização eixo na formação de esferóides OVCA compactos

proteínas MDIA Rho-responsivos podem regular contatos célula-célula e promover a motilidade única célula [18], [26] – [28], [49]. A seguir, determinar se o eixo de sinalização RhoA /mDia2 estava envolvido na formação esferóide OVCA. células ES-2 formado rapidamente esferóides altamente compactadas (Figura S1) e foram usadas para os estudos restantes. O requisito para a actividade de GTPase Rho na formação esferóide foi testada por exposição das células ES-2 a concentrações crescentes (0,5-2,0 ug /ml) de transferase C3, um inibidor de RhoA-C. Como mostrado na Figura S2A, esferóides C3-tratados foram mais fracamente organizadas e menos compactada em relação aos controlos tratados com veículo. Desde que o trabalho anterior mostrou que os níveis totais de RhoA são aumentados em esferóides derivados de hepatocarcinoma [50], o próximo perguntou se mudanças na atividade RhoA ocorrer em conjunto com formação de ES-2 esferóides. Os esferóides foram formados a partir de 500 células em 24 h (Figura 3A). RhoA e expressão dos seus efectores a jusante, e mDia1 mDia2 foi então avaliada em lisados ​​a partir de monocamadas de células e esferóides reunidas colhidas entre 24-120 h. Em geral, os níveis declinaram mDia2 em esferóides relativos a monocamadas. Dentro das populações esferóides, foram observadas diferenças dependentes do tempo na expressão mDia2, com níveis ligeiramente mais baixas observadas em 72 e 96 h esferóides, em relação a 24, 48 e 120 h esferóides (Figuras 3B e S3A). Em contraste com mDia2, os níveis de mDia1 foram aumentados em relação aos esferóides monocamadas. Nos esferóides mDia1 diminuiu ligeiramente a partir de 24 h através de 120 h (Figuras 3B e S3B). Os níveis totais de RhoA também diminuiu em esferóides, em relação ao monocamadas. No entanto, os níveis de RhoA dramaticamente recuperado em 120 h de formação de esferóides (Figura 3B e S3C). Uma vez que, a interacção de RhoA com os seus efectores a jusante, tais como (MDIA ou ROCK) é dependente da activação por ligação a GTP-, nós próxima quantificados os níveis de RhoA ligada a GTP activa em esferóides por G-LISA. A quantidade de RhoA-GTP foi aumentada significativamente nos esferóides formados para 48-120 h em comparação com ES-2 não estimuladas monocamadas de células, aproximando-se que o observado em monocamadas tratadas com um activador conhecido de RhoA, ácido lisofosfatídico (LPA) (Figura 3C). Portanto, os níveis globais de ativação RhoA são reforçadas após a maturação esferóide.

A. ES-2 esferóides fotografada por microscopia de campo claro. Barra de escala = 250 pm. (Nota: fora de foco placa de revestimento artefato de imagem e /ou condensação dentro de placas de plástico irregulares visto aqui é comum a imagem BF). B. Os lisados ​​de ES-2 monocamadas ou esferóides foram Ocidental-apagado depois dos tempos designados. C. RhoA L-Lisas foram efectuadas sobre não tratados ou tratados com LPA ES-2, monocamadas ou esferóides. os valores de p são em relação ao monocamada não tratada. O experimento foi realizado em poços em quadruplicado e a experiência foi repetida três vezes, em seguida. Os dados combinados a partir de 3 experiências são mostrados. os valores de p são mostrados acima são barras e em relação aos controlos não tratados de monocamada. D. esferóides formados por 72 h foram embebidos, fixos e visualizados por mDia2 microscopia confocal. As imagens foram obtidas usando uma objetiva 20 × com 3D-rendering de fatias de série. Barra = 25 uM. as setas abertas indicam áreas de sobreposição, enquanto as setas fechadas indicam uma justaposição de F-actina e mDia2. Todas as barras de erro correspondem a SDS para essa experiência representativa, a menos que indicado.

Como um primeiro passo para determinar se a ativação RhoA dependente de mDia2 pode afetar a formação de junções célula-célula, o próximo perguntou se mDia2 e F-actina são co-localizada em esferóides nas junções célula-célula (Figura 3D). Esferóides formadas por 72 h revelou junções célula-célula F-enriquecida com actina distintas, com pontuada mDia2 subjacente /proximal a estas junções (ponta de seta cheia). Em alguns cruzamentos, mDia2 apareceu para co-localizar com F-actina (ponta de seta não preenchido). Isto sugere um papel potencial para mDia2 na regulação dinâmica da F-actina necessárias para o desenvolvimento ou a manutenção de junções célula-célula.

depleção mDia2 leva à formação de esferóides menores, desorganizados

Para avaliar ainda mais o papel das proteínas MDIA na formação /integridade esferóide ovário, empregamos uma estratégia de interferência de RNA. Robust knockdown mediado por siRNA de qualquer mDia2 ou mDia1 foi validado através de 120 h em culturas em monocamada, com ligeira recuperação por 144 h (Figura 4A e S4). Os esferóides foram formadas a partir de células em monocamada de tratamento de 72 h pós-siRNA. diâmetros esferóides foram então medido 24-48 h depois (96-120 h tratamento siRNA total). depleção mDia2 às 48 h resultou num decréscimo modesto, mas estatisticamente significativa (10-20%) de diâmetro esferóide relativa para controlar o tratamento de siARN. Resultados semelhantes foram obtidos quando foi esgotada com mDia2 piscinas siRNA ou ARNsi dirigido contra indivíduo mDia2 (Figura S4), embora a supressão da expressão mDia2 com ARNsi reunida foi mais consistente e sustentado. Portanto, todos os estudos subsequentes foram realizadas utilizando a reunião de siRNA. Além da ligeira diminuição do diâmetro esferóide, mDia2-empobrecido ES-2 esferóides foram visivelmente menos organizada com bordas irregulares e algumas células individuais frouxamente ligados aos bordos. Um fenótipo esferóide desorganizado semelhante resultou a partir da adição de um inibidor mDia1 /mDia2 FH2, SMIFH2 (Figura S5) [51]. Lá resultados foram atribuídos ao esgotamento mDia2, como o esgotamento mDia1 não teve nenhum efeito no tamanho do esferóide (Figura 4B, C).

A. mDia1 (superior) ou mDia2 knockdowns (inferior) mediada por siRNA foram realizadas mediante ES-2 monocamadas (Nota: fora de foco de imagem placa de revestimento artefato /condensação dentro de placas de plástico irregulares visto aqui é comum a imagem BF). B-C. Após 72 h de tratamento de controle pós-siRNA ou, esferóides foram formadas e diâmetros medidos sob microscopia de campo claro após 48 h (120 h tratamento pós-siRNA). Barra = 100 um. Pelo menos 30 esferóides foram medidos para cada condição. os valores de p estão listados acima e barras são em relação ao controlar esferóides de ARNip. D-E. ES-2 monocamadas foram não tratadas ou tratadas com os siARN designados por 48 h, esferóides formados durante mais 48 h, e manchas de Western ou RhoA L-Lisas efectuadas sobre lisados. LPA é um controlo positivo para a activação de RhoA. A experiência do G-LISA foi realizada duas vezes, em quadruplicado, e de dados combinado é mostrado com os valores de p listados para o lado de barras. Os valores de P são em relação a qualquer esferóides tratadas com ARNsi de controlo não tratadas ou, tal como referido. F. não tratada (UT), lípidos única ou de controlo mediada por siRNA e mDia2 knockdowns foram efectuadas sobre ES-2 monocamadas durante 72 h e níveis pMLC2 avaliadas por transferência de Western. G. Controlo e mDia2 knockdowns foram realizadas durante 72 h, e esferóides formado. Os esferóides foram desagregadas nos tempos indicados depois da formação de células e contadas. A experiência foi repetida 5 vezes. Um experimento representativo é mostrado. As barras de erro correspondem a SDS de uma experiência representativa.

As possíveis explicações para o tamanho ligeiramente menor do ES-2 esferóides poderia incluir a proliferação celular diminuída, diminuição do tamanho da célula média, separação celular ou maior compactação esferóide via aumento RhoA-dirigida atividade pMLC2. Nós, portanto, determinado se os níveis de RhoA-GTP foram alteradas em esferóides mDia2-empobrecido. esgotamento mDia2 foi validado em esferóides formadas por 24-48 h (tratamento siRNA para 72-96 h) (Figura 4D). Em 96 horas de tratamento pós-siRNA, atividade RhoA-GTP não foi afetada no controle e esferóides mDia2-empobrecido (Figura 4E). Consistente com esta observação, pMLC2 manteve-se inalterada em monocamadas de células (Figura 4F). Além disso, o esgotamento mDia2 não alterar os números de celulares dentro de esferóides desagregados (Figura 4G). Isto indica que nem a proliferação celular, nem perda de células aderidas-de foi o único responsável pelo tamanho esferóide menor. Também sugere que enquanto a depleção mediada por siARN da mDia2 provoca uma montagem esferóide mais desorganizado e irregular, a proteína restante mDia2 é provavelmente suficiente para sustentar ambas contractilidade RhoA-mediada e a proliferação celular. Este último conceito é consistente com um estudo anterior de mDia1 na activação das células T, onde baixos níveis de proteínas MDIA pareceu ser suficiente para sustentar a alguns processos celulares (

por exemplo

., A acumulação de actina F vs. dinâmica dos microtúbulos) e, simultaneamente, prejudicando outras funções [52].

esgotamento mDia2 aumenta ES-2 invasão esferóide através de um

transição amebóides

Para avaliar se as funções de eixo RhoA /mDia2 em invasão esferóide, ES-2 esferóides foram incorporados em colagénio a (T0) e deixou-se invadir através de 168 h (Figura 5A). Uma frente avançando rapidamente de células invasivas apareceu por 24 h, e a contracção de gel era grande o suficiente para rasgar os géis dentro de 72 h. invasão esferóide foi medida através da elaboração de uma região de interesse em torno do perímetro da parte da frente invasiva, que compreendia pelo menos 95% de células invasoras (conforme determinado por marcação por fluorescência). Invasão dependia GTPases Rho, como a frente invasiva foi marcadamente reduzida em ES-2 esferóides que foram cultivados e incorporados na presença de C3-transferase, em relação ao veículo esferóides de tratamento de controlo (Figura S2, B e C). Uma vez que as proteínas Rho-MDIA dirigidos conduzir invasão em uma variedade de células cancerosas epiteliais derivadas de [26], [29], [30], foi visualizada a localização espacial de proteínas em MDIA invasivos ES-2 esferóides fixos. mDia2 foi distribuído num padrão polarizada, com enriquecimento nas bordas esferóides onde as células invasoras emanado para o colagénio (Figura 5B). Na maior ampliação da frente invasiva, mDia2 foi dramaticamente localizada a estruturas alongadas que se assemelham endossomas em tubo [53], que se estendeu durante os longos saliências das células mesenquimais. Curiosamente, foi principalmente mDia1 nuclear em células invasoras, consistente com relatos prévios para mDia1 activado nuclear que dirigem SRF-mediadas dinâmica F-actina dentro do núcleo [54]. Observou-se várias morfologias celulares em células invasivas em colagénio, incluindo células ameboides esféricas (~ 40% invadir as células) e células alongadas, polarizadas mesenquimais (~ 60% de células invasoras), que migram em filamentos (dados não mostrados). Curiosamente, esferóides invasivos reprodutivelmente (utilizando vários anticorpos primários de acolhimento diferentes derivações e comerciais) mostrou distinta, punctata coloração mDia2 dentro da matriz (Figura 5C e dados não mostrados). Anteriormente, as proteínas foram detectadas em MDIA pró-migratórias micropartículas derivadas OVCA-[55] e mDia2 dirigido a formação de pró-oncosome migratório em células de cancro da próstata [29]. Os estudos bioquímicos estão em andamento para caracterizar as partículas extracelulares mDia2 enriquecidos presentes no invadindo esferóides OVCA.

A. Esferóides foram formados em primeiro lugar para 48-I géis, e fotografada por microscopia de campo claro, depois dos tempos designados. Barra = 150 um. B. Os esferóides foram formados por 72 h, incorporado em géis de colagénio I e deixou-se invadir durante 24 h. Esferóides foram fixados e, se realizada por mDia1, mDia2 e F-actina. Barra = 100 um. C. imagem maior ampliação (63 x) de células a partir do ROI designado invadindo em B. mDia1, mDia2, e F-actina foram visualizados por meio de microscopia confocal. Barra = 25 uM. D. Após 56 h de tratamento pós-siRNA, esferóides foram formados e incluídos em colágeno a 104 h tratamento pós-siRNA. A área para o ROI desenhada correspondente a 95% de células invasoras foi calculada para 0 e 18 h após invasão (122 h de pós-tratamento de siRNA). esferóides representativos a 4X são mostrados coradas para phalloidin e imagens contraste. Barra = 100 um. Pelo menos 30 esferóides foram medidos para cada condição. os valores de p são mostrados acima do histograma e são em relação à invasão em 18 h para ambos os lípidos ou de controlo tratados esferóides. índices E. alongamento foram calculadas para as células invasoras de D. Pelo menos 30 células invasoras foram medidos por condição. coloração phalloidin representativo é mostrado. Barra = 25 uM. EI 2 (linha a tracejado) é considerado tipo de células mesenquimais. os valores de p são mostrados acima da trama e são em relação à invasão em 18 h para ambos os lípidos ou de controlo tratados esferóides. Todas as barras de erro correspondem a SDS de uma experiência representativa.

Para avaliar o papel do MDIA na invasão de célula única, medimos a área invasiva do mDia1 incorporado ou esferóides ES2 mDia2-empobrecido depois 0 h (104 h pós-knockdown) e 18 h (122 h pós-knockdown). esferóides tratados com siRNA não tratados e de controlo robustamente invadiu a matriz de colágeno dentro de 20 h. esferóides No entanto, mDia2-empobrecido revelado invasão significativamente melhorada em relação aos controlos (Figura 5D e Figura S4C), apesar do seu tamanho mais pequeno modestamente após incorporação (Figura 4C). Por outro lado, esferóides invadidas na mesma medida como esferóides de controlo (Figura S6) mDia1-empobrecido, indicando que mDia1 não desempenha um papel significativo na invasão OVCA esferóide. Como as alterações na expressão e /ou função mDia2 associados com transições ameboides [27] – [29], foram calculados os índices de alongamento (EI) nas células invasoras derivados dos esferóides dividindo o eixo longo da célula pelo eixo curto; Um EI de duas ou mais indica uma forma alongada mesenquimal, ao passo que uma EI inferior a 2 indica um fenótipo arredondado mais proeminente, amebóide. Os resultados indicam que nos esferóides onde o esgotamento mDia2 invasão melhoradas, as células invasivas eram predominantemente amebóide na forma em relação ao não tratada e controlar esferóides tratadas com siRNA (Figura 5E).

ROCHA suporta ambos os programas de motilidade mesenquimais e 3D amebóide no ES-2 invasivos esferóides

Amoeboid transições pode envolver a sinalização ROCHA Rho-direcionado para a contratilidade directo [56], [57]. ROCHA também antagoniza proteínas MDIA no que diz respeito à manutenção junções célula-célula em monocamadas 2D [18]. No entanto, a interação entre o rock e as proteínas MDIA para manter junções célula-célula em estruturas 3D, como esferóides OVCA não é clara. Por isso, avaliou o papel da atividade ROCHA na formação esferóide. Nós bloqueado atividade ROCHA tratando esferóides com o inibidor específico, Y27632. tamanho esferóide foi ligeiramente reduzida por meio de tratamento de 48 h (Figura 6A), o que sugere que ROCHA reticulação /mediada por miosina de MDIA-regulada F-actina pode desempenhar um papel na formação de esferóides. A inibição da ROCHA suprimida drasticamente esferóide invasão em relação aos controles (Figura 6B), consistente com estudos anteriores que implicavam Rock in formação de bolhas de colorectal [58] e monocamada de células de cancro do ovário Caov3 [59]. Uma transição mesenquimal notavelmente exagerada predominaram nas poucas células que povoam a frente invasiva modesto em células tratadas com o inibidor ROCHA (Figura 6C), indicando um requisito para Rock a contratilidade celular efetivamente direta em ambos os programas de invasão amebóides e mesenquimais.

A. Os esferóides foram formados na presença de veículo ou a 90 uM Y27632 durante os tempos indicados. diâmetros esferóides foram então medidos para pelo menos 30 esferóides em 10 ×. Barra = 100 um. valores de p são mostrados acima da trama e são o controle H

esferóides 20 tratados. B. Os esferóides foram formadas durante 48 h na presença de Y27632, e, em seguida, incorporado em colagénio-I durante 0-48 h, na presença de veículo ou Y27632. frentes invasivos foram medidos em cada ponto de tempo de pelo menos 30 por condição esferóides. Barra = 400 um. esferóides representativas a 4 × são mostrados coradas para phalloidin e imagens contraste. Os valores de P listados acima do gráfico e são em relação ao controlar H

esferóides 20-tratados. C. índices de alongamento foram calculados para as células invasivas em géis de colagénio mostrados em B. IE 2 (linha a tracejado) foram consideradas tipo de células mesenquimais. Pelo menos 30 células foram medidos por condição.