Abstract
Fundo
adenocarcinoma do pâncreas é uma letal doença com a sobrevivência de menos de 5% de 5 anos. 5-fluorouracilo (5-FU) é uma terapia de primeira linha principal, mas o tratamento apenas modestamente prolonga a sobrevivência e é raramente curativas. A resistência às drogas e doenças recorrência é típico e existe uma necessidade premente de superar isso. Para investigar a resistência adquirida 5-FU no adenocarcinoma do pâncreas, estabelecemos linhas celulares monoclonais quimiorresistentes da linha celular Panc 03,27 por exposição a longo prazo a doses crescentes de 5-FU.
Resultados
5 -FU linhas celulares resistentes apresentaram um aumento da expressão dos marcadores associados com a resistência a múltiplas drogas explicando a sua sensibilidade reduzida a 5-FU. Além disso, as linhas celulares resistentes a 5-FU mostrou alterações típicas para uma transição epitelial-a-mesenquimal (EMT), incluindo a regulação positiva de marcadores mesenquimais e aumento da capacidade de invasão. Microarray Analysis revelou a via L1CAM como uma das vias mais regulados positivamente nos clones quimiorresistentes, e uma regulação positiva significativa de L1CAM foi visto no nivel do ARN e de proteína. No cancro do pâncreas, a expressão de L1CAM está associada com um fenótipo resistente à quimioterapia e migratório. Usando esiRNA segmentação L1CAM, ou através do bloqueio da parte extracelular de L1CAM com anticorpos, que mostram que o aumento da capacidade de invasão observado nas células quimiorresistentes funcionalmente depende L1CAM. Usando esiRNA segmentação β-catenina e /ou Slug, demonstra-se que nas linhas celulares quimiorresistentes, L1CAM expressão depende do Slug, em vez de p-catenina.
Conclusão
Nossas descobertas estabelecer Slug-induzida expressão L1CAM como mediador de um resistente à quimioterapia e fenótipo migratório em células de adenocarcinoma do pâncreas
Citation:. Lund K, Dembinski JL, Solberg N, Urbanucci a, Mills IG, Krauss S regulação positiva (2015) Slug-Dependente de L1CAM é responsável pela capacidade de invasão Aumento de células do cancro do pâncreas seguinte Long-Term 5-FU tratamento. PLoS ONE 10 (4): e0123684. doi: 10.1371 /journal.pone.0123684
Editor do Academic: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, United States |
Recebido: 02 de outubro de 2014; Aceito: 02 de fevereiro de 2015; Publicação: 10 de abril de 2015
Direitos de autor: © 2015 Lund et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
A disponibilidade de dados: dados de microarranjos lata ser encontrados em GEOarchive, número de acesso GSE58386. Todos os outros dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. KL é fundada pelo Conselho de Investigação da Noruega, conceder nr. 205.783, e Affitech Research AS. Affitech Research AS parcialmente apoiado KL durante uma PhD industrial, juntamente com o Conselho de Investigação da Noruega, conceder nr. 205783. AU foi financiado pela Molecular Ciências da Vida (Universidade de Oslo) e Helse Sor-Ost. NS foi financiado pela Sociedade do Câncer da Noruega. JLD foi financiado pelo Conselho de Investigação da Noruega. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Affitech Research AS parcialmente apoiado KL durante uma PhD industrial, em conjunto com o Conselho de Pesquisa da Noruega, conceder nr. 205783. No entanto, Affitech Research AS não tem interesses financeiros neste trabalho. Os autores declaram que isso não altera a sua adesão à política de PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
adenocarcinoma do pâncreas é uma doença extremamente mortal. O curso inicial da doença é muitas vezes assintomática levando a apenas 8% dos casos diagnosticados nesta fase. As perspectivas para os pacientes de adenocarcinoma em estágio final é sombrio, com apenas 20% dos pacientes sendo candidatos para a cirurgia (devido ao diagnóstico de metástase tarde /tumor), resultando em uma sobrevida de menos de 5% [1] 5 anos. opções de tratamento atual disponíveis podem prolongar a sobrevivência e aliviar os sintomas em pacientes, mas não são curativo na maioria dos casos.
5-fluorouracil (5-FU) tem por muito tempo sido uma forma estabelecida de quimioterapia para o adenocarcinoma do pâncreas, em conjunto com a gemcitabina droga [2]. No entanto, a resistência inerente (de novo) e adquirida são os principais obstáculos para o sucesso do 5-FU quimioterapia baseada em adenocarcinoma do pâncreas e outros tumores [3]. Adquirido resistência aos fármacos, que se desenvolve durante o tratamento, é muitas vezes manifestada por vários mecanismo resistente e é, por conseguinte, terapeuticamente difícil de inverter.
5-FU diminui a biossíntese de nucleótidos de pirimidina através da inibição da timidilato-sintase (TS), uma enzima que catalisa o passo limitante da velocidade na síntese do ADN [4]. Embora os mecanismos de resistência ao 5-FU permanece pouco claro, vários relatórios têm ligado quimiorresistência em várias linhas celulares de tumores sólidos para epitelial-mesenquimal de transição (EMT) [5-8]. EMT é um processo embriológico fundamentais caracterizada por alterações na morfologia, a arquitectura celular, e a adesão de sinalização que conduzem a um fenótipo migratório [9]. Quando EMT ocorre em células tumorais, estas células perdem as suas características epiteliais e adquirem um fenótipo mais invasiva e migratório conduzindo a potencial metastático aumentada. Os marcadores moleculares para EMT incluem o aumento da expressão de vimentina e N-caderina e aumento da expressão de factores de transcrição que reprimem a expressão de E-caderina, incluindo torção, caracol, e Slug [10].
A molécula de adesão celular L1 (L1CAM ) é uma glicoproteína transmembranar altamente conservado da superfamília das imunoglobulinas, que foi identificado pela primeira vez para desempenhar um papel no desenvolvimento e regeneração de tecido neuronal [11]. expressão L1CAM tem sido observado em uma série de linhas celulares de cancro e tecidos, e expressão alta L1CAM é frequentemente associada com mau prognóstico e tempo de sobrevida curta [12]. L1CAM tem sido associada a EMT em vários tipos de cancro diferentes, incluindo cancro do pâncreas [13-18]. Em particular, L1CAM tem sido associada com um fenótipo resistente à quimioterapia e migratório no adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) [19-21]. Para investigar os mecanismos envolvidos na aquisição de resistência ao 5-FU, estabelecemos os clones resistentes a 5-FU a partir da linha celular de adenocarcinoma do pâncreas Panc 03,27, e submeteu-as linhas de células para ensaios de funcionalidade e análise de microarray. As células quimiorresistentes Panc 03.27 sofreu alterações fenotípicas consistentes com um EMT, e a expressão de marcadores relacionados com o EMT, particularmente L1CAM, aumentou substancialmente. estudos de knockdown mostrou que a expressão L1CAM nos clones resistentes a 5-FU foi dependente do factor de transcrição Slug, mas não em β-catenina, e knockdown de L1CAM confirmaram uma ligação funcional entre L1CAM e o potencial proliferativo e invasivo do resistente à quimioterapia, Panc 03,27 clones. knockdown estudos mostraram ainda que moderadamente L1CAM protegido células B1V quimiorresistentes a partir apoptose induzida por 5-FU. Nossos resultados fornecem uma visão mais aprofundada dos mecanismos moleculares que levam a um resistente à quimioterapia e fenótipo migratório em células de câncer de pâncreas e destacar a importância de abordar expressão L1CAM induzida Slug no PDAC recorrente.
Resultados
Desenvolvimento de os clones resistentes a 5-FU
Panc 03.27 linhas celulares resistentes a 5-FU foram gerados por exposição contínua das células tumorais em 5-FU durante um período de 6 meses, a partir de 0,5 ug /mL de 5-FU e aumentada para 1 mg /ml ao longo do tempo. Para verificar a quimiorresistência dependente da dose dos clones obtidos, uma curva de dose foi executado a uma gama de concentrações de 5-FU (0,5-10 ug /ml) durante um período de 6 dias. Como esperado, os clones que foram cultivados sem 5-FU selecção (nomeado Nt e noroeste) foram sensíveis a todas as concentrações de 5-FU. Nos clones quimiorresistentes B1Q e B1V crescimento normal foi observada com as doses de até 1 ug /ml de 5-FU, ao passo que as concentrações mais elevadas de 5-FU (5-10 ug /mL) inibiu o crescimento ainda
(Fig 1A)
.
(A) O quimiossensíveis (Nt, noroeste) e resistente (B1Q e B1V) linhas de células foram tratadas com 0-10 mg /ml 5-FU) mais de 6 dias. crescimento gráfico mostra vs. dias de exposição. (B) Western blot que mostra os níveis de timidilato-sintase (TS) na quimiossensíveis e as linhas celulares quimiorresistentes. (C) os níveis de RNA (quantidade relativa) de ABCB1 (MDR1) e ABCC5 como medido por RT-PCR. (D) mancha de Western que mostra os níveis de survivina na quimiossensíveis e as linhas celulares quimiorresistentes. As barras de erro representam o desvio padrão. diferença estatisticamente significativa entre a quimiossensíveis e os clones quimiorresistentes (P 0,05) é indicado por *
clones resistentes a 5-FU exibir mecanismos de resistência
sensibilidade 5-FU tem. Demonstrou-se inversamente relacionado com o nível de proteína de timidina-sintetase (TS) em células tumorais, e tumores resistentes a 5-FU vulgarmente expressam níveis elevados de proteína TS [22,23]. Alta expressão de TS em tecido de cancro é um indicador de mau prognóstico para a quimioterapia à base de 5-FU em pacientes com câncer colorretal [24]. O nível de proteína de TS foi analisada em todas as quatro clones. TS foi aumentado drasticamente nos clones B1Q e B1V resistente à quimioterapia, conforme mostrado por análise de Western blot
(Figura 1B)
. Utilizando RT-PCR TaqMan, que próxima analisados os níveis de ARN de bombas de efluxo associadas com o 5-Fu e resistência a múltiplas drogas [25,26]. Observou-se um aumento estatisticamente relevante na expressão do efluxo bombas ABCB1 (MDR1) e ABCC5 (MRP5) nos clones quimiorresistentes, em comparação com os clones quimiossensíveis
(Figura 1C).
O nível de survivina foi também grandemente aumento nos clones quimiorresistentes como avaliado por Western blotting
(Figura 1D).
survivina é um inibidor de apoptose expressa na fase G2 /M do ciclo celular e a sobre-expressão de survivina está ligada a resistência a estímulos apoptóticos induzidos por fármacos quimioterapêuticos [27,28].
clones resistentes a 5-FU exibir alterações morfológicas que são associados com EMT
Quando a morfologia dos clones resistentes a 5-FU foi comparado com o clones sensíveis, o ex exibido um fenótipo mais mesenquimais-like, com espalhamento celular e aumento da formação de pseudópodos, enquanto os clones sensíveis exibir uma morfologia epitelial bem embalado
(Fig 2A)
. As células resistentes a 5-FU apareceu maior e mais estendido do que as células sensíveis. O fenótipo mesenquimal semelhante, a qual foi mantida durante mais de 30 passagens, está de acordo com observações anteriores de quimioresistência induzida por drogas em linhas celulares [29,30].
(A) Fotografias de contraste de fase que mostram a morfologia das células de normal (Nw, nt) e clones quimiorresistentes (B1Q, B1V), 40x. (B-D), os níveis de RNA (quantidade relativa) de vimentina, E-caderina e N-caderina, tal como medido por RT-PCR. As barras de erro representam o desvio padrão. diferença estatisticamente significativa entre a quimiossensíveis e os clones quimiorresistentes (P 0,05) é indicada por *. (E-G) e Western blot que mostra a imunocoloração os níveis de vimentina, E-caderina e N-caderina, no quimiossensíveis (Nt, NM) e as linhas de células resistente à quimioterapia (B1Q, B1V). (H) e imunocoloração (I), transferência de Western que mostra os níveis de CD19 na quimiossensíveis e as linhas celulares quimiorresistentes. (J) grico que mostra os resultados de ensaios de invasão de 24 horas realizados sobre os clones, com imagens de contraste de fase (20x) mostrando áreas representativas de células marcadas com corante de violeta de cristal (K) invasor. O ensaio foi realizado três vezes. diferença estatisticamente significativa entre a quimiossensíveis e os clones quimiorresistentes (P 0,05) é indicado por *
marcas importantes de EMT são uma regulação negativa do marcador epitelial E-caderina acompanhada por uma regulação positiva de N. -cadherin e vimentina [9]. Consequentemente, os clones quimiorresistentes mostrou um aumento na vimentina
(Figura 2B e 2E)
e N-caderina
(Figura 2D e 2G)
em ambos os níveis de RNA e proteína, e de uma regulação negativa da E -cadherin
(Figura 2C e 2F).
citoqueratina 19 (CK19) é um filamento intermediário, que é em parte responsável pela integridade estrutural das células. Várias modificações do citoesqueleto de uma célula, está associado com a transformação maligna, e uma perda de CK19 foi associada com EMT [31] e resistência a múltiplas drogas [32]. Quando O NT, NW, B1Q e B1V clones foram analisados para a expressão de CK19 por imunocitoquímica e Western blot, uma redução drástica de CK19 foi encontrada nos clones quimiorresistentes, em comparação com os clones sensíveis ao 5-FU
(Fig 2H e 2I).
Para avaliar se a morfologia alterada que foi observada nos clones quimiorresistentes era funcionalmente significativo, nós examinamos as propriedades invasoras dos clones utilizando um ensaio de invasão de matrigel
(Figura 2J e 2K).
quimiorresistentes clones B1Q e B1V eram 4 a 6 vezes mais invasivo do que os dois clones quimiossensíveis NT e Nw.
L1CAM é regulada nas células resistentes a 5-FU
a fim de estabelecer uma forma mais exaustiva perfil molecular entre as linhas de células sensíveis e não sensíveis, foi realizada a análise de microarray, incluindo a linha celular resistente B1V 5-FU e o clone quimiossensíveis Nt. 607 genes foram consideradas, por apresentarem alterações log2 1
(S1 Fig)
. 319 genes foram encontrados para ser supra-regulada e 288 genes foram regulados negativamente pelo menos 2 vezes em comparação com B1V Nt (P 0,05)
(Tabelas S1 e S2, respectivamente)
. Análise do gene A ontologia dos 319 genes regulados positivamente revelou que a via da interacção L1CAM foi uma das vias mais regulada positivamente nos clones chemosresistant, em conjunto com citocinas e respostas inflamatórias
(Figura 3A)
. si L1CAM foi regulada positivamente 4 vezes nas células B1V em comparação com as células NT. Marcas de sinalização Wnt e pluripotência, apoptose, atividade transportador de serotonina, o transporte de monoamina e metabolismo de glicogênio também foram encontrados para ser regulada na linha de células B1V resistente à quimioterapia
(Fig 3A e S1 Tabela).
análise (a) Gene ontologia de 319 genes regulados positivamente no clone B1V em comparação com o clone nt da linha celular Panc 03,27. os níveis de (B) de ARN (quantidade relativa) de L1CAM na quimiossensíveis (Nt, NM) e a resistente à quimioterapia (B1Q, B1V) linhas de células, tal como medido por RT-PCR. As barras de erro representam o desvio padrão. diferença estatisticamente significativa entre a quimiossensíveis e os clones quimiorresistentes (P 0,05) é indicada por *. (C) Western blot que mostra os níveis de L1CAM em todas as linhas celulares. (D) A análise de citometria de fluxo utilizando anticorpo anti-PE L1CAM em todas as linhas celulares. As células não coradas são mostrados em células cinzentas e coradas com anticorpo são mostrados em preto. (E) imunocoloração de L1CAM. O aumento da localização da membrana de L1CAM pode ser visto na das linhas quimiorresistentes (B1Q, B1V). As imagens são tiradas com ampliação de 40x
O aumento em L1CAM nos clones quimiorresistentes foi confirmada por PCR em tempo real (P 0,05). E análise de Western blot (
fig 3B e 3C, respectivamente )
. Além disso, a análise de citometria de fluxo utilizando um anticorpo anti-L1CAM conjugado com PE apresentou enriquecimento de células positivas L1CAM na célula B1Q e B1V linhas
(Fig 3D). Em apoio a esta observação, imuno-histoquímica revelou uma expressão L1CAM distinta na membrana da clones B1Q e B1V resistente à quimioterapia, mas não nas células quimiossensíveis Nt e Nw
(Fig 3E).
A proporção das células quimiorresistentes também exibiram imunorreactividade nuclear L1CAM.
L1CAM está envolvida na proliferação e invasão dos clones resistentes a 5-FU, e moderadamente protege as células de apoptose quimiorresistentes induzida por 5-FU
EMT tem sido associado com um aumento da capacidade de invasão de células tumorais [33], e os relatórios anteriormente publicados mostraram que L1CAM provoca a migração celular e invasão em vários tipos de tumores [15,18,34]. Para investigar se a regulação positiva de L1CAM está envolvido no aumento da capacidade de invasão das células quimiorresistentes, a expressão de L1CAM foi derrubado usando esiRNA. esiRNA endorribonuclease são preparados piscinas siRNA constituído por uma mistura heterogénea de siRNAs que todos alvo a mesma sequência de ARNm. tratamento esiRNA reduziu drasticamente o nível de proteína de L1CAM na célula resistente à quimioterapia linhas B1Q e B1V
(Fig 4A)
, em comparação com células transfectadas com controle esiRNA (visando EGFP). Quando ensaiado quanto capacidade de invasão em matrigel uma câmara de invasão o número de células invasivas após L1CAM knockdown foi significativamente menor em comparação com o controlo negativo após 24 h invasão
(Figura 4B).
Para avaliar ainda mais a relação entre a capacidade de invasão do clones de expressão quimiorresistentes e L1CAM, as células foram tratadas com um anticorpo alvo a parte extracelular de L1CAM (clone UJ127.11), ou um anticorpo de controlo de isotipo de rato, antes de um ensaio de invasão experiência (ensaio de invasão vezes foram aumentados para 48 horas). Os nossos resultados mostram que o tratamento de células B1Q e B1V com o anticorpo L1CAM reduziu significativamente a sua capacidade de invasão comparado com o tratamento com o anticorpo de controlo. Em contraste, o tratamento de células NT e Nw quimiossensíveis com anticorpo L1CAM teve nenhum efeito sobre a capacidade de invasão
(Figura 4C).
(a) O controlo de Western blot que mostra os níveis de L1CAM após transfecção com esiRNA segmentação L1CAM ou controlar esiRNA, tal como descrito em
Materiais e métodos
. A actina é utilizado como controlo de carga. (B) Gráfico exibindo número de células invasoras (24 ensaios h invasão) após transfecção com esiRNA segmentação L1CAM ou controlar esiRNA. As experiências foram efectuadas duas vezes com resultados semelhantes. Os resultados representativos são mostrados. (C) Representação gráfica que indica os números de células invasoras (48 h) ensaios de invasão de células tratadas com 2 ug /mL de anti-L1CAM anticorpo (clone UJ127.11) ou anticorpo controlo isotipo durante 1 h à temperatura ambiente antes de serem adicionados à invasão placa de ensaio. (D) as curvas de crescimento Incucyte (96 horas) de todas as linhas celulares após a transfecção com esiRNA segmentação L1CAM ou controlar esiRNA. A experiência foi realizada em triplicado. (E) A linha de células quimiossensíveis Nt e a linha de células resistente à quimioterapia B1V (F) foram tratados com 1 ug /mL de 5-FU durante 72 h após a transfecção com esiRNA segmentação L1CAM ou de controlo, e ensaios de citometria de fluxo de anexina V foram realizados. Cada ensaio foi repetida duas vezes com resultados semelhantes. Percentagem nos gráficos mostra células anexina V-positiva.
A sobre-expressão de L1CAM foi mostrado para promover a proliferação de células tumorais e, consequentemente, a inibição da expressão ou função L1CAM pode suprimir a proliferação de [35-37]. Para investigar se a knockdown de L1CAM teve uma influência sobre o crescimento celular nas células quimiorresistentes, foi realizada
in vitro
ensaios de proliferação. Todas as linhas celulares foram submetidos a L1CAM e controlar o tratamento esiRNA, ea confluência percentual foi medido ao longo do tempo por um IncuCyte automatizado leitor
(Fig 4D)
. Medições começou 24 horas após a transfecção esiRNA. Temos anteriormente observado que o efeito do knockdown esiRNA no nível da proteína diminui gradualmente após 72 horas (resultados não mostrados), mas para se obter uma curva de crescimento adequado as experiências foram realizadas durante pelo menos 96 horas após a transfecção. As curvas de crescimento não mostrou nenhum efeito do tratamento esiRNA segmentação L1CAM nas linhas celulares quimiossensíveis NT e Nw. No entanto, as linhas celulares quimiorresistentes B1Q e B1V exibida reduziu significativamente o crescimento seguinte L1CAM knockdown
(Figura 4D)
demonstrando que a expressão L1CAM está envolvida na proliferação celular das células quimiorresistentes.
Quando o anti- L1CAM anticorpo que inibiu a invasão nas células quimiorresistentes foi adicionado ao
in vitro
ensaios de proliferação, não podia ver nenhuma diferença na confluência celular percentual entre as células tratadas com o anticorpo em comparação com células tratadas com o anticorpo controle. Isto foi realizado em todas as quatro linhas celulares.
L1CAM tem mostrado desempenhar um papel na mediação de quimioresistência contra gemcitabina e etoposido em linhas celulares PDAC [38]. Para avaliar se a L1CAM estava envolvido na mediação da resistência ao 5-FU nas linhas celulares Panc 03.27 quimiorresistentes, ensaios de citometria de fluxo de anexina V foram realizados na Nt e células B1V 72 horas depois as células foram tratadas com L1CAM ou controlar esiRNA na presença e na ausência de 1 ug /mL de 5-FU. Como esperado, as células Nt tratados com um controlo esiRNA mostraram uma mudança significativa no sentido de células positivas para anexina V depois de ter sido exposto a 5-FU (de 0,87% para 18,32%). Em contraste, controle trataram células B1V só não revelam um ligeiro aumento (de 1,19% para 2,22%) em células positivas anexina V em resposta ao tratamento com 5-FU
(Fig 4E e 4F)
. Knockdown de L1CAM não alterou significativamente as taxas de apoptose na linha celular quimiossensíveis Nt, quer na presença ou na ausência de tratamento com 5-FU quando comparado com o knockdown Ctrl
(Figura 4E)
. No entanto, o aumento do knockdown de L1CAM células positivas para anexina V percentagem, tanto com ou sem tratamento com 5-FU. Assim, L1CAM parece proteger moderadamente células B1V quimiorresistentes de apoptose na ausência de 5-FU, e mais ainda na presença de 5-FU
(Figura 4F).
transcricional de regulação L1CAM depende Slug, mas não em β-catenina
estudos anteriores têm implicado tanto Slug e β-catenina na regulação da transcrição de L1CAM [14,39-41]. Slug é um fator de transcrição que está envolvido na EMT e invasão no câncer de pâncreas [34,42]. L1CAM é considerado para ser um alvo de β-catenina, o mediador chave da via de sinalização Wnt canónica com um papel na regulação da proliferação contextual, entre os pontos de decisão ‘stemness’ e diferenciação, o metabolismo celular e EMT [39,43]. Uma vez que a análise de microarray revelou uma regulação positiva de componentes que podem contribuir para a sinalização de Wnt canónica nas células quimiorresistentes
(Figura 3A)
, os níveis de β-catenina nas linhas celulares quimiossensíveis quimiorresistentes e foram investigados. Os níveis de ARN de β-catenina foram significativamente aumentada (P 0,05) nos clones quimiorresistentes
(Figura 5A)
, mas no micro-arranjo, o aumento foi menor do que duas vezes e, portanto, não aparecem na lista de genes que eram mais de duas vezes supra-regulada na micromatriz
(Tabela S1)
. Western blots mostram nenhuma diferença nos níveis de proteína total β-catenina entre o quimiossensíveis e as células quimiorresistentes, nem no citoplasma ou no núcleo.
(Fig 5A)
. níveis β-catenina activo, tal como medido por um anticorpo de detecção única proteína activa (fosforilada), não foram alteradas ou (resultados não mostrados).
(A), os níveis de RNA (quantidade relativa, RT-PCR) e Western blot mostrando os níveis de proteína de β-catenina na quimiossensíveis (Nt, noroeste) e resistente à quimioterapia linhas (, B1V B1Q) celulares. níveis (B) de ARN (quantidade relativa, RT-PCR) e (B1Q, B1V) celulares western blot mostrando os níveis de proteína de Slug na quimiossensíveis (Nt, noroeste) e resistente à quimioterapia linhas. Os níveis de proteína de Slug no western blot foram quantificados usando o Image Estúdio Lite (versão 3.1.4) (normalizados contra os controles de carga). (C) Os níveis de L1CAM seguintes transfecção com esiRNA alvo β-catenina ou controlar esiRNA. (D) Os níveis de L1CAM seguintes transfecção com esiRNA segmentação Slug ou controlar esiRNA. A quantificação de intensidades de banda pode ser visto nos painéis inferiores em (C) e (D). (E) grico que mostra o número de células invasoras (24 h ensaios de invasão) a seguir a transfecção com esiRNA segmentação Slug ou controlar esiRNA, em combinação com 2 ug /ml de anticorpo anti-L1CAM (UJ127.11) ou anticorpo controlo isotipo durante 1 h a sala temperatura. As experiências foram efectuadas duas vezes com resultados semelhantes. Os resultados representativos são mostrados. A actina é utilizado como controlo de carga em todos os Western blots. As barras de erro nos gráficos de RT-PCR representam o desvio padrão. diferenças estatisticamente significativas (P 0,05) entre o quimiossensíveis e os clones quimiorresistentes são indicados por *
Slug não mostraram alterações no microarray, que também foi confirmada por RT-PCR
. (Fig 5B)
. No entanto, uma análise Western blot mostrou uma clara regulação positiva dos níveis de proteína Slug em ambas as linhas celulares quimiorresistentes em comparação com a célula quimiossensíveis linhas
(Fig 5B).
Para testar o impacto da β-catenina e Slug sobre a expressão de L1CAM, tanto β-catenina e Slug foram alvo de esiRNA. Knockdown da pastilha, mas não β-catenina, levar a uma diminuição dos níveis de proteína L1CAM
(Fig 5C e 5D).
Quando Slug e β-catenina foram derrubados simultaneamente nas células quimiorresistentes, mais nenhuma redução observou-se os níveis de L1CAM (resultados não mostrados)
Quando ensaiados quanto capacidade de invasão de células depois de knockdown, B1Q e B1V Slug indicadas invasividade reduzida em comparação com as células de controlo esiRNA (24 h invasão;
Figura 5E). ,
de um modo semelhante ao que foi observado com o knockdown de L1CAM
(Figura 4B). o pré-tratamento com o anticorpo
L1CAM além de Slug knockdown não reduzir ainda mais a capacidade invasiva das linhas quimiorresistentes
(Figura 5E).
Embora a aquisição de 5-FU-resistência induzida uma multiplicidade de mudanças nas células Panc 03.27 adenocarcinoma do pâncreas, identificamos L1CAM e a sua regulação através de Slug como um mediador importante de um fenótipo invasivo e quimiorresistência adquirida, e como um potencial alvo terapêutico.
Discussão
5-FU foi a terapia sistêmica de escolha para o câncer de pâncreas avançado por muitos anos, mas no final dos anos 90, foi demonstrado que a droga era gemcitabina superior a 5-FU no controle de sintomas relacionados com a doença [44]. No entanto, 5-FU ainda é uma opção de tratamento recomendado para o câncer de pâncreas hoje [45], e vários estudos recentes têm demonstrado um papel valioso para 5-FU em protocolos de tratamento combinados em comparação com a quimioterapia gemcitabina único [46,47].
a resistência aos medicamentos quimioterápicos é uma das principais causas de falha do tratamento e de prognóstico reservado em câncer pancreático. Neste estudo nós mostramos que a linha de células de câncer pancreático Panc 03,27 submetido a exposição a longo prazo a 5-FU desenvolveram resistência e adquiriu características moleculares protótipos incluindo regulação positiva de timidilato sintase, survivina e bombas de drogas. Além disso, foi demonstrado que as células quimiorresistentes tornou-se mais mudanças mesenquimais semelhantes e foi submetido relacionados com EMT, incluindo a perda de marcadores epiteliais (E-caderina e CK19) e expressão aumentada da vimentina marcadores mesenquimais e N-caderina, e o Slug factor de transcrição . Nós mostramos uma regulação positiva de L1CAM nas células resistentes a 5-FU, que está de acordo com achados anteriores que suportam a hipótese de que L1CAM é regulada por células cancerosas como parte do processo de EMT [13-18]. Fomos ainda capazes de ligar L1CAM para o processo de EMT, demonstrando que o aumento da capacidade de invasão das células quimiorresistentes era dependente L1CAM, e que a expressão de L1CAM era dependente da lesma. Em linha com esta observação, Gavert
et al
. mostraram que a estimulação de células epiteliais do ducto pancreático com TGF-β1 levou à aquisição de uma morfologia das células em forma de fuso e a regulação positiva de proteínas mesenquimais e L1CAM expressão, que era dependente da activação mediada por JNK, de Slug [40].
na linha de células de carcinoma da mama MCF7, regulação positiva de L1CAM foi mostrado para levar a perturbações de junções aderentes contendo e-caderina e, desse modo, ao aumento da actividade de transcrição de β-catenina [48]. A activação do β-catenina contribuiu para L1CAM expressão sustentada e motilidade celular aumentada [48], que se encontra em linha com outras evidências mostrando que L1CAM é um alvo de β-catenina sinalização [39]. No entanto, os nossos resultados não mostraram expressão de proteína alterada ou localização de β-catenina em células quimiorresistentes, e mais importante ainda, knockdown de β-catenina não reduziu os níveis de L1CAM, indicando que a expressão L1CAM não foi regulada por β-catenina nestes células. Os nossos resultados são, portanto, em consonância com os achados por Pfeifer
et al
. mostrando no carcinoma do endométrio que Slug, e não β-catenina, é responsável pela regulação positiva do L1CAM [41].
A sobre-expressão de L1CAM foi mostrado para promover a proliferação de células tumorais, e a inibição da expressão ou função L1CAM pode suprimir proliferação [35-37]. Knockdown de L1CAM reduziu a proliferação na resistente à quimioterapia Panc 03,27 célula linhas
(Fig 4D)
. Esta redução no crescimento não foi observada nas linhas celulares que não expressam quimiossensíveis L1CAM. Os nossos resultados apontam para um papel específico para L1CAM na proliferação de células de cancro do pâncreas resistentes a 5-FU. É necessário mais trabalho para entender o efeito da L1CAM sobre a proliferação, no entanto, outros relatos apontam para um link para o ERK1 /2 e os AKT-vias, que ambos são conhecidos para acelerar a proliferação e crescimento das células tumorais [35,37,49 , 50]. Além disso, a proliferação reduzida visto para os clones quimiorresistentes seguintes knockdown L1CAM na Figura 4D, em parte, pode ser um resultado do ligeiro aumento em apoptose visto na figura 4F, seguindo knockdown L1CAM.
Curiosamente, o aumento da capacidade de invasão exibidos pela nossa os clones quimiorresistentes foi reduzida quando L1CAM foi derrubado, ou quando a parte extracelular de L1CAM foi bloqueada com um anticorpo. O aumento da capacidade de invasão através da regulação positiva de L1CAM é possivelmente um dos muitos regulamentos a jusante do Slug após a indução de EMT.
Há alguns relatos contraditórios sobre a L1CAM papel desempenha no processo de EMT. Por exemplo, Gavert
et al
. Recentemente, mostrou que L1CAM metástase mediada das células cancerígenas do cólon era dispensável para indução de EMT e uma expressão alterada das células epiteliais e proteínas marcadoras mesenquimais [51]. Mais estudos são necessários para elaborar se upregulation de L1CAM faz parte da EMT ou mesmo o evento indutor. L1CAM pode não ser ela própria uma EMT-mediador, mas parece ser regulada por Slug induzida por EMT, e uma vez expressa, parece conduzir a invasão.
L1CAM tem sido mostrado para ser envolvido na mediação de quimioresistência contra gemcitabina e etoposido em linhas celulares PDAC [38]. Investigou-se se knockdown de L1CAM reduziu a resistência adquirida a 5-FU exibida pela linha celular B1V. Nas nossas mãos, L1CAM apareceu para proteger moderadamente células de apoptose na ausência de 5-FU, e mais ainda na presença de 5-FU.
estão previstas mais estudos para investigar se o tratamento com anticorpos anti-L1CAM irá reduzir o crescimento ou metástase de nossas linhas celulares de cancro do pâncreas resistentes a 5-FU
in vivo
. A constatação de que as células de cancro do pâncreas com resistência adquirida para 5-FU mostra o aumento da expressão de L1CAM, em adição à distinção da presença L1CAM em canceroso versus tecidos normais [52], faz-nos a esperança de que a segmentação de L1CAM com anticorpos terapêuticos e /ou follows;
ABCB1-Hs00184500_m1
ABCC5-Hs00981087_m1
CTNNB1-Hs00355049_m1
GAPDH-Hs02758991_g1
Vimentin-Hs00185584_m1
CDH1/Ecadherin-Hs01023894_m1
CDH2/Ncadherin-