Abstract

A hipóxia e exaustão de soro são características comuns de tumores sólidos que ocorrem após antiangiogenesis , irradiação e quimioterapia através de uma ampla variedade de neoplasias. Aqui nós mostramos que as células tumorais expressando CD133, um marcador para câncer colorretal iniciar ou células-tronco, são enriquecidos e sobreviver em condições de hipóxia e de depleção de soro, enquanto que as células CD133- sofrem apoptose. células tumorais CD133 + aumentar células-tronco do câncer e propriedades de transição epitelial-mesenquimal. Além disso, através de rastreio de um painel de tirosina e serina /treonina quinase vias, identificamos Hsp27 é constitutivamente activada em células CD133 +, em vez de células CD133- sob condições de hipoxia e de depleção de soro. No entanto, não houve diferença na activação entre Hsp27 células CD133 + e CD133- sob condições de crescimento normal. activação Hsp27, que foi mediada pela via p38MAPK-MAPKAPK2-Hsp27, é necessário para as células CD133 + para inibir a caspase 9 e 3 clivagem. Além disso, a inibição da sinalização de Hsp27 sensibiliza células CD133 + de hipoxia e depleção de soro apoptose induzida. Além disso, a via anti-apoptótica também é activada em células estaminais cancro CD133 + enriquecido em cultura de esferóide a partir de uma variedade de células de tumores sólidos, incluindo pulmão, cérebro e cancro oral, sugerindo que é uma via comum activado em cancro de células estaminais a partir de vários tipos de tumores. Assim, a activação de PP2A ou inactivação da via p38MAPK-MAPKAPK2-Hsp27 podem desenvolver novas estratégias para o tratamento do câncer pela supressão da sua população TIC

Citation:. Lin SP, Lee YT, Wang JY, Miller SA, Chiou SH, Hung MC, et ai. (2012) Survival of Cancer Stem Cells sob hipóxia e Serum Esgotamento via Diminuição da PP2A Atividade e ativação de p38-MAPKAPK2-Hsp27. PLoS ONE 7 (11): e49605. doi: 10.1371 /journal.pone.0049605

editor: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Canadá |

Recebido: 29 Abril, 2012; Aceito: 11 de outubro de 2012; Publicação: 20 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo Conselho Nacional de Ciência (97-3111-B-010-001 e-99-3111-B 010-005-), Taipei Veterans general Hospital (V98E1-002), o MD Anderson Cancer Center /China Universidade de Medicina e Hospital Fundo instituição-irmã, e da Universidade Nacional Yang-Ming, Ministério da Educação. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os traços fenotípicos e moleculares heterogêneos de cânceres humanos são uma função da sua iniciação tumor ou câncer de células-tronco de conteúdo (TICs) [1]. A população de células CD133 + representam cerca de 2,5% de células de tumores de cancro do cólon [2], e estudos anteriores demonstraram que esta população de células contem um número de tiques tumorigénicas indiferenciadas [2], [3]. Eles mostraram que a injecção subcutânea de células CD133 + cancro colorectal, mas não células CD133-, foram capazes de reproduzir facilmente do tumor original em ratinhos imunodeficientes. A desregulação da TIC auto-renovação é um requisito para o provável desenvolvimento de cancro [4], [5], [6], e a sobrevivência de tiques podem ser responsáveis ​​pela resistência a terapias contra o cancro e recorrência de tumores [7]. Os mecanismos subjacentes de sobrevivência TICs de terapias antitumorais são em grande parte desconhecido. No entanto, um aumento nos transportadores ABC [8], a capacidade de reparação de ADN activa [7], e resistência à apoptose pela produção de citocinas ou de activação de vias específicas têm sido relatados. Assim, identificando as vias de sinalização das propriedades de sobrevivência e auto-renovação das TICs tem atraído recentemente uma grande dose de atenção, devido à promessa de um novo alvo celular para o tratamento de cancros.

proteínas de choque térmico ( HSP) desempenham um papel essencial como chaperones moleculares, auxiliando o correto enovelamento de proteínas deformadas acumulada ao estresse, e interagindo diretamente com vários componentes do programado máquinas morte celular estreitamente regulada. Entre eles, o nível basal Hsp27 é geralmente elevada em células ou tecidos de uma ampla gama de tumores [9]. Além disso, tem sido demonstrado que a Hsp27 aumenta a resistência à quimioterapia com cisplatina e doxorrubicina, e aumenta o potencial tumoriogenic de células de cancro do cólon de rato [10].

A hipóxia e a depleção de soro são características comuns de tumores sólidos que ocorrem mediante antiangiogenesis, irradiação e quimioterapia através de uma ampla variedade de doenças malignas [11], [12]. A hipóxia e a anemia (o que contribui para hipoxia tumoral) pode conduzir a radiação ionizante e a resistência à quimioterapia, privando as células tumorais do oxigénio essencial para as actividades citotóxicas de esses agentes [13], [14]. A hipoxia pode também reduzir a sensibilidade do tumor à terapia de radiação e quimioterapia, através de um ou mais mecanismos indirectos que incluem mudanças genómicas e proteomic. Estes efeitos, por sua vez, pode levar a um aumento da capacidade de invasão e potencial metastático, perda de apoptose, angiogénese e caótico, aumentando ainda mais a resistência ao tratamento. No entanto, a resposta das células tumorais à hipóxia e depleção de soro e o mecanismo subjacente medeia esta resposta devem ser esclarecidas. No presente estudo, nós demonstramos que a maioria das células cancerosas do cólon sofrer apoptose por exposição a depleção de soro e hipoxia, e a população CD133 + de células de cancro do cólon é mais resistente a apoptose através da activação constitutiva de uma via de sinalização anti-apoptótica envolvendo Hsp27. Além disso, mostramos que as TICs podem ser sensibilizados a apoptose e morte celular através da inativação da via Hsp27.

Materiais e Métodos

cultura de células e condições de hipóxia

A a linha celular de cancro colorrectal humano HT-29 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC). Os CCS e células de cultura primária HCW foram dotados pelo Dr. Wen K. Yang (Laboratório de celular /Gene Therapy, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan). As células CCS foram isolados a partir de um tumor primário de uma mulher com Duke C

3 adenocarcinoma do cólon. As células HCW foram isolados a partir da amostra de metástases do fígado de um macho com adenocarcinoma do cólon. Todas as células foram cultivadas em DMEM (Gibco, Grand Island, NY), contendo 10 unidades /mL de penicilina, 10 ug /ml de estreptomicina, 2 mmol /L de glutamina, e soro bovino fetal a 10% (FBS; Gibco), em 37 ° C atmosfera húmida com 5% de CO

2. Para condições de hipoxia, as células foram cultivadas numa mistura de gás composta de 94% de N

2, 5% de CO

2, e 1% de O

2, a qual foi mantida utilizando uma incubadora com dois sensores de ar, uma de CO

2 e outro para o

2; O

2 Ó concentração foi alcançada e mantida usando a entrega de gás nitrogênio (N

2). Se aumentos O

2 percentuais acima do nível desejado, N

2 gás foi automaticamente injetada no sistema para deslocar o excesso O

2. Para a cultura esferóide, as células foram ressuspensas em meio DMEM isento de soro /F12 suplementado com suplemento N2, EGF humano recombinante (20 ng /ml; Pepro Tech), e o FGF (10 ng /ml; Pepro Tech), e colocadas em placas a uma densidade de 10

4 células /cavidade em uma de 6 poços de microplacas Ultra-Baixo anexo (Corning, Lowell, MA).

Ensaios de apoptose

a apoptose foi analisada com um corante celular que detecta membrana alterações (fosfatidilserina aleta) e manchas de células em apoptose (APOPercentage; Accurate Chemical Scientific Corporation, New York, NY). As células coradas foram analisadas utilizando um leitor de microplacas Spectramax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Alternativamente, as células foram recolhidas por tratamento com tripsina, coradas com ensaio TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche), e visualizada utilizando microscopia de fluorescência. Para a detecção das formas clivadas de caspase 3 e 9, os lisados ​​de proteína foram preparados e uma transferência de Western foi realizada com os anticorpos primários adquiridos a partir de Cell Signaling Technologies (Beverly, MA).

A migração celular e invasão Ensaio

Para o ensaio de migração, 4 × 10

4 células, suspensas em 200 ul de DMEM suplementado com% de FBS 0,5, foram semeadas no poço superior de 24 poços Transwell que continha um filtro com 8 um poros ( Corning, Costar, EUA). Na parte inferior bem, adicionaram-se 600 ul de DMEM suplementado com FBS a 15%. As células foram incubadas a 37 ° C durante 24 h. As células dos retidos no poço superior foram removidos por zaragatoa e aqueles migrado para o lado oposto do filtro foram corados com DAPI e contadas sob um microscópio de fluorescência a 200 × ampliação. A capacidade invasiva das células foi determinada com Matrigel (Becton Dickinson) com filtros de policarbonato -Revestido 8 uM poros de 24 poços Transwell. Densidade de sementeira celular, meio de cultura, o período de cultura, e o método de avaliação foram os mesmos com o ensaio de migração.

em tempo real de RT-PCR

O método de tempo real de RT-PCR foi realizada como descrito [15]. Resumidamente, o ARN total (1 ug) de cada amostra foi transcrito reversamente em 20 ul usando 0,5 ug de oligo dT e 200 U de Superscript III TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). A amplificação foi realizada num volume total de 20 uL contendo 0,5 uM de cada iniciador, MgCl 4 mM de

2, 2 ul de DNA do LightCycler ™ -FastStart mestre SYBR Green I (Roche Molecular Systems, Alameda, CA) e 2 110 ul de cDNA diluído. As reacções de PCR foram preparadas em duplicado, e aqueceu-se a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 seg, emparelhamento a 60 ° C durante 1 min, e extensão a 72 ° C durante 20 seg. As curvas padrão (valores de limiar de ciclo dependendo da concentração de molde) foram preparadas para cada gene alvo e da referência endógena (GAPDH) em cada amostra. A quantificação das amostras desconhecidas foi realizada pelo LightCycler Relativa versão Quantificação Software 3.3 (Roche).

Fluxo de análise de citometria, triagem e MACS-separação

Suspensões de células cancerosas levantadas com EDTA foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas durante 30 min a 4 ° C com FITC ou PE-conjugados de anticorpos monoclonais contra marcadores CD humanos em 50 ul de tampão de lavagem (PBS, 2% de FBS). Após a incubação, as células com os anticorpos ligados foram lavados duas vezes com tampão de lavagem e fixados em paraformaldeído a 1% (em PBS). Os anticorpos do isotipo de rato serviu como controlos respectivos. As células foram analisadas usando um citómetro de fluxo FACScan software em execução CellQuest (Becton Dickinson, San José, CA). As células usadas para a triagem foi preparado como o método para a citometria de fluxo com todos os reagentes e asséptica, sem qualquer fixação. separação de células magnético (MACS) de células CD133 + foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (https://www.miltenyibiotec.com/en/NN_21_MACS_Cell_Separation.aspx). Após incubação com CD133-micropérolas imunomagnéticas (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemanha) durante 30 min a 4 ° C, as células foram lavadas em PBS mais 0,5% de BSA mais EDTA 2 mM, filtrado através de um filtro de células de 40 mícrons, e de execução mais de um dispositivo de separação magnética de células (auto-Macs; Miltenyi Biotec). para a selecção positiva de células CD133 +

Análise Western Blot

foram preparados extractos celulares com M-PER (Pierce, Rockford, IL ) mais cocktail de inibidor de protease (Halt ™; Pierce) e as concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio BCA (Pierce). As aliquotas dos lisados ​​de proteína foram separados em SDS-10% de gel de poliacrilamida e transferidos para filtros de membrana de PVDF, que foram bloqueadas com 5% de leite grau blotting (Bio-Rad, Hercules, CA) em TBST (Tris-HCl 20 [pH 7,6] , 137 mM de NaCl, 1% Tween 20). As membranas foram então sondadas com os anticorpos primários indicados, feito reagir com anticorpos secundários correspondentes, e detectado utilizando um ensaio de quimioluminescência (Millipore, Billerica, MA). As membranas foram expostas a película de raios-X para visualizar as bandas (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Os anticorpos contra pPP2A (# 12615; Santa Cruz), pP38 (# 9216; Cell Signaling), pMAPKAPK2 (# 3007; Cell Signaling), pHsp27 (AF2314, R D), β-tubulina (# 05-661; Millipore), e-caderina (# 4065; Cell Signaling), N-caderina (# 4061; Cell Signaling), vimentina (MAB3400; Millipore), fibronectina (SC-8422; Santa Cruz), pJak2 (# 3771; Cell Signaling) e PC- src na Tyr416 (# 2101; Cell Signaling) foram usadas. PP2 e PP3 foram adquiridos de Calbiochem.

imunofluorescência e imunohistoquímica Coloração

Para imunofluorescência, esferas foram tratadas com tampão de bloqueio, incubadas com anticorpos de rato ou de coelho contra CD133 humano (AC133 IgG, Miltenyi) , CK 20 (Ks20.8 de IgG2a de ratinho, GeneTex, San Antonio, TX), CDX2 (Chemicon, Temecula, CA), e β-catenina (H-102, Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA), em diluições apropriadas durante a noite a 4 ° C, lavou-se extensivamente com PBS, e feito reagir com o correspondente isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpos secundários. Imunofluorescência foi observado com o microscópio de fluorescência. Para coloração imuno-histoquímica, secções de tumor embebidas em parafina foram desparafinizadas, reidratadas e antigénio recuperado por colocação em secções Declere solução de trabalho (Cell Marque, Austin, TX) num forno de micro-ondas durante 20 min. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada por peróxido de hidrogénio a 3%. actividade enzimática residual foi removido por lavagens em PBS, e a coloração não específica foi bloqueada com Bloco Ultra V durante 5 min (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA). Em seguida, fizeram-se reagir as secções com primeiros anticorpos durante a noite a 4 ° C, lavou-se extensivamente com PBS, e feito reagir com anticorpos secundários biotinilados correspondente (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 15 min à temperatura ambiente e tratou-se com estreptavidina-peroxidase (Kit LSAB; Dako, Carpinteria, CA), seguido por coloração com diaminobenzidina. Contracoloração foi realizada com hematoxilina de Mayer

Screening Detecção de fosforilação das RTK e Família de MAPK

As membranas do Kit matriz Humano Phospho-receptor da tirosina quinase (número de catálogo ARY001;. R D Systems, Minneapolis, MN) e o Kit de matriz humana Phospho-MAPK (número de catálogo ARY002; R D Systems) foram bloqueadas com tampão de matriz que, durante 1 h. Os lisados ​​de proteína diluídas em tampão de matriz I foram incubar durante a noite a 2-8 ° C (ou 2 h à temperatura ambiente). As membranas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem 1 × à temperatura ambiente, e incubadas com anticorpos de detecção diluída de fresco durante 2 horas à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas e detectadas usando um ensaio de quimioluminescência. As membranas foram expostas a filme de raios-X para visualizar os pontos

Lentivirus Vector Produção e Infecção celular

Os plasmídeos de expressão e os clones de bactérias para Hsp27 shRNA. (ShRNA1: TRCN0000008753, shRNA1: TRCN0000011466) foram fornecidos pelo núcleo RNAi do Conselho Nacional de Ciência, em Taiwan. Os vectores lentivirais shRNA foram produzidas por transfecção de células 293FT utilizando Lipofectamina 2000 (LF2000; Invitrogen, Carlsbad, CA). Os sobrenadantes foram colhidos 48 h após a transfecção e depois foram filtrados. As células subconfluentes foram infectadas com lentivírus na presença de 8 ug /ml de polibreno (Sigma-Aldrich). Às 24 h pós-infecção, que removido e substituído com meio de crescimento fresco contendo meio de puromicina (4 ug /ml) e seleccionados para as células infectadas durante 48 h.

fosfatase PP2A Ensaio de Actividade

PP2A a actividade foi ensaiada utilizando o kit de V2460 fosfatase (Promega, Madison, WI). Resumidamente, as células separadas por MACS ou enriquecido para TIC foram lisadas em tampão de armazenamento da fosfatase, seguido por remoção do fosfato endógena utilizando colunas de centrifugação fornecidos pela serina /treonina fosfatase sistema de ensaio. 1 ug de proteína em amostras de triplicados foram incubadas com fosfopéptido em tampão de reacção PP2A durante 2 h à temperatura ambiente. Após a lavagem, as amostras foram colorized por mistura de corantes durante 15 minutos, seguido de paragem da reacção, e os valores de DO a 600 nm foram medidos. Os dados foram normalizados com células de controlo como 100%.

Análise Estatística

Todos os valores são expressos em média ± SD. As comparações entre os dois grupos foram analisados ​​pelo teste t de Student. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A hipóxia e Serum Esgotamento aumentar a população de células CD133 +

A exposição de células de cancro do cólon tanto hipóxia e soro. meio isento resultou em um grande número de morte celular, sugerindo que a maior parte das células tumorais não sobreviver sob estas condições. No entanto, verificou-se que a percentagem de células CD133 + de células HT-29 do cancro do cólon aumentou algumas vezes sob condições hipóxicas e também com meio isento de soro, em comparação com condições de normóxia. No entanto, em ambos os hipoxia e isento de soro condições médias, a população CD133 + foi aumentada até cerca de 30 vezes (Figura 1A). O aumento na percentagem de células CD133 + foi observada após 2 dias e ainda mais dramaticamente no dia 4 ou 6. Este aumento em células CD133 + foi também observada no CCS e culturas primárias de células cancerígenas do cólon HCW (Fig. 1B). O aumento na percentagem de células CD133 +, no entanto, não foi devido a um aumento do número total de células CD133 +, enquanto o número real de células CD133 + diminuiu ligeiramente, juntamente com o aumento da cultura em condições de hipoxia e isento de soro condições médias (Figura 1C) ou em comparação com o número de células CD133 + sob meio continha soro e /ou condições de normóxia (Figura 1D). Uma vez que as células CD44 + e CD166 + também são considerados como as TICs no cancro colorectal [16], nós também perguntou se estes marcadores foram associados com CD133 e afetado por hipoxia e depleção de soro. Não foram encontrados A maioria das células CD133 + para ser negativa para ambos CD44 e CD166, no entanto, a hipoxia e soro de depleção foi observado um aumento nas células CD166 +, mas não de CD44 + e a população de CD166 + foi muito menor do que a de CD133 + (Figura 1E) , o que sugere que a maioria da população CD133 + é distinta das células + /CD44 + CD166. Como esperado, CD133 + células foram coradas negativo para CD29, CD90 e CD105, marcadores de células-tronco mesenquimais e CD45, marcador de células hematopoiéticas (Figura 1F). Sem as células foram coradas positivas para CD45 e CD105, e nenhum destes marcadores foram aumentadas sob depleção de soro e condições de hipoxia (Figura 1F).

(A), HT-29, células CCS e PAS (B) foram semeadas com meio de crescimento normal (FBS) sob normoxia (NOR). As células foram expostas a depleção de soro (SF), hipoxia (Hyp), hipóxia e soro de esgotamento, ou, como controlo, nas mesmas condições, e 2, 4 ou 6 dias mais tarde, as células foram colhidas para o ensaio de percentagem de CD133 por fluxo citometria. (C painel esquerdo) número total de células para cada condição e (C painel direito) o número de células de CD133- e CD133 + de células HT-29 no período indicado sob hipóxia e exaustão de soro foram medidos. (D painel esquerdo) número total de células e (D painel da direita) número de CD133 + e células CD133- de CCS e células HCW em 4 dias sob cada condição. (E e F) citometria de fluxo para perfis de proteínas de superfície de células cultivadas sob controle, ou em condições de hipoxia e soro exaustão durante 4 dias.

As células CD133 + possuem propriedades de Colorectal TICs

Para aprofundar se a CD133 + população são bona fide TICs colorretais foram utilizados os seguintes propriedades associadas TICs colorretal na literatura para caracterizar a CD133 + população. Desde uma habilidade característica essencial de TICs é formar esferas indiferenciadas (esferóides) [2], foi perguntado se as células CD133 + isoladas de hipóxia e depleção de soro possuem a capacidade. Descobrimos que CD133 + células foram capazes de formar esferas mais rapidamente do que as células CD133- quando cultivadas em meio sem soro suplementado com EGF e FGF2 (Figura 2A). Como esperado, as células nas esferas foram positivos para CD133, mas negativo para os marcadores de diferenciação de tumores colo-rectais, ou seja β-catenina nuclear (activada β-catenina), citoqueratina 20 (CK20) e o factor de caudal tipo homeobox transcrição 2 (CDX2) (Figura 2B e 2C), que indicam essas esferas foram esferas indiferenciadas. Para investigar se a população CD133 + enriquecida nas esferas possui a capacidade para formar diferenciadas marcadores de tumores colo-rectais, CD133 + esferas foram semeadas em matrigel e exposto a meio contendo soro. Após cultura nestas condições por 2 semanas, eles começaram a formar esferas diferenciadas que foram diminuídos na coloração CD133, positivos para β-catenina nuclear, CK20 e CDX2 (Figura 2B e 2C). Importante, para células CD133 +, injecção de menos de 1.000 células era suficiente para formar tumores quando transplantadas em murganhos imunodeficientes, mas mesmo com 100.000 células, CD133- não eram capazes de formar tumores (Figura S1A). Para ser esperado, os tumores formados por células CD133 +, semelhantes a tumores formados por células a granel, foram coradas positivamente para os marcadores de cancro colo-rectal (Figura S1B). Além disso, os tumores de xenoenxerto formados por CD133 + também continham células CD133 + e células CD133- (Figura S1B), e o CD133 + população isolada a partir de tumores de xenoenxerto formada uma população de células misturadas com células CD133 + e CD133-

ex vivo

, enquanto o população CD133- ainda deu origem a CD133- células (Figura s1c). Estes dados demonstram células CD133 + formados tumor xenoenxerto e deu origem a duas células CD133 + e CD133-, sugerindo estas células CD133 + possuía as propriedades de TICs. Além disso, o quantitativo de RT-PCR demonstrou que CD133 + tiveram um aumento da expressão de genes relacionados com várias células estaminais incluindo, Oct4, Nanog, nestina, KLF4, Notch1, Notch 2 e Notch 3, c-myc, Gil1, Wnt5a e VEGF (Figura 2D e a Figura S2). Oct4 e Nanog são exclusivamente expressos em células estaminais embrionárias [17], nestina, expresso em células estaminais neurais pluripotenciais [18], enquanto KLF4, c-myc, e os genes de Notch, a Shh, e vias WNT são expressos em TIC de uma variedade de cancros [19], [20], [21]. O VEGF é um dos alvos putativos de hipóxia indutível factores-1α (HIF-1α) [22]. HIF1-α também tem sido demonstrado induzir a transição epitelial-mesenquimal (EMT) [23], o qual foi recentemente mostrado ser capazes de gerar células com as propriedades de células estaminais no cancro da mama [24]. Curiosamente, também descobrimos que CD133 + e diminuiu em E-caderina e aumento nos marcadores de EMT, tais como N-caderina, vimentina e fibronectina por RT-PCR quantitativa e análise de Western blot (Figura 2E). Importantemente, o aumento dos marcadores EMT em células CD133 + também foi associada com um aumento da capacidade de migração e invasão celular, características de células com um aumento de EMT (Figura 2F). Assim, As células CD133 + possuem características de EMT e aumentar marcadores de células-tronco embrionárias e um gene alvo HIF.

(A) Sphere capacidade de formação de células CD133 + e CD133-. células CD133 + e CD133-, separados por MACS após 4 dias cultivadas em condições de hipoxia e depleção de soro, foram cultivadas sob condições isentas de soro, na presença de EGF (10 ng /ml) e FGF2 (10 ng /mL). formação esfera foi calculado em 2 semanas ( 25 ou 25 indica o número de células de cada esfera.). As barras de erro representam o desvio padrão. (* P . 0,05 em comparação com células CD133, tal como determinado pelo teste t de Student) (B) CD133 + células após separação MACS no dia 4 de exposição a hipoxia e a depleção do soro, cultivadas sob condições isentas de soro, na presença de EGF (10 ng /ml) e FGF2 (10 ng /mL), as esferas formadas a 2 semanas. Imunofluorescência mostra que estas esferas são esferas indiferenciadas (indiferenciadas), que são positivas para CD133, e negativo para β-catenina nuclear, CDX2 e CK20. As esferas foram então semeadas em matrigel e exposto a condições contendo soro durante mais de 2 semanas. Imunofluorescência mostra que estas esferas são diferenciados (diferenciados), que diminuição na expressão de CD133, aumento na expressão de β-catenina nuclear, CDX2 e CK20. Barra de escala, 20 ^ M (C) as percentagens de células positivas para CD133, β-catenina nuclear, CDX2 e CK20 foram contadas. (D) e (E superiores dois painéis) RT-PCR quantitativo para os níveis de mRNA, análise de imunotransf erência (E painel inferior). (F) a migração de células e ensaio de invasão de células CD133 + e CD133- após separação MACS no dia 4 de exposição a hipoxia e a depleção de soro. Dados de células HT-29 são mostrados como resultados representativos.

As células CD133 + resistentes à hipóxia e Serum depleção induzida apoptose

Em seguida, investigaram se células CD133 + pode ser resistente à hipóxia e depleção de soro induzida por apoptose. Com efeito, as células CD133 + foram consideradas resistentes a apoptose tal como medido pelo ensaio de TUNEL, enquanto que as células CD133- foram positivas para a coloração TUNEL (Figura 3A). Esta ideia foi ainda apoiada quando as células HT-29 foram colhidos após três dias de hipóxia e depleção de soro, e em seguida, as populações celulares CD133 + e CD133- foram respectivamente reseeded durante mais 16 horas sob as mesmas condições e analisados ​​utilizando o ensaio APOPercentage. Aqui verificou-se que na população CD133- houve significativamente mais do que a apoptose nas células CD133 + (Figura 3B). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que as células que são resistentes CD133 + a morte celular induzida por hipoxia e depleção de soro. Para elucidar o mecanismo de células CD133 + resistência à apoptose, primeiro perguntado se esta resistência ocorreu através de uma via apoptótica caspases-dependente. Descobrimos que a expressão de genes de caspases tais como a caspase 9 e 3 foi reduzida em células CD133 + em comparação com as células CD133- em ambos ARNm e os níveis de proteína, utilizando RT-PCR quantitativo (figura 3C) e análise Western blot (Figura 3D), respectivamente. Além disso, CD133 + células também mostrou uma quantidade reduzida de formas clivadas activas da caspase 9 e caspase 3 (Figura 3D). No entanto, não havia nenhuma diferença aparente entre CD133 + e as células CD133- nos níveis de proteína de fósforo-IKKα, nuclear NF-kB e os seus alvos a jusante, tais como Bcl-2 e proteínas survivina (Figura S3). Estes resultados sugerem que a sobrevivência de células CD133 + de hipoxia e depleção de soro é mediada principalmente pela falta de falta de caspase 9 e caspase 3 activação, mas independente de NF-kB, a BCL-2 e survivina.

(A ) coloração de TUNEL para apoptose foi realizada após a separação MACS de CD133- e CD133 + células em hipoxia e depleção de soro durante 4 dias. células (B) CD133- e CD133 + sob hipóxia e soro exaustão durante 3 dias foram colhidas por separação MACS, reseeded sob hipóxia e soro esgotamento e ensaio APOPercentage foi realizada 16 horas depois. (C) RT-PCR quantitativo para os níveis de mRNA. (DF) foram preparados e utilizados para (D, F), análise de imunotransf erência para os níveis de proteína, e (E) MAPK fosfo-anticorpo matriz de lisados ​​celulares de células CD133 + e CD133- após separação MACS no dia 4 de exposição a hipoxia e soro depleção analisar os níveis de vias de sinalização indicados. Os gráficos mostram cada sinalização após normalizada com o controle. As células CD133 + diminuição na expressão e a activação da caspase 9 e 3 e o aumento na expressão de fosfo-Hsp27. As barras de erro representam os desvios padrão. (* P 0,05 e ** p 0,01, conforme determinado pelo teste t de Student.) Dados de células HT-29 são mostrados como resultados representativos

Hsp27 é necessária para a sobrevivência de TICs abaixo. hipóxia e Serum Esgotamento

Uma vez que descobrimos que havia menos da forma ativa da caspase 9 e 3 (Figura 3D), o próximo investigou os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela falta de ativação da caspase 9 e 3 em CD133 + células. Para este fim, utilizou-se rápida e sensível de fosfo-RTK (fosfo-Tyr) e fosfo-MAPK matrizes (fosfo-Ser /Tre), e compararam a fosforilação de proteínas em várias vias diferentes em células CD133 + para CD133- células, sob a condições de hipóxia e depleção de soro. Em geral, não houve diferença significativa da fosforilação em tirosina entre a CD133 + e as células CD133- (Figura S4). Por outro lado, houve várias Ser /Tre fosforilações da cinase que foram aumentados em células CD133 +, a mais óbvia é Hsp27 (8,6 vezes), quando comparado com as células CD133- (Figura 3E). Portanto, avaliamos ainda mais o envolvimento de Hsp27 em CD133 resistência + células à apoptose. A fiabilidade de fosfo-MAPK matrizes foi confirmada por análise Western blot e CD133 + e mesmo aumentado em activação Hsp27, enquanto os níveis de fosforilação de ERK e Akt não foram alteradas (Figura 3F). Portanto, estes dados sugerem a resistência das células CD133 + à apoptose está associada com a ativação de Hsp27.

Hsp27 é necessária para a sobrevivência de TICs em condições de hipoxia e Serum Esgotamento

Para investigar se a atividade Hsp27 é de facto importante para proteger CD133 + população de apoptose, utilizou-se primeiro dois Hsp27-shRNAs e mostrou que a repressão de Hsp27 (Figura 4A), de facto apoptose sensibilizados na população CD133 + em resposta à hipoxia e depleção de soro. Além disso, shRNA específicos de Hsp27 induzida uma redução no aumento da percentagem CD133 + sob condições de hipoxia e meio isento de soro, em comparação com o shRNA mexidos (Figura 4B). Um aumento em apoptose também foi observada com duas shRNAs específicos de Hsp27 em células CD133 + de HT-29 (Figura 4C). Resultados semelhantes foram também observados na cultura primária de CCS (Figura S5A). A análise por Western blot revelou também um aumento da clivagem de caspase 9 e 3 por Hsp27-específica shRNAs (Figura 4A). Além disso, dois inibidores de HSP27 estruturalmente distintos, quercetina e KRIBB3 (específico para Hsp27 fosforilação) [25], também aumentou a clivagem de caspases 9 e 3 em células de HT-29 (Figura 4D) e células CCS (Figura S5B) e induziu uma diminuição do aumento da percentagem de células CD133 + sob hipóxia e soro de depleção (Figura 4E) e resultou em apoptose em células CD133 + (Figura 4F), como esperado, o inibidor de PI3K-Akt, LY294002 e inibidor de ERK, U0126 não induzem estes efeitos ( Figura S5C e S5D). Deve ser mencionado que a quercetina é conhecido por inibir a Hsp27, Hsp70 e Hsp90. Assim, nós também examinou a ativação de Hsp90 e Hsp70 na CD133 + e populações CD133- (Figura 3F). Os resultados demonstram que não há nenhuma diferença no pHsp70 e pHsp90 entre as duas populações de células. Assim, entre as três proteínas Hsp, Hsp27 parece ser o único que é activado em células CD133 +, assim, o efeito quercetina é provavelmente causado pela inibição da Hsp27. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que Hsp27 é necessária para a sobrevivência das TICs em condições de hipoxia e soro de depleção.

As células foram lentivirally transfectadas com Hsp27 shRNA (SHR1 e shR2) ou mexidos shRNA, em seguida, expostos à hipoxia e exaustão de soro . CD133 + e células CD133- foram isolados utilizando separação MACS 4 dias mais tarde.