Abstract

Fundo

Enquanto o classical pathway /p65 de NF-kB é conhecida por estar envolvida na progressão do cancro da próstata e está associado a um mau prognóstico do paciente, o papel da proteína alternativa NF-kB /RelB não está bem definido. Aqui analisamos a ativação de ambas as vias NF-kB em tecidos de câncer de próstata e correlacionar essa ativação com características clínicas da doença.

Métodos

A técnica de imunofluorescência múltipla foi empregada para concomitantemente e quantitativamente visualizar a localização nuclear de p65 e RelB em 200 amostras embebidas em parafina. Epitélios foram definidos utilizando marcadores fluorocromos adequados e os sinais de imunofluorescência resultantes foram quantificadas com um sistema de pontuação automatizado.

Resultados

A frequência nuclear de p65 foi encontrada para ser significativamente aumentada em tecidos tumorais, em comparação com tecido normal adjacente, enquanto que a frequência de RelB foi reduzida (p 0,001, teste de Wilcoxon). Como relatado anteriormente, p65 frequência nuclear foi associada com um risco de recidiva bioquímica. Embora, a frequência nuclear RelB sozinho não prever a recorrência, a presença de RelB activado reduziu o risco de recorrência associado com a ativação de p65.

Conclusão

Pela primeira vez p65 /RelB co- distribuição foi avaliada em tecidos de câncer de próstata e sugeriu uma interferência negativa entre as duas vias de NF-kB na progressão do câncer de próstata

Citation:. Labouba I, Le Page C, Communal L, Kristessen T, Você X, Péant B , et ai. (2015) Potencial Cross-Talk entre Alternativa e clássica Pathways NF-kB em Prostate Cancer tecidos como medido por uma Multi-imunofluorescência co-localização de Ensaio. PLoS ONE 10 (7): e0131024. doi: 10.1371 /journal.pone.0131024

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, United States |

Recebido: 09 de fevereiro de 2015; Aceito: 26 de maio de 2015; Publicação: 17 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Labouba et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte

Financiamento:. Chair en Cancer de la próstata (Université de Montreal, https://www.recherche.umontreal.ca/en/research-at-udem/our- pesquisa-unidades /profile /unir //pid /15) prêmio 449 /CUOG (https://www.cuog.ca) Réseau de recheche en câncer (https://www.rrcancer.ca/fr/scientifique/biobanques/Lister /2). Visiopharm ‘forneceu apoio sob a forma de um salário para TK autor, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. O papel específico deste autor é articulada na seção “autor contribuições ‘

CONFLITO DE INTERESSES:. A filiação de TK autor para a empresa Visiopharm não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas de dados e materiais de partilha .

Introdução

o câncer de próstata é o câncer mais freqüentemente diagnosticado em homens norte-americanos e é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em homens após os cancros do pulmão e do cólon [1]. Tipicamente, o cancro da próstata permanece localizada no interior da glândula da próstata. No entanto, pode também cresce de forma agressiva para além da cápsula prostática e levar à formação de metástases [2]. Enquanto alguns pacientes com câncer de próstata só exigem uma monitorização activa da doença, outros precisam de tratamentos mais radicais [3, 4]. Actualmente, a maioria dos pacientes com cancro da próstata localizado submeter a cirurgia, radioterapia ou terapia de privação de androgénio como tratamento de primeira linha de [5]. No entanto, apesar das taxas de sucesso elevadas obtidas com estes tratamentos, 25% dos pacientes desenvolvem recorrência bioquímica (BCR), após o tratamento com a hormona-terapia e progredir para uma doença mais agressivo [6, 7]. Assim, um dos principais desafios no cancro da próstata é a discriminação adequada de pacientes com uma doença progredir latente ou lenta daqueles com uma forma mais agressiva do cancro. Tal discriminação vai ajudar a planejar o tratamento de forma adequada para pacientes individuais. Para melhor estratificar o prognóstico pacientes com câncer de próstata, a identificação de biomarcadores moleculares específicos capazes de prever o resultado representaria um importante avanço sobre ferramentas clínicas existentes. Neste contexto, o nosso grupo foi o primeiro a abordar o potencial prognóstico da subunidade p65 do Fator Nuclear (NF) -κB no câncer de próstata [8] e destacar um papel potencial da Nuclear Factor (NF) -κB na progressão do cancro da próstata [9, 10].

A família NF-kB inclui cinco proteínas de fator de transcrição caracterizadas por seu domínio Rel-homologia. Não são subdivididos em dois grupos principais: Classe I (NFκB1 e NFκB2) e classe II (Rela /p65, RelB, e c-REL). O NFκB1 e NF-κB2 são traduzidas nas proteínas P100 e P105 que são processados ​​em suas respectivas subunidades p50 e P52 [11]. Dois principais vias de sinalização de controlo de NF-kB: a via clássica, em que o heterodímero p65 /p50 é a principal dímero activo, e a via alternativa onde o RelB /p52 é o dímero activo. Sob condições normais, o NF-kB é mantido inactivo no citosol por o IkB P100 ou proteínas. Durante a activação, na via clássica (IKKβ-dependente), o complexo IKK fosforila IkB, induzindo a sua ubiquitinação e degradação pelo proteassoma. Isto leva à translocação nuclear do p65 /p50 ou p50 dímeros /c-rel. Na via alternativa (IKKα-dependente), o complexo IKK regula o processamento do precursor de p100, em oposição a IkB [12-15], que gera p52 e a translocação nuclear do p52 /dímero RelB.

funções moleculares e biológicas Numerosos, tais como a inflamação [16, 17], a angiogénese [18], sobrevivência, migração e invasão [19] foram mostrados para ser associada com a actividade dos factores nucleares clássicos de NF-kB na progressão do cancro ( revisto em [20]). Embora o trabalho significativo concentrou-se no estudo da via clássica do NF-kB, recentemente, a atenção tem sido dirigida para a via alternativa de NF-kB, e em particular no que se refere à sua influência sobre a inflamação. As funções biológicas de NF-kB também envolver a diafonia entre as vias clássica e alternativa a diferentes níveis, a partir de sinalização a montante de interacções nucleares através da formação de dímeros de diversas NF-kB. Dependendo do contexto e dos estímulos, as duas vias podem cooperar, ou interferir de forma negativa, na regulação da expressão gênica. Além disso, as funções biológicas dirigidas pelo crosstalk de ambas as vias continuam a ser mal compreendido e nunca foi investigado em células cancerosas da próstata.

No câncer de próstata, vários estudos têm relatado que tanto RelB e p65 pode ser biomarcadores de prognóstico putativos associados com a progressão da doença. Nós e outros, anteriormente observadas por imuno-histoquimica (IHC) em tecido de cancro da próstata, que os valores elevados de p65 nuclear foram associados com a doença mais agressivo [8, 21]. Subsequentemente, mostrou-se que a localização nuclear de p65 é altamente preditivo de invasão linfonodo [9] e foi associada com recorrência bioquímica (BCR), quer isoladamente ou em combinação com ErbB activado /Akt sinalização [21-25]. Mais recentemente, observou-se um aumento da presença de RelB nuclear em tecidos de cancro da próstata em comparação com tecidos não-neoplásticas, o que sugere que a via alternativa do NF-kB também é activado durante o curso da progressão da doença [10]. Além disso, foi demonstrado em um

In vitro

modelo que a inibição da expressão RelB aumenta a proliferação de células cancerosas da próstata 22Rv1 castração-resistente e estimula autofagia celular [26]. Outros estudos revelaram que RelB aumenta a radiossensibilidade das células de castração-resistente [27-30] aparentemente por cima de regulação de IL-8 [31]. Em linha com estas observações preliminares, foi também demonstrado que RelB é sobre-expresso em glândulas da próstata em resposta à privação de androgénio [32] e o tratamento de radiação [33], e também induz a expressão de de β-galactósido α2,3-sialiltransferase, um gene envolvida na expressão de gangliósidos e progressão do cancro [34]. Mais recentemente, um crosstalk negativa foi mostrada entre RelB e AR, e associação com a sobrevivência e cancro metastático [35].

A fim de estimar o papel de RelB ea interferência entre o clássico eo alternativa NF-kB vias, que implementada uma técnica de fluorescência de coloração de multi-modo para analisar quantitativamente a presença simultânea de p65 nuclear e RelB nos mesmos núcleos de tecido de cancro da próstata. A quantificação do sinal fluorescente foi apoiado por um sistema automatizado. Para avaliar o papel biológico de ambas as actividades da via NF-kB, que correlacionou a localização nuclear de p65 ou RelB com parâmetros clínicos e risco de recorrência bioquímica para melhor undrstand o papel potencial do crosstalk via NF-kB na progressão do cancro da próstata.

Materiais e Métodos

coorte de pacientes

O presente estudo foi baseado em uma coorte retrospectivo de 200 pacientes com câncer de próstata cujos formalina parafina fixo incorporado (FFPE) amostras de câncer de próstata primário, foram utilizado para construir os Tissue microarrays (TMAs). Todos os pacientes foram operados entre 1992 e 2006 e desde consentimento informado por escrito. Todos os consentimentos foram seguramente arquivado em um lugar bloqueado e digitalizado consentimentos em uma senha protegida pasta eletrônico. O critério de inclusão para este estudo de coorte retrospectivo foi a ausência de qualquer tratamento antes da prostatectomia radical (RP). Após uma avaliação de triagem dos dados clínicos, 11 pacientes foram excluídos do estudo, uma vez que não cumpria o critério de inclusão. A média de seguimento dos pacientes foi de 96 meses. BCR (Biochemical Recorrência) foi definido com base em uma PSA (Prostate Specific Antigen) recaída acima de 0,3 ng.ml

-1 após a data da cirurgia (RP). intervalo livre de recidiva foi definida como o tempo entre a RP e a data da primeira aumento PSA acima de 0,3 ng.ml

-1. O estadiamento final, classificação e diagnóstico histológico foi baseada no relatório de patologia clínica do Hôpital Notre-Dame, (CHUM, Montreal, QC, Canadá). aprovação ética foi obtida a partir da placa de revisão apropriada (Comité d’éthique de la recherche du CHUM). autorizações escritas foram seguramente arquivado em local trancado, e consente digitalizados eletronicamente foram salvos em uma pasta eletrônica protegida por senha. aprovação ética foi obtida a partir da placa de revisão apropriada (Comité d’éthique de la recherche du CHUM). Os principais parâmetros clínicos dos 189 casos da coorte são: tempo médio de acompanhamento, 95 meses; 49% Gleason 7; 44% Gleason = 7; 7% Gleason 7; 18 casos com envolvimento de vesículas seminais contra 170 sem; 26% com extensão extraprostática, 32% com margem cirúrgica positiva; 3% com a invasão dos linfonodos; 142 com estágio patológico 2 e 47 com estágio patológico 3; a taxa específica de câncer é de 3% ea recorrência bioquímica é de 28%

Tissue microarrays

A partir de amostras de tecido humano FFPE, foram selecionadas áreas tumorais com base em comentários de Hematoxilina /Eosina (H . E ) -stained desliza por um patologista. blocos tumorais FFPE foram então submetidos a biópsia, utilizando uma agulha arrayer tecido diâmetro 0,6 milímetros e os núcleos resultantes foram dispostas sobre uma grelha num bloco de parafina receptor. Cada conjunto continha TMA, um núcleo de uma amostra do tumor e um núcleo de um tecido glandular prostático adjacente normal para um total de 100 pacientes. Estes TMAs foram construídos em duplicado para análise de dois núcleos independentes de cada tipo de tecido per casos. amostras de TMA foram seccionados, manchado por ambos H . E-e imuno-histoquímica (IHQ) para o peso alta Molecular Cytokeratin (HMCK), e posteriormente foram submetidos a uma avaliação patologia independente para confirmar e anotar a histologia de cada núcleo

a imuno-histoquímica (IHQ)

IHC foi realizada utilizando um corante XT Referência automatizado (Ventana Medical System Inc. VMSI), Tucson, EUA). A recuperação antigênica foi realizada com a Ventana celular Condicionado 1 reagente (VMSI # 950-124). Os anticorpos primários utilizados foram: anti-p65 (sc-8008), anti-RelB (SC-226), anti-citoqueratina (CK) 18 (sc-6259) e anti-PSA (sc-7638), todos obtidos a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) e anti-CK19 (MS-198-P0) da Thermo Scientific Lab Visão (Ottawa, ON, Canadá). A especificidade dos anticorpos anteriores contra p65 e RelB foi previamente verificada por Western-blot [26, 36]. Os anticorpos foram diluídos de 1:25 a 1: 1000 em tampão de anticorpo um diluente (VMSI # ADB250), excepto para o anti-PSA que foi diluída em solução salina tamponada com fosfato (PBS). anticorpos diluídos foram dispensadas manualmente nas lâminas e incubaram-se a 37 ° C durante 60 min. As reacções foram realizadas utilizando o kit de detecção de UltraView DAB (VMSI # 760-500) e, em seguida, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina e reagente azulados (VMSI # 760-2021 e 760-2037 #). Todas as secções foram digitalizados com um objetivo 20x 0.75NA com uma resolução de 0,3225 milímetros, usando o scanner de slides VS-110 (Olympus, Richmond Hill, ON, Canadá) e analisados ​​impedimento a lado com coloração citoqueratina HW para explicar glândulas benignas.

imunofluorescência (IF)

produziu uma máscara epitelial utilizando vários antígenos epiteliais específicos para distinguir estroma e componentes epiteliais no tecido. Para garantir a cobertura de todas as células de câncer de próstata, mesmo em seu estado mais indiferenciada, foi utilizado um cocktail de CK18, CK19 e PSA que foram todos marcados para emitir no canal de laranja. Slides também foram coradas com DAPI (azul) para identificar núcleos. anticorpos secundários contra a p65 e RelB foram marcadas para emitir nos canais vermelho e verde, respectivamente. Isto permitiu-nos distinguir coloração específica de p65 e RelB no núcleo e citoplasma das células epiteliais

Especificamente, recuperação antigênica foi primeiramente realizada com celular Condicionado 1 (VMSI; # 950-124). Usando o banco Mark XT stainer automatizado (Ventana Medical System Inc.). Os anticorpos primários contra p65 e RelB foram diluídas 1: 125 em PBS, aplicado manualmente para as lâminas, e incubou-se a 37 ° C durante 60 min. Os seguintes passos foram feitos manualmente sobre o banco sob condições de proteger as lâminas da luz. Ambos os anticorpos secundários fluorescentes foram incubadas simultaneamente, durante 45 min à temperatura ambiente (RT): rato anti-Cy5 (# A10524, Life Technologies Inc., ON, Canadá) para p65 e anti-coelho Alexa Fluor 488 (A488) (# A11008, Life Technologies Inc.) para RelB, ambos foram diluídas 1: 250 em PBS 1X. Depois de duas lavagens sucessivas com PBS 1X, lâminas TMA foram bloqueados durante 60 min com rato-on-rato reagente de bloqueio (1 gota em 250 ul de PBS, MKB-2213, Vector Laboratories, CA, EUA) e, em seguida, incubadas durante 90 min à TA com anticorpo anti-PSA (1: 100 em PBS). As lâminas TMA foram lavadas duas vezes e incubadas durante 45 min à temperatura ambiente com um marcador fluorescente Cy3 anti-cabra secundário (# 705-165-003, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., PA, EUA), diluída a 1: 250 em PBS 1X. As lâminas foram então bloqueadas, uma vez mais com rato-on-rato reagente de bloqueio durante a noite a 4 ° C. Subsequentemente, elas foram incubadas durante 90 min à temperatura ambiente com uma mistura de anti-CK18 e anti-CK19 (ambos a 1: 100 em PBS 1X) e, em seguida, 45 min a RT com secundário fluorescente anti-rato Alexa Fluor 546 (anticorpo A546) (# A10036, Life Technologies Inc.). Finalmente, as lâminas foram incubadas durante 15 min à temperatura ambiente com uma solução a 0,1% de negro de Sudão em 70% de etanol para extinguir o tecido auto-fluorescência (v /w). As lâminas foram montadas com Prolongar ouro Antifade para montagem com DAPI (P-36931, Life Technologies Inc.) para núcleos de coloração. Entre cada passo, as lâminas TMA foram lavadas duas vezes com 1X PBS. As lâminas foram armazenadas a 4 ° C e digitalizado no dia seguinte. A lâmina de controlo TMA negativo também foi feito em paralelo e incubadas com 1X PBS no lugar de todos os anticorpos primários.

A coloração quantificação

A coloração e pontuação foram realizadas cego ao ponto final do estudo. As secções de tecido foram escaneados com um microscópio Olympus e scanner de slides VS110 ligado a um software de visualização Olívia (xvViewer.exe). coloração fluorescente foi então quantificada com o software VisiomorphDP (Visiopharm, Dinamarca), que permite uma análise de imagem automatizado. A coloração por meio de marcadores /PSA CK18 /CK19 foi usada para limitar a análise às áreas epiteliais como a região de interesse # 1 (ROI # 1), enquanto DAPI serviu para avaliar a fluorescência apenas em núcleos (ROI # 2) (S1 FIG) . Núcleos com definido ROI # 1 e # 2 foram revistos manualmente para garantir a seleção adequada de células epiteliais e para remover o tecido circundante, com necrose ou inflamatórias zonas do ROI. valores contínuos de intensidade de fluorescência para ambos ROI # 1 e # 2 foram, em seguida, recolhido por o software VisiomorphDP e transferidos para Excel para definir pontuações de NF-kB epiteliais e nucleares. Os sinais positivos e negativos foram baseados em valores limiar designado (intensidade média + desvio padrão) e usadas para calcular a frequência de núcleos positivos por núcleo. A média de núcleos de tumor do mesmo paciente foi utilizado para a análise. A correlação intraclasse (ICC) entre os núcleos duplicados foi de 0,68 e 0,70 (

p Art 0,001, Spearman). Para p65 nuclear e RelB nuclear respectivamente

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas com o software SPSS 16.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, EUA). Uma comparação entre os núcleos de tumores adjacentes e combinados normais foi avaliada usando um teste não paramétrico de Wilcoxon. A correlação com as variáveis ​​clínico-patológicas foi estimado com um teste de correlação não paramétrico de Spearman. Devido à natureza inerente de imunofluorescência, dos núcleos foram considerados positivos para nuclear de NF-kB quando os valores eram, pelo menos, 5% em relação a coloração de fundo. Usamos receptor operativo characteristic (ROC) curvas de cálculo da frequência de todos os núcleos para determinar o valor limite para cada uma das subunidades NF-kB na análise de Kaplan-Meier. curvas de sobrevida BCR-livres foram plotados usando o estimador de Kaplan-Meier eo teste de log-rank foi utilizado para avaliar diferenças significativas. A proporção de p65 /RelB foi calculado a partir da frequência de p65 nuclear, em comparação com RelB nuclear. Os modelos de risco proporcional uni e multivariada (regressão de Cox) foram utilizados para estimar as taxas de risco para cada NF-kB como variável categórica, enquanto os valores em falta não foram consideradas. A análise multivariada foi realizada utilizando um modelo de risco gradual na análise univariada que era necessário para a entrada no modelo Enter. Um tamanho da amostra de n = 10K foi considerado antes de aplicar o modelo multivariado (n = número de eventos, k = número de variáveis). As co-variáveis ​​não estavam dependentes do tempo. variáveis ​​clínico-patológicas adicionais incluídos PSA pré-operatório, a pontuação de Gleason, status da margem cirúrgica, extensão extra-prostática e do envolvimento de vesícula seminal.

Ética Declaração

Uma aprovação ética para o estudo foi obtido a partir da adequada conselho de revisão (Comité d’éthique de la recherche du CHUM). Um consentimento informado foi obtido de todos os participantes.

Resultados

análise de imunofluorescência multi-coloração de p65 e RelB

O objetivo do estudo é analisar p65 e RelB em tecidos de câncer epitelial de próstata adjacentes ou malignas normais no mesmo slide TMA usando um processo quantitativa e semi-automatizado. Uma análise quantitativa fornece dados contínuos, permitindo uma gama mais ampla de detecção e determinação mais precisa de baixa e alta intensidade de coloração. A fim de facilitar este processo e alcançar especificidade máxima, optamos por implementar uma técnica de coloração multi-imunofluorescência (IF).

Primeiro, selecionamos áreas epiteliais para ser analisados. Devido à sua conhecida expressão constitutiva em células epiteliais prostáticas, citoqueratina 18 (CK18) foi escolhido para identificar células epiteliais nos espécimes [37]. No entanto, observou-se que as amostras de tecido manchadas por IHC produziram níveis de expressão de CK18 variável e que a coloração era mais fraca em tumores pouco diferenciados (dados não mostrados), reduzindo assim a precisão da identificação de células tumorais em tecidos de cancro da próstata avançado. Para superar este problema, foram selecionados CK19 e PSA como antigénios epiteliais, uma vez que eles são conhecidos por serem altamente expresso em células epiteliais prostáticas [37, 38]. verificação visual da coloração simultânea de CK18, CK19 e PSA com corantes fluorescentes de laranja (A546 para CK18 e CK19, e Cy3 para a PSA) confirmou a cobertura epitelial total por este cocktail coloração tri-antigénio, proporcionando a sensibilidade e a especificidade necessária para identificar epitelial prostática células, independentemente do nível de diferenciação dos tecidos (Fig S1).

a máscara epitelial laranja foi utilizado com a coloração nuclear DAPI para restringir quantificação de p65 e RelB epiteliais núcleos. O p65 subunidades e RelB foram marcadas com Cy5 (vermelho) e A488 corantes (verde), respectivamente (Fig1). Após este quadruple IF coloração, foi realizada uma análise quantitativa de p65 e RelB a partir de imagens digitalizadas usando o programa de análise de imagem imunofluorescência VisiomorphDP. Um valor limiar da intensidade de fluorescência foi definido para discriminar sinais fluorescentes positivas e negativas, que foi utilizado para determinar a frequência específica (%) de núcleos p65- positivos ou RelB- em cada núcleo de tecidos (incluindo núcleos duplos positivos) (Fig 1).

A. coloração epitelial com CK18, CK19 e PSA define a máscara epitelial utilizando fluorocromos laranja (A546, Cy3). B. A identificação da área epitelial (apresentada em cinza para um contraste perfeito em análises posteriores) como ROI # 1 (região de um interesse #). Identificação de núcleos (cinza cercadas por traçado vermelho) como ROI # 2 da pré-definido ROI # 1. P65 e RelB fluorescência foram posteriormente avaliados separadamente em ROI # 1 e # 2. coloração C. RelB com corante verde fluorescente (A488) e coloração p65 com corante fluorescente vermelha (Cy5). As etapas 1, 2 e 3 correspondem ao processo de análise de fluorescência seguido usando software Visiomorph DP.

Comparação de expressão p65 utilizando imuno-histoquímica e análise de imunofluorescência automatizado quantitativa

TMA, contendo paciente casam núcleos de tecidos tumorais prostáticos 200 e epitélio normal adjacente foram coradas, digitalizados e avaliados para p65 e sinal positivo RelB. Após revisão dos dados clínicos apenas 11 casos foram excluídos por não atender mais aos critérios de inclusão. A presença de p65 e RelB foi principalmente observada em epitélio, com ambos os compartimentos citoplásmicos e nucleares que exibem coloração positiva (Fig 2A). Usando o programa de pontuação automatizado, fomos capazes de identificar negativo, p65 única (Cy5) ou RelB (A488) e duplas (Cy5 /A488) núcleos corados (Fig 2A).

A. Ampliação (40X) destacando estruturas glandulares em tecidos de câncer de próstata. Mesclar: imagens sobrepostas de RelB (A488) em verde, p65 (Cy5) em vermelho e núcleos (DAPI) em azul, em normal adjacente (em cima) ou tecidos de câncer (em baixo). As setas mostram núcleos corados. B. quantificação comparativa de IHC (esquerda) e SE (à direita) coloração da p65. Os gráficos mostram a distribuição de frequência de p65 nuclear avaliada visualmente (IHC) ou automaticamente (IF). C. Frequência de p65 nuclear (à esquerda), RelB (meio) e núcleos corados duplas (direita) em tecidos adjacentes e tumorais normais. A comparação entre os núcleos normais e tumorais adjacentes foi realizado utilizando um teste de Wilcoxon.

Para avaliar o desempenho desta técnica IF, implementado para quantificação de marcadores nucleares no tecido do cancro da próstata, foram comparados resultados de quantificação a partir da análise automatizada com os resultados obtidos por meio da coloração tradicional IHC. Em ambos os casos, foi avaliada a frequência de p65 núcleos corados. Obtivemos uma correlação significativa entre os dois conjuntos de dados (r = 0,410,

p Art 0,001 Spearman), que está na mesma faixa como a correlação entre os núcleos duplicados dentro da técnica dada. O método IHC tradicional, com base na pontuação visual, era incapaz de distinguir entre coloração baixa (ou nenhuma), levando a uma superestimação de núcleos de expressão p65 negativos (Fig 2B). Usando as curvas de estimativa de Kaplan-Meier, também em relação à associação entre a frequência de sobrevivência nuclear p65 e risco de BCR, conforme anteriormente analisado em diversos outros coortes de cancro da próstata [21, 22, 25, 39]. p65 nuclear foi encontrado para ser semelhante e significativamente associada com o risco de BCR, tanto no tradicional IHC e software analisado se as amostras (log rank = 4,38,

p = 0,036

e Log rank = 4,83,

p

= 0,0028, respectivamente). Em conjunto, esses resultados validam o uso de análise automatizada por IF para a avaliação de NF-kB localização subunidade e quantificação, em tecidos de câncer de próstata.

Análise da distribuição nuclear de p65 e RelB em tecidos de câncer de próstata

Enquanto p65 localização nuclear foi aumentada em tumores de próstata em comparação com tecidos normais adjacentes (Fig 2C,

p Art 0,000, Wilcoxon test), RelB exibiu uma expressão mais elevada no tecido normal adjacente vs. tecido tumoral (p = 0,001, teste de Wilcoxon, Fig 2C). A percentagem de núcleos duplos p65 /manchada RelB não mostrou qualquer variação significativa entre tecidos normais e tumorais (Figura 2C).

núcleos tumorais, a activação da via clássica, como pode ser visto pela p65 nuclear, foi significativamente correlacionada com a activação da via alternativa, tal como representado pela localização nuclear RelB (r = 0,522, p 0,001 Spearman). Para estimar a quantidade de interacção entre as duas vias de NF-kB, foram comparadas as frequências de cada subunidade nuclear na presença ou ausência da outra subunidade. Quando RelB nuclear foi expressa, houve um aumento concomitante na frequência de localização nuclear p65 em comparação com núcleos sem RelB nuclear (27% e 19%, respectivamente). De igual modo, a presença de p65 nuclear foi associada com um aumento da localização nuclear de RelB (18% e 10%, respectivamente).

Correlação de variáveis ​​de NF-kB com parâmetros clínico-patológicos

Em seguida avaliou-se a correlação entre a p65 nuclear (que representa a activação da via clássica) ou RelB (que representa a activação da via alternativa) e os parâmetros clínico. Embora a expressão nuclear destas duas proteínas não foi significativamente correlacionada com a maioria dos parâmetros de agressividade do câncer de próstata, houve uma correlação significativa entre p65 nuclear ea participação da vesícula seminal (r = 0,121, p = 0,048, Spearman, Tabela 1) .Furthermore, houve uma tendência entre RelB nuclear e paciente pontuação de Gleason (r = -0,105, p = 0,081, Spearman, Tabela 1).

Análise da co-expressão de p65 e RelB

Para avaliar o papel de cada via de NF-kB na progressão do cancro da próstata e da diafonia de potencial entre ambas as vias, foi utilizado recorrência bioquímica (BCR) como um indicador funcional destas actividades. A frequência nuclear de p65 foi associada com BCR geral (

p = 0,028

, Log Rank = 4,843, Fig 3A). analisa uma regressão de Cox confirmou a associação entre p65 e BCR em univariada (HR = 1,93,

p

= 0,017) e modelos multivariados (HR = 3.15,

p

= 0,003), incluindo os parâmetros clínico como a pontuação de Gleason, extensão extra-prostática, invasão linfonodal, o envolvimento das vesículas seminais e margens cirúrgicas (Tabela 2). Em contraste com p65, estimativa de Kaplan-Meier e as análises de regressão de Cox univariada mostrou que o status RelB por si só não foi associado a BCR (

p

= 0,301, Fig 3B e Tabela 2). Surpreendentemente, a frequência de p65 /RelB dupla núcleos positivos não foi significativamente preditiva do BCR, mas observou-se uma tendência para um pior prognóstico (

p

= 0,078, Fig 3C).

Kaplan-Meier as curvas de sobrevida livre de recidiva bioquímica A. alta ( 20%) e baixa ( 20%) freqüência de p65 nuclear no epitélio das tecidos de câncer. B. alta ( 5%) e baixo ( 5%) frequência de RelB nuclear no epitélio de tecidos de cancro. Significância (

p

) é indicado por log rank. C. Duplo coloração epitelial nuclear de p65 e RelB. D. epiteliais e coloração nuclear de p65 e RelB. A variável negativa kB representa pacientes sem núcleos de tecidos positivos para p65 e RelB. O p65 variável sozinho ou RelB por si só representa pacientes positivos para p65 única nuclear ou RelB nuclear. O p65 variável + RelB são pacientes com presença de ambas as subunidades nucleares no mesmo núcleo. E. Análise da proporção epitelial do p65 nuclear para RelB em núcleos de tecido dentro de ambas p65 e coloração RelB. O p65 rácio /RelB representa a frequência de p65 para a frequência de RelB. O p65 RelB representa uma razão de, pelo menos, duas vezes mais do que a p65 RelB; p65-RelB representa uma relação entre 0,50 e 2 vezes, e RelB p65 representa uma proporção de pelo menos 2 vezes mais do que RelB p65

A atividade e interação entre o p65 e RelB. caminhos podem variar amplamente dentro de um único tecido que pode contém um padrão misto de expressão com células mostrando apenas p65 ou única RelB enquanto outros sendo o dobro positivo. Para determinar os papéis individuais de p65 e RelB, comparou-se os tecidos de pacientes com a activação de uma via única, representada por frequência nuclear de qualquer p65 ou RelB, e pacientes sem a actividade de NF-kB (Fig 3D). Pacientes com única atividade p65 mostrou um tempo significativamente menor de recorrência em comparação com pacientes com nenhuma atividade de NF-kB (138 meses e 98 meses, respectivamente, Log rank = 8,8,

p

= 0,002), ou comparação com os doentes com apenas RelB (

p = 0,021

, Log Rank = 5,4, Fig 3D). Isto confirma que a via clássica do NF-kB promove fortemente a progressão do cancro da próstata. Por outro lado, em nosso grupo de pacientes, atividade RelB sozinho não foi encontrado para afetar recorrência quando comparados aos pacientes sem ativação NF-kB

(p = 0,741

, Fig 3D). Curiosamente, a presença nuclear de ambos p65 e RelB no mesmo núcleo não foi significativamente associada com BCR (

p

= 0,252), sugerindo que RelB pode neutralizar o efeito biológico da p65.

Para definir o potencial de o papel de RelB sobre a actividade p65, foi investigado o impacto de cada percurso sobre o outro em proporções variáveis. A proporção de p65 nuclear e RelB foi utilizado para segregar os tecidos de pacientes com dupla marcação do p65 e RelB (Fig 3E). Três categorias foram feitas: pacientes com uma proporção mais elevada de p65 nuclear do que RelB (maior do que 2 vezes), os pacientes com uma proporção mais elevada de RelB nuclear de p65, e pacientes com números relativamente iguais de núcleos p65- e RelB-positivas (até 2 diferença vezes). Como esperado, um alto nível de p65 nuclear foi associada com um risco significativo de BCR (Log rank = 6,8,

p = 0,026

Fig 3E) em comparação com casos nível semelhante de p65 e RelB.