Abstract

proteínas de choque térmico (HSPs) são chaperones moleculares que protegem as proteínas de danificar. expressão HSP27 está associada com a transformação ea invasão câncer.

Ginkgo biloba

extracto (EGb761), o suplemento de ervas mais vendidas, tem efeitos anti-angiogénicos e induz a apoptose tumor. Os dados sobre o efeito dos EGb761 na expressão de HSP é limitada, particularmente em câncer. HSP27 expressão em tumores e tecidos normais emparelhadas do pulmão de 64 pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) foram detectados por PCR em tempo real, transferência de Western, e imuno-histoquímica. linhagens de células NSCLC (A549 /H441) foram utilizados para examinar as habilidades migratórias

in vitro

. tecido NSCLC apresentaram maior expressão HSP27 do que o tecido de pulmão normal. Análise de sobrevivência de Kaplan-Meier mostraram que pacientes com NSCLC com um rácio de expressão baixo HSP27 ( 1) teve tempo de sobrevivência significativamente mais tempo do que aqueles com um elevado rácio de expressão ( 1) (p = 0,04). EGb761 inibiram a expressão da HSP27 e capacidade migratória das células A549 /H441, que é o mesmo que o efeito de HSP27 transfecção siRNA. Além disso, o tratamento EGb761 activado as vias AKT e p38 e não afectou a expressão de PI3K, ERK, e vias JNK. HSP27 é um indicador de prognóstico pobre de NSCLC. EGb761 pode diminuir a capacidade de migração de A549 /H441 inibindo a expressão HSP27 mais provável através AKT e vias p38 MAPK activação

Citation:. Tsai JR, Liu PL, Chen YH, Chou SH, Yang MC, Cheng YJ, et ai. (2014)

Ginkgo biloba

Extrato Cell Migration Cell Lung Cancer Diminui Non-Small por downregulating Metástase-Associated fator de calor-Shock Protein 27. PLoS ONE 9 (3): e91331. doi: 10.1371 /journal.pone.0091331

editor: Prasad S. Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de outubro de 2013; Aceito: 09 de fevereiro de 2014; Publicação: 11 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Tsai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão KMU-Q098022 da Universidade de Medicina Kaohsiung e conceder NSC102-2314-B-037-067 da Conselho Nacional de Ciência, Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade por cancro em todo o mundo. Mesmo com melhorias em ambas as técnicas de diagnóstico e terapêutica, a taxa de sobrevida global em 5 anos ainda é pobre. O mau prognóstico de cancro do pulmão é causada principalmente por recidiva precoce, metástase, e fraca resposta a tratamentos, tais como cirurgia, quimioterapia, radioterapia e [1] – [2]. Falta de bons biomarcadores de prognóstico, que podem predizer a resposta ao tratamento e prognóstico, também afeta os planos de tratamento e os resultados dos pacientes.

proteínas de choque térmico (HSPs) são uma grande família de proteínas que têm funções hemostáticas essenciais em células sob fisiológica condições. De acordo com pesos moleculares, HSPs são agrupados em várias subfamílias: pequena (HSP 20-30 kDa), Hsp40, HSP60, HSP70, HSP90, e Hsp100. A principal função do HSP é para proteger as células contra danos em condições estressantes [3]. Em adição aos seus efeitos citoprotectores, as HSPs podem promover a carcinogénese pela inibição da apoptose [4] – [8] e de um reforço de resistência ao tratamento [9] – [10]. No entanto, o papel das HSP em tumores diferentes é complicada [4], [9].

HSP27 é uma proteína citoplasmática que é constitutivamente expressa em vários tecidos e doenças malignas normais. A sua expressão tem sido associada com mau prognóstico no ovário [11], de mama [9], [12], gástrica [13] – [14], fígado [15], e próstata [16], bem como osteoscarcomas [7] . No câncer de cabeça e pescoço [3] e tumor trato geniturinário [17], expressão HSP27 não tem efeito sobre o prognóstico. No entanto, o papel prognóstico da expressão HSP27 no câncer de pulmão está em debate. Zimmermann et ai. [18] relataram que o nível de HSP27 soro foi positivamente correlacionada com estágios avançados de câncer de pulmão. expressão HSP27 pode aumentar a quimiorresistência de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) e é um bom indicador de prognóstico [10], [19]. Em contraste, a HSP27 superexpressão está associada com melhor sobrevida em pacientes com NSCLC de acordo com um estudo realizado por Malusecka et al. [20]. coloração imuno-histoquímica mostrou que a expressão de HSP27 no tecido do cancro do pulmão não está correlacionada com T (tumor primário) N (gânglios linfáticos) M (metástase) e estágios [21].

Os extratos das folhas de

Ginkgo biloba

têm sido utilizados na China e os países ocidentais ao longo dos séculos, devido às suas propriedades antioxidantes [22]. Um padrão

G. biloba

extrato, EGb761 (nome comercial), contém 22% -27% de flavonóides e 5% -7% terpenóides, que são as substâncias activas mais importantes [23]. EGb761 pode eliminar os radicais livres e neutralizar balsa peroxidants induzida-íon [24]. Portanto, EGb761 é útil para a prevenção e tratamento de processos degenerativos associados com o stress oxidativo [25] – [26]

Embora a quimioterapia continua a ser o tratamento principal utilizado para o cancro do pulmão, os efeitos secundários adversos associados a este. tratamento limitar a sua utilização. medicamentos complementares, tais como ervas medicação se tornaram mais populares nas últimas décadas. Além disso, várias experiências têm relatado que EGb761 tem efeitos anti-tumorais. As propriedades anticancerígenas de EGb761 são atribuídos a suas propriedades antioxidantes, antiangiogênico, e os efeitos do gene-regulação [24]. EGb761 pode inibir a proliferação do tumor através de apoptose em câncer de cólon [27] e câncer de cavidade oral [28]. Fase II tratamento combinado que envolve 5-fluorouracilo (5-FU) e EGb761 foi testado em pacientes com cancro pancreático ou colorrectal [29] – [30], e tem mostrado resultados promissores. Neste estudo, nós investigamos a expressão HSP27 em pacientes com NSCLC e analisou a relação entre a expressão HSP27 e os resultados clínicos. Além disso, foram explorados os efeitos sobre a expressão de EGb761 HSP27. Esperamos que os resultados deste estudo irá fornecer médicos com uma nova combinação de regimes de drogas e servir como um preditor para melhorar NSCLC prognóstico.

Resultados

Os dados demográficos e expressão HSP27 em pacientes com NSCLC

no total, 64 pacientes com NSCLC foram incluídos neste estudo. Destas, 47 (73%) eram histologicamente identificado como possuindo adenocarcinoma e 17 (27%) doentes foram identificados como tendo carcinoma de células escamosas. A idade média dos pacientes foi de 61,2 ± 9,5 anos (variação, 36-78 anos). O TNM e estado expressão HSP27 em doentes com NSCLC encontram-se resumidos na Tabela 1. A relação entre a expressão HSP27 média foi de 2,05 ± 1,95. Os pacientes com NSCLC com câncer metástase e estágio avançado (estágio III-B-IV) apresentaram maior proporção de expressão HSP27 do que aqueles sem cancros metástase e estágio inicial (p = 0,03 e p = 0,009, respectivamente). De Kaplan-Meier mostrou curva de sobrevivência doentes com NSCLC com uma proporção baixa expressão de HSP27 teve significativamente melhor do tempo de sobrevivência do que aqueles com um elevado rácio de expressão (p 0,05; Fig. 1). Os rácios de risco-ajustada multivariada foram calculados utilizando regressão de Cox com as variáveis ​​adicionais de gênero (masculino contra o feminino), (anos) a idade, a metástase, tumor e comprometimento de linfonodos (Tabela 2). Ao fazê-lo, descobrimos que os pacientes com alta expressão de HSP27 tinha 2,30 vezes maior risco de mortalidade (p = 0,04) do que pacientes com baixa expressão HSP27.

expressão HSP27 em pacientes com NSCLC

expressão HSP27 em pacientes com NSCLC foram analisados ​​(Fig. 2). coloração imuno-histoquímica e análise de Western blot de tecido de cancro do pulmão mostraram maior expressão HSP27 em tecido de cancro do pulmão do que no tecido de pulmão normal (Fig. 2A-B).

(A) Pulmão amostras (cancro do pulmão e correspondente normal adjacente tecidos do pulmão) foram analisadas com anticorpos para a proteína de choque de calor 27 (HSP27) de coloração imuno-histoquímica (coloração com hematoxilina DAB e de contraste). Para controlos negativos, o anticorpo foi substituído por IgG controlo. HSP-27 foi sobre-expresso em tecido de pulmão NSCLC do que o tecido normal. (B) Análise de transferência de Western de HSP-27 de expressão em tecido NSCLC e tecido normal. Os dados representativos a partir de quatro pacientes diferentes com NSCLC são mostradas (T = tumor; N = normal). A expressão da expressão da proteína HSP27 foi significativamente aumentada no tecido NSCLC, em comparação com o tecido normal do pulmão (* P 0,05).

Efeito do EGb761 na citotoxicidade e expressão de HSP27 em linhas celulares BEAS-2B e NSCLC (A549 e H441)

Nós tratada 3 linhas celulares (BEAS-2B, A549 e H441) com diferentes concentrações de EGb761. O ensaio de MTT mostraram que EGb761 não têm efeito citotóxico sobre estas 3 linhas celulares, mesmo em concentrações mais elevadas (Fig. 3a). O ensaio de fragmentação de ADN também mostraram que EGb761 não induziu a apoptose em BEAS-2B, A549, H441 e linhas celulares em diferentes concentrações (Fig. 3B). expressão HSP27 em A549 e linhas celulares H441 diminuiu significativamente de uma maneira dependente da dose com um aumento na concentração EGb761, tal como determinado por análise de Western blot (Fig. 3C). No entanto, a expressão HSP27 em células epiteliais brônquicas normais (BEAS-2B) não se alterou quando as concentrações EGb761 foi abaixo de 500 ug /mL.

(A) EGb761 não têm efeito citotóxico óbvia em linhas celulares de cancro de pulmão ( A549 e H441) e células epiteliais brônquicas normais (BEAS-2B). ensaio (B) fragmento de DNA mostrou EGb761 não induziu BEAS-2B, A549 e apoptose celular H441. (C) A expressão /proteína HSP27 ARNm de células BEAS-2B não se alterou de forma significativa quando as concentrações de EGb761 era inferior a 500 [0-9] [A-Z] ug /ml. Além disso, a expressão /proteína HSP27 ARNm de células A549 /H441 pode estar a diminuir significativamente com o aumento da concentração EGb761 de uma forma dependente da dose. fotos representativas de três experimentos independentes. *

P Art 0,05 versus controlo. Os ensaios foram realizados em triplicado.

Efeito da EGb761 e HSP27-siRNA transfecção na expressão HSP27

Nós transfectadas o A549 /H441 células com plasmídeo HSP27-siRNA. O plasmídeo de transfecção HSP27 siRNA diminuíram significativamente a expressão de HSP27 em células A549 /H441, o que foi confirmado utilizando PCR em tempo real e Western blot (Fig. 4A-B). EGb761 também teve o mesmo efeito de HSP27 siRNA-transfecção em diminuir significativamente ARNm de HSP27 e a expressão da proteína em A549 /H441 (Fig. 4A-B). Embora tanto o tratamento HSP27-siRNA e EGb761 pode regular negativamente a expressão HSP27, isso não significa que não há uma relação efetoras entre eles. Estudos adicionais são necessários para examinar ainda mais este relacionamento.

(A) A expressão do mRNA HSP27 de células /H441 A549 foi diminuída com o tratamento EGb761 ou HSP27-siRNA transfecção 24 horas mais tarde, em comparação ao grupo controle. (B) A expressão da proteína HSP27 de células A549 /H441 também foi reduzida com o tratamento EGb761 e HSP27-siRNA transfecção 24 horas mais tarde, em comparação ao grupo controle. *

P Art 0,05 versus controlo. Os ensaios foram realizados em triplicado. NC-siRNA é o controlo negativo.

Efeitos de EGb761 e transfecção HSP27 siRNA na capacidade migratória de A549 /H441

A549 /H441 células foram utilizadas para avaliar o efeito de HSP27 na capacidade NSCLC de células migratórias

in vitro

. migração celular foi analisada utilizando o ensaio de ferida zero. Em comparação com a capacidade migratória do grupo de controle, a atividade migratória das células /H441 A549 foi inibida significativamente após HSP27-siRNA transfecção ou tratamento EGb761. (P 0,05) (Figura 5A-B.)

(A), a migração celular foi determinada pelo ensaio de monocamada de desnudação e analisadas pelo software Wimasis WimScratch. A capacidade migratória das células A549 /H441 foi inibida com EGb761 (100 ug /mL) tratamento, em comparação ao grupo controle. Silenciar a expressão HSP27 por HSP27-siRNA transfecção, a capacidade migratória também diminuiu em A549 /H441. NC-siRNA é o controlo negativo. fotos representativas de três experimentos independentes. Os dados são de três experiências independentes. *

P Art 0,05 versus controlo. Os ensaios foram realizados em triplicado.

O efeito regulador de EGb761 na expressão HSP27 através da AKT e p38 MAPK via

As vias de sinalização intracelulares, tais como MAPK e PI3K /AKT são determinantes importantes cancro da migração [31] – [33]. No entanto, as vias de sinalização intracelulares regulamentares entre EGb761 e expressão HSP27 ainda não estão claros. Analisou-se a expressão de proteínas diferentes da via de pós-tratamento de células A549 /H441 com diferentes concentrações EGb761. A expressão de p-AKT e p-P38 foi significativamente aumentada após o tratamento EGb761 em comparação com o grupo de controlo, e a expressão de PI3K, ERK e JNK não se alterou após tratamento EGb761 (Fig. 6A, D) Nós ainda tratado A549 /linha celular H441 com inibidor de AKT (API-59, 3 mM) e inibidor de p38 MAPK (SB203580, 10 mM). O efeito inibidor na expressão de EGb761 HSP27 foi bloqueado pelo inibidor de AKT ou MAPK p38 (Fig. 6B, E). Além disso, a capacidade de migração de células A549 /H441 também recuperado depois de AKT ou inibidor de p38 tratamento, mesmo na presença de EGb761 (Fig. 6C, F). Estes resultados sugerem que EGb761 regulada expressão HSP27, muito provavelmente através da AKT e p38 MAPK vias de sinalização.

(A, D) As expressões de AKT /pAKT, P38 /pP38, PI3K /pPI3K, ERK /Perk, JNK /pJNK de A549 /H441 foram analisados ​​por transferência de western após tratamento com EGb761 (100 ug /mL). A expressão de pAKT e p-p38 foram amplificados pelo tratamento EGb761 significativamente (p 0,05) (B, E). linha de células A549 /H441 foram tratados com inibidores de AKT (API-59) (3 mM), p38 MAPK (SB203580) (10 mM) durante 1 hora e EGb761 (100 ug /ml) foram tratados mais tarde. O inibidor de AKT ou inibidor de p38 podem bloquear o efeito inibidor de EGb761 na expressão da proteína HSP27. migração (C, F) celular foi determinada pelo ensaio de monocamada de desnudação e analisadas pelo software Wimasis WimScratch. Com inibidor de AKT ou inibidor de p38, a capacidade migratória celular de A549 /H441 não foi atenuada por EGb761. fotos representativas de três experimentos independentes. Os dados são de três experiências independentes. *

P Art 0,05 versus controlo. Os ensaios foram realizados em triplicado.

Discussão

HSPs são chaperones moleculares onipresentes presentes em todas as células vivas. Eles protegem as células dos danos estresse ambiental [34]. A pequena HSP27 desempenha um papel na transdução de sinal, a regulação do crescimento, o desenvolvimento, diferenciação, e tumorigénese [35]. aumento dos níveis de HSP27 têm sido observados em várias doenças malignas como o câncer de mama [36], o cancro do cólon [37], o câncer de próstata [16], e cancro do pulmão [10], [21]. No nosso estudo, nós analisamos a expressão de HSPs, incluindo a HSP10, HSP27, HSP30, HSP60, HSP70, HSP90 e em amostras de tecido de NSCLC (dados não mostrados). Apenas HSP27 foi encontrado para ser sobre-expresso em tecido NSCLC. Coordenação com parâmetros clínicos do paciente, a sobre-expressão de HSP27 parece aumentar o potencial metastático de NSCLC e é um mau prognóstico preditor. Bloqueio de expressão HSP27 por EGb761 diminuiu a capacidade migratória de linhas celulares de NSCLC.

HSP27 tem atraído muita atenção nas últimas décadas devido ao seu papel na carcinogênese tumor, prognósticos, preditiva e implicações de tratamento [4]. No câncer de esôfago, expressão HSP27 diminui durante a carcinogênese para adenocarcinomas, mas aumenta durante a carcinogênese de carcinomas escamosos [38]. HSP27 expressão está correlacionada com o grau de diferenciação na pele [39], do endométrio [40], e cancros uterinos [41]. HSP27 superexpressão também induz chemoresistance no câncer de próstata [42] e câncer de esôfago [43], mas melhor resposta ao tratamento em câncer de cabeça e pescoço [44]. Em resumo, o papel de HSP27 é variável e depende de diferentes tipos de tumores.

Em nosso estudo, HSP27 foi um indicador de mau prognóstico em pacientes com NSCLC após o ajuste para outros fatores. relação de maior expressão de HSP27 foi observada em pacientes com NSCLC com um câncer avançado, que foi mesmo que o relatado em um estudo realizado por Zimmermann et al. [18]. nível HSP27 Serum é um biomarcador útil para discriminar os fumantes saudáveis ​​e pacientes com câncer em estágio inicial e avançado NSCLC [18]. No entanto, um relatório por Malusecka et ai. mostrou que a expressão de HSP27 pode ser um factor de prognóstico favorável em NSCLC [20]. análise de subgrupo mostraram que HSP27 manteve o seu significado prognóstico em carcinoma de células escamosas, mas não no adenocarcinoma. Dois terços dos pacientes com carcinoma espinocelular no estudo Malusecka, mas a porcentagem de carcinoma de células escamosas foi de apenas 27% em nosso estudo. Nossa análise de subgrupo mostraram não haver diferença de prognóstico entre os pacientes com adenocarcinoma e carcinoma de células escamosas. amostras de pequenas dimensões e heterogeneidade são as nossas limitações. Além disso, a capacidade migratória de A549 e H441

In vitro

diminuiu significativamente após o silenciamento expressão HSP27, que foi consistente com a observação clínica de que a expressão de HSP27 pode aumentar o potencial metastático. Embora HSP27 tinha sido identificada como uma proteína associada a metástases em NSCLC [45] – [46], a associação exacta entre HSP27 e o mecanismo metastático requer uma investigação mais aprofundada

drogas de quimioterapia geralmente afectam ambas as células tumorais patológicas e normais. células e causar sérias complicações e toxicidade. Cisplatina, um agente antineoplásico eficaz, é o principal elemento na quimioterapia do cancro do pulmão. A perda auditiva neurossensorial e nefrotoxicidade são os principais efeitos adversos da cisplatina, que podem envolver a formação excessiva de radicais livres [24]. Através da eliminação e prevenção da formação de radicais livres, EGb761 pode induzir efeitos protectores contra a toxicidade induzida pela cisplatina. Numa experiência em ratos, EGb761 diminuiu com sucesso a toxicidade associada à cisplatina sem atenuar a sua actividade anti-tumor [47]. A falta de responsividade ou sobrevivência de células estaminais após o tratamento do cancro podem ser responsáveis ​​pela resistência e recorrência de cancro do pulmão para a terapia moderna [48]. activação HSP27 tem sido observada em células-tronco quimiorresistentes cancro do pulmão de células-like [10]. Nosso estudo mostrou que EGb761 inibida expressão HSP27 em células NSCLC. Portanto, EGb761 pode ter grande potencial na terapia do cancro do pulmão por causa do seu efeito inibitório na expressão da HSP27.

resposta de choque de calor celular geralmente desenvolve-se rapidamente, o que está relacionado com a activação de vias de transdução de sinalização importantes que envolvem mitogénio-activada proteína (MAP) quinase, extracelulares quinases reguladas por sinais (ERKs), c-Jun N-terminal kinase (JNK), e p38 [49]. Estas cascatas de sinalização desempenham um papel central na regulação e na determinação do destino da célula, tais como o crescimento, a diferenciação ou apoptose em numerosos fisiológico, bem como condições de stress [50]. AKT /vias de transdução de sinal dependente de PI3K são sinais de sobrevivência celular estimulada por factores de crescimento, citocinas e oncoproteínas. Hiperactiva Akt /PI3K pode reduzir a apoptose de células de tumor e aumentar a proliferação de [51]. No entanto, a relação entre HSP27 de regulamentação, PI3K /AKT e vias da MAP-cinase é complexo. Por exemplo, a via de p38MAPK-MAPKAPK2-HSP27 vai ser activado por quimioterapia ciplastin agente gencitabina mais em células estaminais de cancro do pulmão [10]. Em contraste, a HSP27 induz a resistência à cisplatina pressionando activação p38 e melhorar a activação AKT em células de câncer de pulmão [52]. Esta diferença pode ser devido a diferentes tipos de células e o desenho do estudo. Guo et ai. mostraram que uma activação precoce, transiente de JNK ou p38 MAPK (ou ambos) é geralmente associada com a sobrevivência das células ou a diferenciação, enquanto que uma activação atrasada, sustentada destas quinases é geralmente associada com apoptose [53]. No cancro colorectal, HSP27 superexpressão é KRAS mutação dependentes [54], mas ambos A549 e H441 são KRAS linhas de células de mutação. A relação da mutação KRAS e expressão HSP27 no cancro do pulmão precisa de uma investigação mais aprofundada. No nosso relatório, EGb761 atenuada expressão HSP27 em /linhagens de células H441 A549 ativando p38 MAPK e vias AKT mas não via ERK ou JNK. Uma vez que a combinação de AKT e p38 tratamento inibidor pode diminuir a viabilidade celular, os efeitos sinérgicos do tratamento de combinação sobre a expressão de HSP27 pode precisar de mais análise. Além disso, porque o estado de activação (fosforilação) é instável e desfosforilação ocorreu rapidamente sob condições fisiológicas, é difícil observar os verdadeiros resultados da AKT e p38 activação

in vivo

no grupo de pacientes baixa expressão HSP27.

em conclusão, HSP27 é um factor de prognóstico pobre de NSCLC, e EGb761 tem um grande potencial para ser utilizado como complemento de uma terapia para o tratamento de NSCLC, devido ao seu efeito inibidor na expressão de HSP27.

Materiais e métodos

coleta de amostra de tumor

NSCLC e correspondentes tecidos normais foram coletados de 64 pacientes submetidos à ressecção cirúrgica na Divisão de Cirurgia Torácica do Departamento de Cirurgia, Kaohsiung Medical University Hospital, de 2004 a 2010 . as amostras de tecidos foram imediatamente colocadas em nitrogênio líquido para envio para o laboratório, e depois armazenados em freezers -80 ° C até o isolamento de RNA e extração de proteínas foram realizadas. procedimentos de estadiamento completo, incluindo radiografia de tórax, broncoscopia, cérebro e tomografia computadorizada de tórax, ultra-sonografia e cintilografia óssea foram realizados para determinar com precisão as características da TNM em pacientes com NSCLC de acordo com o sistema de estadiamento TNM Internacional para câncer de pulmão [55]. Todos os pacientes foram acompanhados até março de 2011, e detalhes de seus dados demográficos e de sobrevivência foram atualizados.

Ética declaração

O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Ética de Pesquisa (KMUH-IRB 990.358) do Hospital Médico Universitário Kaohsiung, Kaohsiung, Taiwan. Os participantes fornecer seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo.

extração de RNA e reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR)

O RNA total foi isolado a partir de tecidos de tumor de pulmão congeladas de pacientes com NSCLC e correspondentes tecidos pulmonares normais adjacentes. ARN a partir de tecido pulmonar normal, tecido de tumor do pulmão, e cancro do pulmão de células foi analisada utilizando PCR em tempo real. O ARN total foi isolado utilizando um kit RNeasy Mini e um conjunto de ADNase isenta de ARNase (Qiagen, Valencia, CA, EUA). O ARN total (2 ug) foi transcritos de modo inverso utilizando SuperScript ™ e First-Strand Synthesis System para RT-PCR Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Uma diluição de 1:05 do cDNA resultante foi utilizado como padrão, e uma diluição de 1:10 do modelo de cDNA resultante foi utilizado como padrão para quantificar o teor relativo de ARNm utilizando PCR em tempo real (SYBR LightCycler FastStart DNA mestre verde I, Roche, Mannheim, Alemanha). Os seguintes iniciadores de PCR em tempo real foram projetados usando o software Primer Express (RealQuant, Roche, Mannheim, Alemanha), utilizando sequências publicadas: humano HSP27 (GenBank: número de acesso: AB020027.1) iniciador com sentido: 5′-GTC CCA CGA GAT CAC CAT-3 ‘, iniciador humano HSP27 anti-sentido: 5′-GGT GGT TGC TTT GAA CTT TAT T-3′, iniciador de sentido directo da GAPDH humana: 5’-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3 ‘, iniciador anti-sentido e de GAPDH: 5’-GCC CAA TAC GAC CAA ATC C-3 ‘. Os dados de fluorescência foram obtidas no final da extensão. Melt análise foi realizada para todos os produtos para determinar a especificidade da amplificação. Além disso, os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese em géis de 1% de agarose para confirmar se os tamanhos das bandas correctos estavam presentes. A expressão relativa foi calculada como a razão entre a expressão no tumor em comparação com a expressão no tecido adjacente normal (elevada expressão: lesão tumoral /tecido normal 1; baixa expressão: tumoral lesão /tecido normal 1) [56] – [57]

imuno coloração

amostras dos tumores foram dissecados a partir de tecido de pulmão humano, fixadas em solução de formalina tamponada a 4% durante a noite, embebidos em parafina, seccionados e em espessuras de 5 mícrons.. As secções de parafina foram desparafinadas com xileno e coradas com anticorpo anti-humano-HSP27 (Santa Cruz, Dallas, TX, EUA). Após lavagem em PBS, as secções foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano durante 1 h à temperatura ambiente. Para reacções de cor, diaminobenzidina (DAB) foi usado e contra-coradas com hematoxilina. Para controlos negativos, o anticorpo foi substituído por IgG controlo.

análise Western blot

As células foram lisadas com tampão de lise [NaCl a 0,5 M, Tris 50 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de SDS, 0,5% de Triton X-100, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), pH 7,4], durante 30 min a 4 ° C, e os lisados ​​celulares foram centrifugados a 4000

g

durante 30 min a 4 ° C. As concentrações de proteína nos sobrenadantes foram medidos usando um kit de determinação de proteínas BioRad (BioRad, Hercules, CA, EUA). Os sobrenadantes foram sujeitos a 12% de SDS-PAGE e depois transferida para difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (NEN) durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram depois tratadas com PBS contendo 0,05% de Tween 20 e 2% de leite desnatado durante 1 hora à temperatura ambiente e incubadas separadamente com rato anti-humano HSP27, AKT /pAKT, P38 /pP38, PI3K /pPI3K, ERK /Perk, JNK /pJNK ou α-tubulina (Abcam, Cambridge, MA, EUA) durante 1 h à temperatura ambiente como controlo interno. Após a lavagem, as membranas foram incubadas durante com rábano antigoat coelho conjugado com peroxidase de IgG de ratinho ou à temperatura ambiente. A imunodetecção foi realizada com o reagente de quimioluminescência acrescida e exposição a NEN Biomax MR de filme (Kodak, Rochester, NY, EUA).

Cultura de células NSCLC

adenocarcinoma pulmonar A549 /H441 (ATCC CCL- 185 /ATCC HTB-174) foram cultivadas em frascos em meio de crescimento F12K suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades /mL de penicilina, e 100 pg /mL de estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2. células BEAS-2B (ATCC CRL- 9609), que são células epiteliais brônquicas normais, foram utilizados como controle.

HSP27 silenciamento no A549 /H441 células

pequeno RNA de interferência (siRNA), um 21-nucleótido homóloga sequência de ARN de cadeia dupla específico para o gene alvo, foi utilizada para silenciar a expressão HSP27. HSP27 siRNA humana iniciador com sentido: 5′-GCG UGU CCC UGG agosto UCA ATT-3 ‘e iniciador anti-sentido: 5′-UUG ACA UCC AGG GAC ACG CGC-3’. SiRNA por HSP27 e controlo negativo (CN-siARN) foram concebidos e sintetizados utilizando um software de computador de Ambion (Austin, TX, EUA) e kit de construção Silencer ™ siARN da Ambion, de acordo com as instruções do fabricante. Inibição de ARNm de HSP27 e expressão de proteína foi avaliada utilizando PCR em tempo real e análise de imunotransferência após transfecção de A549 /H441 com HSP27 siRNA. Resumidamente, as células foram cultivadas em 6 poços e transientemente transfectadas com 20 nM de ARNsi, utilizando 8 mL siPORT amina (Ambion, Austin, TX, EUA) num volume total de transfecção de 0,5 ml do meio. Após incubação a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 h, 1,5 mL de meio de crescimento normal, foi adicionada

, e as células foram incubadas durante 48 h.

ensaio MTT para a viabilidade celular

O brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT, Sigma, Louis, MO, EUA) ensaio foi utilizado para medir a viabilidade das células [58]. O princípio deste ensaio é que a desidrogenase mitocondrial em células viáveis ​​reduzem o MTT a um formazano azul. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de 96 poços e incubadas com várias concentrações de EGb761. Após lavagem das células duas vezes com PBS, 100 ul do meio contendo MTT (0,5 mg /mL) foi adicionada a cada poço, e as células foram incubadas a 37 ° C durante um adicional de 4 h. O meio foi então cuidadosamente removido de modo a não perturbar os cristais de formazano formados. Em seguida 100 uL de DMSO, que solubiliza os cristais de formazano, foi adicionado a cada poço, e a absorvência do formazano azul solubilizado foi lida a 540 nm usando um leitor de microplacas (Multiskan Ex, ThermoLabsystems), com DMSO como branco. A redução da densidade óptica por as drogas foi utilizada como a medição da viabilidade celular, normalizados para células incubadas em meio de controlo, que foram considerados 100% viáveis.

A quantificação da fragmentação de ADN

O ADN celular fragmentação ensaios de ELISA foram realizados utilizando um kit de acordo com o protocolo do fabricante (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha). As células foram incubadas durante 12 h a 37 ° C, com um não-radioactivos analógico timidina 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), a qual pode ser incorporada no ADN genómico. Subsequentemente, as células foram incubadas com ou sem EGb761 durante 6 h. As células foram então lisadas, transferido para uma placa de microtitulação revestidos com um anticorpo anti-ADN e incubou-se durante 90 min à temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 vezes e aquecida durante 5 minutos num forno de microondas. solução do conjugado anti-BrdU-peroxidase foi adicionada a cada poço, e a placa foi incubada durante 90 min à temperatura ambiente. Depois a placa foi lavada 3 vezes, adicionou-se solução de substrato, e a placa foi incubada no escuro num agitador até que o desenvolvimento de cor foi suficiente. A reacção foi então parada pela adição de 25 uL de 0,56 M H

2SO

4. Um leitor de microplacas (BioRad, Hercules, CA, EUA) foi utilizado para medir a absorvância a 450 e 655 nm para cada poço.

In vitro

migração analisa

O migratória capacidade das células foram ensaiadas num ensaio de desnudação monocamada, tal como descrito anteriormente [59]. As células confluentes foram feridos por raspagem com uma ponta de pipeta 100 uL-, que desnudada uma tira da monocamada que 300 um de diâmetro. As culturas foram lavadas duas vezes com PBS; em seguida, um meio suplementado com 5% FBS foi adicionado, e foi observada a taxa de encerramento de feridas após 24 h. As células que migraram para a área desnudada foram fotografados, e as áreas foram analisados ​​utilizando o software Wimasis WimScratch. Wimasis WimScratch é uma ferramenta de imagens baseado na Web nova geração para a análise de migração celular. técnicas de detecção de borda pode reconhecer facilmente a ponta e zona da abertura. Os usuários podem fazer upload de imagens e análise inicia-se automaticamente.

inibidores EGb761 e via

A inibidores de AKT e MAPK p38, API-59 (Santa Cruz, Dallas, TX, EUA) e SB203580 ( Selleckchem, Radnor, PA, EUA), respectivamente, foram usados ​​em nosso estudo. Os EGb761 usados ​​em nosso estudo foram perseguidos do Dr. Willmar Schwabe GmbH Co., Karlsruhe, (Alemanha).

Análise estatística

As diferenças estatísticas em relação expressão HSP27 e parâmetros clínicos foram testados usando

t

-teste ou one-way análise do aluno teste de variância (ANOVA). As curvas de sobrevida foram desenhados utilizando o método de Kaplan-Meier. Os resultados são expressos como média ± SEM.