Abstract

Fundo

Neurorregulina-1 (NRG1) é um gene da esquizofrenia susceptibilidade putativos envolvidos extensivamente no desenvolvimento do sistema nervoso central, bem como a invasão de câncer e metástase. Usando um modelo de célula B de linfoblastos, que anteriormente demonstrou deficiência na migração NRG1α mediada em células derivadas de pacientes com esquizofrenia assim como os efeitos de alelos de risco em NRG1 e catecol-O-metiltransferase (COMT), um segundo gene implicado tanto na susceptibilidade esquizofrenia e no câncer.

Metodologia /Principais achados

Aqui, nós examinamos a adesão celular, um processo componente essencial da motilidade celular, utilizando um ensaio de adesão celular mediada por integrina com base em uma interação entre ICAM 1 e o heterodímero da integrina CD11a /CD18, expresso em linfoblastos. No nosso ensaio, induz NRG1α linfoblastos assumir diferentes níveis de adesão caracterizado por flutuações dependentes do tempo na firmeza da fixação. O alcance máximo de variação na adesão de mais de sessenta minutos se correlaciona fortemente com a migração induzida por NRG1α (r

2 = 0,61). variação de adesão induzida por NRG1α é bloqueado por erbB2, PI3K, e inibidores da Akt, mas não pelo PLC, ROCK, MLCK, ou inibidores de MEK, implicando o /PI3K /via de sinalização erb B2 em Akt1, a adesão celular mediada por integrina estimulada por NRG1. Em linhas de células a partir de 20 doentes com esquizofrenia e a 20 controlos normais, as células de pacientes mostram uma deficiência significativa na gama de adesão induzida por NRG1α (p = 0,0002). Em contraste, a resposta de células derivadas de pacientes com acetato de forbol miristato está intacto. O genótipo COMT Val108 /158Met demonstra uma forte tendência no sentido de prever o alcance da resposta adesão NRG1α induzida por com homozigotos risco tendo diminuído variação na adesão celular, mesmo em indivíduos normais (p = 0,063).

Conclusão /Significado

Nossas descobertas sugerem que um mecanismo da associação genética NRG1 com esquizofrenia pode envolver a biologia molecular da adesão celular

Citation:. Kanakry CG, Li Z, Nakai Y, Sei Y, Weinberger DR ( 2007) Neurorregulina-1 regula adesão celular através de um Phosphoinositide-3 Kinase /Caminho ErbB2 /Akt-dependente: implicações potenciais para a esquizofrenia e Câncer. PLoS ONE 2 (12): e1369. doi: 10.1371 /journal.pone.0001369

Editor do Academic: Schahram Akbarian, University of Massachusetts Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de novembro de 2007; Aceito: 05 de dezembro de 2007; Publicação: 26 de dezembro de 2007

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita

financiamento:. o Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Saúde Mental, NIH, desde que a maior parte do financiamento, bem como o laboratório espaço no qual foram realizados nestas experiências. O Instituto Médico-NIH Scholars Program Research Howard Hughes também forneceu financiamento que apoiaram este projecto de investigação. Nem patrocinador estava envolvido no projeto ou na realização da própria investigação, a recolha, análise ou interpretação dos dados, ou na preparação ou revisão do manuscrito, resultando

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores declararam que nenhum existem interesses conflitantes.

Introdução

a visão atual predominante da patogênese da esquizofrenia postula que é um distúrbio neurológico relacionada a fatores genéticos que têm impacto sobre o desenvolvimento do cérebro e plasticidade. [1] Entre os cada vez maior número de genes esquizofrenia susceptibilidade putativos é Neurorregulina-1 (NRG1), que foi encontrado pela primeira vez para ser associada com risco aumentado de esquizofrenia numa população da Islândia [2] e, subsequentemente, confirmado em vários estudos de outras populações. [3] existe NRG1 em várias isoformas, todas as quais contêm um factor de crescimento epidérmico (EGF) -like domínio que pode sinalizar através de erbB2, erbB3, erbB4, ou os receptores. [4] a maioria das isoformas existir NRG1 como proteínas transmembranares que são acreditados para ser proteoliticamente clivada, permitindo a domínio extracelular, do tipo EGF para se ligar a receptores erbB. [5] NRG1 está envolvido em muitas funções do neurodesenvolvimento chave, incluindo a migração neuronal, a modulação sináptica, desenvolvimento e de oligodendrócitos. [4], [6] Uma vez que estas funções e os outros são regulados por NRG1 pelo menos teoricamente relacionadas com a origem do neurodesenvolvimento putativa de esquizofrenia, NRG1 é um gene de susceptibilidade a esquizofrenia biologicamente plausível. No entanto, o mecanismo biológico específico da sua associação genética com a esquizofrenia e o seu papel na patogénese da doença é desconhecido.

O uso de linfoblastos B como um modelo de célula para estudar os mecanismos moleculares básicos e associações genéticas de um número de doenças humanas , incluindo distúrbios neuropsiquiátricos, está se tornando cada vez mais generalizada. [7], [8], [9] a aplicação deste modelo para explorar a migração celular parece particularmente apropriado, dado que as células neuronais e imunológico compartilham muitas características moleculares e celulares comuns importantes para a motilidade celular . [10], [11], [12] Assim, a caracterização molecular e associações genéticas da motilidade celular em células de origem hematopoiética pode fornecer informações sobre os processos celulares neuronais. Em trabalho recente, utilizando um modelo de célula B linfoblastos, mostramos que linfoblastos B expressam receptores ErbB2 e ErbB3, e que os sinais NRG1α através destes receptores através dos Akt e PLC vias /PI3K, a fim de promover a migração quimiotáctica. [7] Também descobrimos que variação genética em ambos NRG1 e COMT anteriormente associados com esquizofrenia previu a resposta migratória destas células a NRG1, sugerindo um potencial mecanismo celular para a associação genética para a doença. No presente estudo, nós examinamos a adesão celular, um processo componente fundamental envolvido na motilidade celular. Para isso, foi desenvolvido um ensaio de adesão celular mediada por integrinas em placas de 96 poços com base em uma interacção entre recombinante de ICAM-1 humana e a sua CD11a /CD18, receptor de heterodímero da integrina, expresso em linfoblastos.

As integrinas são um a classe de receptores da superfície celular que desempenham papéis importantes numa grande variedade de processos celulares e fisiológicas, que vão desde o desenvolvimento embrionário de imunidade a metástase de tumores. [13], [14] As integrinas formam, receptores transmembranares heterodiméricas que consistem de uma subunidade α não- covalentemente associada com uma subunidade β. Integrinas medeiam a sinalização bidirecional, ajudando a integrar os processos intracelulares com o ambiente extracelular. A ligação de integrinas para proteínas da matriz extracelular ou counterreceptors presentes em outras células activa chamado sinalização “outside-in” que promove uma variedade de processos celulares, incluindo a regulação da sobrevivência celular, a proliferação e a diferenciação. [15] Ao mesmo tempo, quimiocina e outra estimulação química de células são capazes de modular a aderência das integrinas, promovendo assim chamada sinalização “inside-out”. [16], [17], [18], [19]

as integrinas, também têm sido implicados como jogar funções-chave na mediação da migração neuronal [20] e a formação de sinapses e manutenção. Eles desempenham papéis críticos em uma série de processos de desenvolvimento neurológico, incluindo a adesão celular precursor neuronal, migração em cadeia, diferenciação e proliferação; [21], [22] regulação das interações gliais neurais-radial e promoção da organização adequada laminar cortical através de interações com Reelin ; [23] a migração correta dos neuroblastos tectal óptica em lâminas específica; [24] o desenvolvimento adequado da crista neural; [25] neural cone de crescimento modulação filopoidais; [26] a sobrevivência de oligodendrócitos; [27] e direção do synaptogenesis neuromuscular e migração de células de Schwann para a periferia. [28] Entre as suas outras funções em biologia sinapse são a promoção da maturação sináptica, [29] mediação da plasticidade sináptica, [30], [31] e o envolvimento crucial na indução da LTP [32] e estabilização [33], [34], bem como a memória espacial. [32]

Porque NRG1 e integrinas convergem em vários processos de desenvolvimento relacionados com a migração neuronal e sinapse biologia e dadas as nossas descobertas anteriores relacionadas com a migração celular mediada por NRG1, exploramos os efeitos de activação NRG1 de linfoblastos sobre a adesão celular mediada por integrina. Relatamos NRG1α que induz a diferentes níveis de adesão celular, caracterizado por flutuações dependentes do tempo na firmeza da fixação tal como medido com um ensaio de adesão romance. O alcance máximo desta variação na adesão ao longo do tempo (daqui em diante abreviado como MRVA) correlaciona-se altamente com a eficácia de migração celular induzida por NRG1α, indicando que a medida MRVA tem relevância biológica, pelo menos para estas células. Induzida NRG1α MRVA é dependente de erbB2 /PI3K sinalização /Akt. Além disso, o MRVA induzida por NRG1α é significativamente menor em linfoblastos B derivados de pacientes com esquizofrenia em comparação com os derivados de controlos normais. Por último, um único polimorfismo de nucleótidos dentro da COMT, um gene implicado na susceptibilidade tanto a esquizofrenia e cancro metastático, demonstra uma forte tendência para predizer o MRVA de uma determinada linha celular, mesmo em indivíduos normais. Em geral, os nossos estudos mostram que a sinalização NRG1 activa máquinas aderência num processo que é prejudicada em células derivadas de pacientes com esquizofrenia. Se estes achados em células do sistema imunológico são conservadas nos processos de células neuronais, eles argumentam que um mecanismo da associação genética NRG1 com a esquizofrenia envolve a biologia molecular da adesão celular.

Resultados

linfoblastos expressar integrinas homogeneamente

linfócitos predominantemente expressar o heterodímero CD11a /CD18 integrina (α

L /β

2, que também é conhecida como função de leucócitos-antigénio-1 associado ou LFA-1). [35] Utilizou-se citometria de fluxo para testar a expressão da integrina da linha de base e para comparar a expressão entre as linhas de células derivadas de pacientes com esquizofrenia em comparação com controlos normais. Todas as linhas de células testadas expressa CD11a (fluorescência corrigida média, 14,018 ± 0,968) e CD18 (14,336 ± 1,019), com exceção de uma linha de células derivadas do paciente. Esta linha celular foi excluído de todo mais testes e comparações estatísticas. Não houve diferença significativa entre as linhas celulares derivadas de pacientes ou controlos na expressão de qualquer das CD11a (pacientes (n = 23), 13.479 ± 1.364; controlos (n = 35), 14.790 ± 1.303; p = 0,5046) ou CD18 (pacientes (n = 23), 14.215 ± 1.633; controlos (n = 35), 14,832 ± 1.291; p = 0,7667). Correlação de CD11a com expressão de CD18 (de regressão linear (n = 58), r = 0,806; r de Fisher para Z, P 0,0001) foi consistente com a conclusão de que CD11a e CD18 foram principalmente formação de heterodímeros com o outro. Assim, estes dados demonstram que as nossas linhas de células linfoblásticas expressam as integrinas CD11a /CD18 e que a expressão basal diferencial dessas integrinas não é um fator importante para as diferenças de migração [7] ou de adesão (veja abaixo) de linfoblastos derivados do paciente.

NRG1α induz temporariamente variando de adesão celular

As experiências iniciais com o nosso ensaio de adesão sugeriu que a adesão tinha uma dependência do tempo. Assim, as experiências de curso de tempo foram realizadas em que linfoblastos foram expostas a NRG1α ou acetato de forbol miristato (PMA) em placas revestidas com ICAM, quer para 15, 30, 45, ou 60 minutos, e depois as placas foram lavadas para remover as células que não estavam firmemente aderente. PMA foi utilizada como um controlo positivo, uma vez que promove a fixação das células através da activação de PKC directamente. Para cada linha celular, as células foram submetidas durante o mesmo tempo de exposição para as placas revestidas com ICAM na ausência de NRG1α ou PMA. A variação nos dados de ligação NRG1 cru (Figura S1) e na proporção NRG /veículo ao longo do tempo (Figura 1, Figura S1, Figura S2, e a Figura S3) indicou que as células NRG1α-estimulado como uma população foram oscilando entre estados de relativamente mais firme e apego mais fraca em comparação com adesão de controle de linha de base. A fim de quantificar a variação observada na adesão celular, que definiu a gama máxima induzida por NRG1 de variação de aderência (MRVA) como a razão máxima NRG /veículo menos a razão /veículo mínimo NRG dos quatro pontos de tempo (Figura 1).

em resposta à estimulação NRG1α ao longo do tempo, as células de uma dada linha celular como uma população oscilar entre os estados de descolamento relativas e os estados de ligação relativa. A fim de testar a fiabilidade destes padrões, dez linhas celulares em dois dias separados foram testados usando o nosso ensaio de adesão. Dois exemplos representativos são mostrados. Embora o calendário de altos e baixos variaram entre as execuções, o alcance máximo de variação de adesão (MRVA) foi notavelmente consistente (p = 0,016). Cálculo do MRVA para cada execução de cada linha de células é mostrado.

O alcance máximo de variação de adesão (MRVA) aparece característica de cada linha de células

Para fazer face a fiabilidade dos estes padrões, foram realizados ensaios de adesão repetido em dez linhas celulares em dois dias separados. Estas dez linhas foram seleccionados para proporcionar um espectro de valores Mrva em ambas as linhas celulares de doentes e de controlo, incluindo alta, média e baixos níveis de variação. padrões claros de diferentes graus de adesão ao longo do tempo foram vistas em ambos os dias, e embora o padrão real variou entre as execuções de repetição em termos de horários específicos que definiram a gama de adesão, a gama de respostas de adesão observados (ou seja, a medida MRVA) foi altamente reprodutível (Spearman (n = 10), ró = 0,806, p = 0,016) (Figura 1).

O MRVA da adesão celular induzida NRG1α prevê-induzida NRG1α migração

O MRVA correlacionada positivamente e altamente significativa com o grau de migração quimiotáctica em resposta a NRG1α (regressão linear (n = 37), R

2 = 0,6065; r de Fisher para Z, P 0,0001) (Figura 2), usando dados de migração nós relataram anteriormente nas mesmas linhas celulares. [7] (três linhas celulares que foram utilizados para os estudos de adesão faltava dados de migração e por isso não foram incluídos nesta comparação.) Estes dados sugerem que a medida MRVA tem significado biológico mais amplo, pelo menos para essas células. Embora a correlação não indica causalidade, um estado adesivo variando é um mecanismo biologicamente plausível e necessária para a migração celular.

Dados de adesão foram comparados com os dados disponíveis reuniu um ano antes da migração induzida por NRG1α dessas mesmas linhas celulares.

Definir as medidas de resultados

Dada a confiabilidade do MRVA dentro de uma linha celular e sua importância biológica aparente, o MRVA foi estabelecido neste momento, como a medição dependente primária para todas as futuras experimentos aderência. Além disso, várias outras medidas dependentes foram definidos e usadas para estudar os efeitos de inibidores da via de sinalização. Duas outras medidas de intervalo foram definidas como se segue: 1) o ICAM-única MRVA, a qual é calculada a partir das células de controlo sozinho (mínimo máximo menos um dos quatro pontos de tempo) e representa os efeitos de sinalização endógena e /ou a presença da própria ICAM nas modulando variando de adesão ao longo do tempo, e 2) PMA /veículo MRVA, que é calculada de forma análoga à NRG /veículo MRVA e representa a variação na adesão celular ao longo do tempo em resposta à estimulação de PMA. Uma medida de fixação de linha de base líquida foi também definida como se segue: significa ICAM efeito, que é a média dos quatro valores de fluorescência ICAM e representa a “adesividade” do estado geral ou a adesão relativa das células de controlo na linha de base. Em situações em que um inibidor exercidos efeitos tanto na linha de base e a adesão induzida por químicos, a média NRG e os valores médios da fluorescência PMA foram analisados ​​para distinguir efeitos no numerador versus o denominador da média NRG /veículo ou significa rácios PMA /veículo.

NRG1α medeia os seus efeitos sobre a adesão celular através de erbB2 sinalização

Nós já demonstraram que a migração NRG1α mediada por linfoblastos era dependente de sinalização erbB2; Assim, testou-se a estimulação erbB2 estava envolvido no mecanismo de adesão celular induzida por tratamento de células NRG1α com o AG825 inibidor selectivo erbB2. AG825 exibiram um efeito dependente da dose significativo na amortecendo o MRVA de adesão induzida por NRG1α (ANOVA, F (3,4) = 23,358, p 0,0001). (Figuras 3)

A administração de veículo de DMSO em AG825 (n = 5) causou uma diminuição robusta, dependente da dose no MRVA induzida por NRG1α. Em comparação com o controlo de veículo, ** representa p 0,01 e **** representa p 0,0001. Em comparação com a dose baixa, + representa p 0,05 e +++ representa p . 0,001

sinalização de PI3K é essencial para a mediação NRG1α-induzido variando adesão celular

Para abordar o papel de PI3K no efeito de adesão induzida por NRG1α, estudou-se o inibidor de PI3K wortmanina irreversível. As doses utilizadas foram todos bem abaixo das concentrações que, em wortmanina reage de forma cruzada com MAPK, a miosina-quinase de cadeia leve (MLCK), ou fosfoinositide-4 sinalização da cinase, num esforço para atingir especificamente a sinalização de PI3K. A wortmanina exibiu um,, o efeito de amortecimento dependente da dose significativo na MRVA NRG /veículo (ANOVA, F (3,4) = 17,208, p 0,0001). (Figura 4) sem efeitos na linha de base ou de adesão induzida por PMA

Wortmannin em DMSO veículo (n = 5) apresentaram, um efeito amortecedor forte, dependente da dose sobre a medida /MRVA veículo NRG. Em comparação com o controlo de veículo, * representa p 0,05, ** representa p 0,01, e **** representa p 0,0001. Em comparação com a dose baixa, + representa p 0,05 e ++ representa p . 0,01

Akt imita inibição inibição PI3K e amortece a induzida NRG1α adesão efeito

A Akt Inhibitor X inibe selectivamente a fosforilação de Akt com efeitos mínimos sobre a PI3K, PDK1, ou sinalização SGK1. Os efeitos da presente droga espelhou os resultados da inibição de PI3K com, uma redução dependente da dose significativo na NRG MRVA /veículo (ANOVA, F (3,4) = 4,709, p = 0,0214) (Figura 5a) e nenhum efeito sobre a ICAM- sozinho ou MRVA PMA /veículo. Ao contrário, com a inibição de PI3K, AKT inibição foi associada com uma redução significativa em anexo significativo ICAM-sozinho (ANOVA, F (3,4) = 6,711, p = 0,0086) (Figura 5b). No entanto, esta redução foi apenas observado na dose mais elevada (p = 0,0033). Este mesmo efeito também foi observado em reduzir significativamente os valores de fluorescência NRG-primas com a dose elevada única (ANOVA, F (3,4) = 11,639, p = 0,0007) com tendência óbvia em outras doses. Tendo em conta este efeito comum em média ICAM-alone e média fixação NRG exclusivamente na dose alta, pode representar uma reação cruzada do inibidor em concentrações elevadas com outra via de sinalização importante para manter um estado adesivo.

Administração

do X Akt de inibidor em água veículo (n = 5) causou uma diminuição dependente da dose na MRVA NRG /veículo (a). Ao contrário de inibição de PI3K, AKT inibição foi associada com uma redução significativa estatisticamente significativo na ICAM (B) e significa NRG (não mostrado) valores de fluorescência em bruto para a dose elevada apenas com nenhuma tendência em doses mais baixas. Em comparação com o controlo de veículo, * representa p 0,05 e ** representa p 0,01. Em comparação com a dose baixa, + representa p 0,05 e ++ representa p . 0,01

Rho-quinase não é essencial para os efeitos de adesão NRG1- ou induzido por PMA

Desde Rho também está a jusante de PI3K e tem sido implicada nos mecanismos de adesão celular, [36], [37] que é importante para investigar se Rho desempenha um papel na adesão celular induzida por NRG1. No entanto, não há inibidores de Rho, específicos de células-permeável disponíveis, de modo que a proteína cinase Rho-associado (ROCHA) inibidor da Rho Kinase Inhibitor IV foi utilizado. Este inibidor ROCHA não teve efeitos significativos em qualquer um dos parâmetros de adesão examinados, e assim a sinalização ROCHA não parecem desempenhar qualquer papel crítico na modulação da linha de base, NRG1-induzido ou PMA-induzida variando de adesão.

sinalização MEK é não essencial para a induzida por NRG1 adesão celular efeito

o PD98059 inibidor selectivo MEK não teve qualquer efeito sobre qualquer um dos parâmetros de adesão em qualquer dose (não mostrado). Isto sugere que mesmo foram MEK de sinalização envolvidas nestes processos, não é essencial para a adesão inicial ou NRG1- ou adesão PMA-mediada.

sinalização fosfolipase C é necessária para a manutenção de um estado de adesivo, em geral

Tal como PI3K, o U73122 inibidor PLC também causou uma redução significativa na induzida por NRG1α MRVA (ANOVA, F (3,4) = 4,186, p = 0,0304) (Figura 6a), mas o efeito deste inibidor parecia uma redução global na fixação das células em geral, e não um /efeito dependente da erbB2 NRG1. Tanto a variabilidade da linha de base (ICAM-alone MRVA) (ANOVA, F (3,4) = 8.883, p = 0,0023) e média basal de fixação (média ICAM-alone) (ANOVA, F (3,4) = 4.915, p = 0,0186 ) diminuiu após a exposição ao U73122 (Figuras 6B e C, respectivamente). No entanto, a alteração na média ICAM-sozinho foi apenas significativo na dose mais elevada (p = 0,0155) (Figura 6c). Da mesma forma, os valores de fluorescência médios NRG-primas e PMA tinham diminuições significativas apenas na dose mais elevada (NRG: ANOVA, F (3,4) = 8,672, p = 0,0025; PMA: ANOVA, F (3,4) = 4,736, p = 0,0210). É importante notar, contudo, que nem a média NRG /veículo (Figura 6d), nem a média PMA /veículo (Figura 6e) rácios foram significativamente diferentes entre doses, indicando que a inibição PLC está afetando sinalização celular comum através dessas vias a um independente grau semelhante de o agente estimulador. Portanto, embora o inibidor PLC exerceram um efeito significativo sobre a redução do /veículo MRVA NRG, esta provavelmente foi devido à redução da adesão global e comprimindo a gama de resposta potencial, em vez de a inibição específica de uma via NRG1 /dependente de erbB2.

Enquanto o inibidor U73122 PLC em veículo etanol (n = 5) causou uma redução significativa na NRG MRVA /veículo (a) e uma tendência para a redução da PMA MRVA /veículo (não mostrado), é exercida uma efeito muito mais forte na linha de base de amortecimento MRVA devido à presença de ICAM e sinalização endógena sozinho (B). Além disso, a dose mais elevada, que causou uma redução significativa na ligação ICAM linha de base (C) e em média NRG e fixação PMA (valores de fluorescência em bruto) (não mostrado). No entanto, a média de NRG /veículo (D) e média PMA /veículo (E) não foram significativamente alteradas. Em comparação com o controlo de veículo, * representa p 0,05 e ** representa p 0,01. Em comparação com a dose baixa, ++ representa p 0,01 e +++ representa p . 0.001

miosina quinase da cadeia leve de sinalização (MLCK) é importante para a adesão da linha de base

Dada a importância da MLCK conhecido na promoção da fixação, o inibidor da MLCK ML-7 foi utilizada para examinar os seus efeitos sobre os diferentes parâmetros de adesão. Como esperado, o efeito principal da inibição do MLCK-se um decréscimo dependente da dose da ligação de ICAM-significativo sozinho (ANOVA, F (3,4) = 17,601, p 0,0001) (Figura 7a). No entanto, não houve alterações nos valores de fluorescência matérias de PMA (ANOVA, F (3,4) = 0,381, p = 0,7686) (Figura 7b) ou NRG (ANOVA, F (3,4) = 0,322, p = 0,8095 ) (Figura 7c). Não foram observados efeitos significativos sobre qualquer um dos três parâmetros Mrva. É também importante salientar que os efeitos observados por CLP comparada com a inibição MLCK não eram idênticos. inibição PLC causou reduções nos valores de fluorescência NRG e PMA matérias, sugerindo sua ampla importância para múltiplos caminhos comuns de aderência. Em contraste, a inibição da MLCK parecia exercer um efeito restrito à linha de base de adesão ICAM com nenhum efeito sobre os valores de fluorescência médios matérias NRG ou PMA.

A administração do inibidor da MLCK ML-7 em veículo de DMSO (n = 5) causou uma redução significativa na ligação da linha de base no meio e doses elevadas (a). Embora este foi associado com o aumento da média NRG /veículo e dizer PMA /veículo (não mostrado), estes efeitos foram apenas uma consequência das reduções no denominador tanto como os PMA (B) e NRG (C) valores de fluorescência matérias ficaram inalterados. Em comparação com o controlo de veículo, ** representa p 0,01 e *** representa p 0,001. Em comparação com a dose baixa, +++ representa p 0,001 e ++++ representa p 0,0001

induzida NRG1α adesão variando está embebido em linfoblastos derivados de pacientes com esquizofrenia

Dada a nossa observação anterior que linfoblastos paciente derivadas mostraram uma resposta migratória menos robusta para NRG1α ea correlação existente entre as nossas medidas de migração e adesão, que previu que haveria também uma diferença MRVA entre pacientes e controles. Com efeito, a NRG /veículo MRVA foi significativamente menor nos linfoblastos derivados dos pacientes em comparação com os derivados de controlos normais (pacientes (n = 20), 0,520 ± 0,045; controlos (n = 20), 0,780 ± 0,044; p = 0,0002) ( A Figura 8-A e C). Em contraste, a resposta PMA foi semelhante entre os grupos, indicando que os linfoblastos derivados de paciente ainda retiveram a capacidade para mediar a adesão celular robusto, mas foram incapazes de o fazer de forma apropriada em resposta a NRG1α. Uma série de PMA experiências de dose-resposta foram realizadas para excluir a possibilidade de que a ausência de diferença entre os grupos foi um fenómeno sensível da dose; estes testes mostraram formas de onda quase idêntico em todos os sujeitos em todas as concentrações ensaiadas (Figura S2), mais o que sugere que a resposta de PMA foi normal nas linhas celulares derivadas de pacientes. É importante notar que o PMA também induziu níveis variados de adesão no nosso ensaio, semelhante a mas mais extremas do que a de NRG1α. Tanto a medida MRVA de adesão induzida por PMA (pacientes (n = 20), 1.561 ± 0.217; controlos (n = 20), 1,356 ± 0,121; p = 0.4124) (Figura 8b) e da média de PMA /veículo (pacientes (n = 20), 2.083 ± 0.120; controles (n = 20), 1.980 ± 0,085; p = 0,4840) não diferiu entre as células derivadas de pacientes e derivados de controle. Não houve diferença na ligação a ICAM significativo entre as células derivadas do paciente e derivados de controlo na condição de ICAM-sozinha não estimulado.

O NRG /veículo MRVA foi significativamente menor nos linfoblastos derivados dos pacientes em comparação com os que derivam do normal controlos (A). PMA /veículo MRVA foi similar entre as linhas de células derivadas de controlo (B) derivada do paciente e. A deficiência relativa em células derivadas de pacientes não parecem ser isolados ao apego ou desapego, mas foi indicativo de uma resposta mais restrito geral com menor variação de adesão da linha de base em resposta a NRG1α (C). *** Representa p . 0.001

COMT genótipo prevê o intervalo de variação na adesão induzida NRG1α

Dada a relação de polimorfismos de nucleotídeo único no COMT (val108 /158met, rs4680 ) e, em NRG1 (rs6994992) para a migração celular induzida NRG1α anteriormente estabelecido [7], procurou-se determinar se a adesão celular induzida NRG1α também mostrou tais associações. A presença do alelo associado COMT Val-risco esquizofrenia mostrou uma forte tendência para a predição menor MRVA induzida NRG1α em toda a amostra com efeitos similares em ambos os grupos (teste t não emparelhado, p = 0,0632) (Figura 9A). ANOVA realizada com o grupo de diagnóstico eo genótipo como fatores independentes não revelou genótipo por interações de diagnóstico para ambos os genes. Além disso, não houve efeito do genótipo da COMT no MRVA induzido por PMA (teste t não emparelhado, p = 0,8727). Por causa da freqüência do alelo menor baixa em rs6994992 NRG1, nosso estudo foi fraca potência para testar uma associação com este SNP.

COMT, um gene de susceptibilidade putativos tanto para esquizofrenia e câncer metastático, previamente foi mostrado para ter efeitos genótipo na migração de células com o genótipo de risco rs4680 V /V mostrando a migração mais prejudicada. Em nossos dados de adesão (n = 40), houve uma forte tendência (p = 0,0632) em direcção a diminuição NRG1α induzida MRVA de homozigotos de risco em comparação com homozigotos não-risco (sem linhas celulares heterozigoto são mantidos).

Discussão

Nós apresentamos uma série de estudos que fornecem evidência de que a ativação NRG1α de linfoblastos B induz uma resposta de adesão celular temporalmente variável que é mediada pela erbB2 /PI3K /via Akt1 e que é anormal em células derivados de pacientes com esquizofrenia e afectada pela COMT Val /met genótipo. Para o nosso conhecimento, estes são os primeiros dados que mostram que NRG1α induz anexo em linfoblastos B num ensaio de adesão celular, revelando variação dependente do tempo na adesão net. Em nossos estudos, o MRVA desta resposta de adesão induzida por NRG1α tem relevância biológica aparente na medida em que prevê tanto o grau da resposta migração celular para NRG1α bem como as diferenças entre os casos de esquizofrenia e controles normais. Por sua vez, o próprio MRVA pode ser previsto por um único polimorfismo de nucleótidos dentro da COMT, a qual também está implicada no cancro metastático. Enquanto NRG1α exógena aumenta a expressão de superfície celular da integrina CD18 (Figura S4), a natureza deste efeito estável ao longo do tempo sugere que este aumento da expressão na superfície não é directamente responsável por mediar a adesão resposta temporalmente variando. Pelo contrário, esta resposta de adesão induzida por NRG1α é dependente de sinalização através de vias erbB2, PI3K e Akt. PLC e MLCK sinalização também desempenham um papel na adesão, mas não exercem efeitos específicos de NRG1α.

Considerações metodológicas

Como a variação dependente do tempo na adesão celular em resposta a NRG1 é o fenómeno fundamental na qual o trabalho aqui relatado é baseado, é importante para validar que esta variação representa um efeito biológico real e não é meramente “ruído”. na verdade, pode-se argumentar que uma vez que a medida é baseada numa população de células que provavelmente é não homogênea no que diz respeito aos estados de fixação, fases do ciclo celular, e outros fenômenos biológicos, a MRVA é mais provável do que não aleatória. Efetuamos uma série de experimentos detalhados mostrando de forma convincente e consistente que esta adesão que varia não é aleatória: especificamente, 1) determinados padrões temporais de apego e desapego, embora não intrínseca à própria célula não estimulada, parecem estar relativamente conservado quando as células do mesma linha de células sob as mesmas condições, ao mesmo tempo são submetidos a estímulos específicos, que alteram o seu estado de fixação (Figura S2); 2) o MRVA é extremamente fiável dentro de uma linha de células estudadas em ocasiões repetidas em dias diferentes (Figura 1); 3) o MRVA é afectada de um modo dependente da dose por vários inibidores da via de sinalização relevantes (Figuras 3-7); 4) o MRVA induzida por NRG1 prevê outros fenómenos relacionados com a NRG1 nessas células, e.g.