Abstract
Objectivo
rica em leucina receptor acoplado à proteína G 5 (LGR5), recentemente foi relatado para ser um marcador de células-tronco cancerosas (CSCs) em câncer colorretal contendo repeat- (CRC), e o valor prognóstico da LGR5 no CRC foi avaliada em vários estudos. No entanto, as conclusões permanecem controversos. Neste estudo, o objetivo foi avaliar a associação entre a expressão de LGR5 ea evolução dos pacientes de CRC através da realização de uma meta-análise.
Métodos
A pesquisa de estudos relevantes publicados até fev 2014 utilizando o PubMed, web of Science, Embase e Wangfang. Apenas os artigos em que a expressão LGR5 foi detectado por imuno-histoquímica foram incluídos. Uma meta-análise foi realizada usando STATA 12.0, e as taxas de risco agrupados (HR) com intervalos de confiança de 95% (IC) foram utilizados para estimar a força da associação entre a expressão LGR5 eo prognóstico de pacientes com CCR.
resultados
Um total de 7 estudos que compreendem 1833 pacientes com CCR preencheram os critérios de inclusão, incluindo 6 estudos que compreendem 1781 pacientes para a sobrevida global (oS) e 3 estudos compreendendo 528 pacientes para a sobrevivência livre de doença (DFS). Nossos resultados mostraram que a alta expressão LGR5 foi significativamente associada com mau prognóstico, em termos de OS (HR: 1,87, 95% CI: 1,23-2,84; P = 0,003) e DFS (HR: 2,44, 95% CI: 1,49-3,98; P 0,001). Outras análises de subgrupo revelou que muitos fatores, incluindo a região de estudo, número de pacientes, tempo de seguimento e valor de corte, afetou a importância da associação entre a expressão LGR5 e um pior prognóstico em pacientes com CCR. Além disso, não havia nenhuma evidência de viés de publicação, como sugerido por testes de Egger Begg de e.
Conclusões
A presente meta-análise indicou que a alta expressão LGR5 foi associada com mau prognóstico em pacientes com CRC e que LGR5 é um fator prognóstico eficiente na CRC
Citation:. Chen Q, Zhang X, Li WM, Ji YQ, Cao HZ, Zheng P (2014) Valor prognóstico de LGR5 no câncer colorretal: uma meta -Análise. PLoS ONE 9 (9): e107013. doi: 10.1371 /journal.pone.0107013
editor: Armin Gerger, Medical University of Graz, Áustria
Recebido: 23 de maio de 2014; Aceito: 05 de agosto de 2014; Publicação: 05 de setembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Fundo de Ciência Natural Nacional de Distintos Jovens Cientistas (No. 30.725.043) e uma bolsa da National Natural Science Foundation da China (No. 31.201.118). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CCR) é a neoplasia maligna mais comum do trato gastrointestinal em todo o mundo. Como uma das principais causas de mortalidade relacionada com o cancro [1], CRC é responsável por mais de 600.000 mortes por ano [2]. Apesar dos avanços na cirurgia curativa e terapia adjuvante, bem como uma extensa pesquisa CRC-focado ao longo dos últimos 20 anos, a taxa de sobrevida de 5 anos ainda é pobre [3]. Relapse, metástase e resistência às drogas são os principais fatores que contribuem para a elevada mortalidade e taxa de sobrevivência pobres desta doença [4]. A evidência crescente sugere que uma população de células tumorais auto-renovação, conhecidos como cancro de células estaminais (CCC), é responsável pela progressão do tumor, recaída, metástases e resistência terapêutica [5], [6]. Portanto, a identificação de CSCs é crucial na busca de alvos terapêuticos e marcadores prognósticos úteis para CRC.
Becker et al. sugerido que o receptor rico em leucina contendo repetição G acoplado a proteína 5 (LGR5) pode ser um melhor marcador de CSCs em CRC [7]. LGR5 foi inicialmente identificado como um orphan receptor acoplado a proteína G (GPCR) que pertence à subfamília de receptores de hormonas glicoproteicas [8], e que contém um grande domínio extracelular com 17 repetições ricas em leucina e um domínio de sete-transmembrana. Recentemente, a expressão LGR5 elevada tem sido observado em vários tipos de cancros, incluindo o carcinoma hepatocelular [9], CRC [10], do cancro do ovário [11], e carcinoma de células basais [12]. Em particular, vários estudos têm sugerido que LGR5 desempenha um papel chave na carcinogénese colorrectal e está associada com o mau prognóstico de pacientes de CRC [13] – [18]. Embora LGR5 variação alélica pode afectar a expressão da proteína LGR5 em cancros colorrectais, o genótipo LGR5 somática parece ser relativamente estável em tumores primários. Além disso, os pacientes com alelos variantes em SNPs do gene LGR5 mostrou prognóstico semelhante como pacientes com tipo selvagem LGR5, nenhuma diferença significativa foi observada [19]. Portanto, espera-se que a expressão LGR5 no CRC é um marcador de prognóstico ideal que está correlacionada com a baixa sobrevivência.
Na verdade, nos últimos anos, muitos estudos têm mostrado que a expressão de LGR5 está positivamente associada com mau prognóstico no CRC [13], [15], [17]. No entanto, não foi encontrada correlação entre a expressão de LGR5 e um mau resultado clínico no CRC em outro estudo anterior [20]. O valor prognóstico da LGR5 em pacientes com CCR é controverso, e um tamanho de amostra insuficiente e vários outros fatores provavelmente resultou nos resultados contrários de diferentes estudos clínicos. No entanto, até à data, não houve nenhuma meta-análise de expressão LGR5 eo prognóstico de pacientes com CRC. Para esclarecer o valor prognóstico exato da LGR5 no CRC, foi realizada uma meta-análise de estudos elegíveis para investigar a relação entre a expressão LGR5 eo prognóstico de pacientes com CCR.
Materiais e Métodos
Literatura estratégia de busca
Nós procurou o PubMed, web of Science, Embase, e Wangfang para artigos relevantes publicados até 31 de março de 2014. os termos de pesquisa incluíram “LGR5”, “cancro do cólon”, “câncer retal”, “O câncer colorretal” e “prognóstico”. Bibliografias, artigos de revisão e estudos pertinentes foram pesquisados manualmente para estudos pertinentes adicionais
Os critérios de seleção
Os critérios de inclusão para a elegibilidade de um estudo foram os seguintes:. (1) pacientes com diagnóstico CRC distintivo por patologia, (2) uma avaliação das relações entre expressão LGR5 eo prognóstico de pacientes com CCR, (3) informações suficientes fornecidas para estimar taxa de risco (HR) para a sobrevida global (oS) ou sobrevida livre de doença (DFS), e (4) a publicação com o Inglês ou chinês. Os seguintes estudos foram excluídos das análises: (1) cartas, comentários e resumos de conferências, devido aos dados limitados, e (2) artigos sobre linhagens de animais ou celulares. No que se refere várias publicações da mesma população, apenas o mais recente ou o mais completo estudo foi incluído na análise.
Extração de dados e avaliação da qualidade
Dois investigadores (Qing Chen e Zhang Xin) revisou cada artigo elegíveis independentemente e extraiu-se informação a partir de todas as publicações que satisfazem os critérios de inclusão. As seguintes características foram coletadas de cada estudo: o nome do primeiro autor, ano de publicação, país de origem, o número de pacientes, a idade dos pacientes, o tempo de follow-up, o estágio da doença, o valor de corte, Os níveis de expressão LGR5 e dados de sobrevivência. Discordâncias foram resolvidas por discussão até que o consenso foi alcançado.
Avaliação da qualidade foi realizada para cada um dos estudos disponíveis utilizando a escala de avaliação da qualidade Newcastle-Ottawa [21]. A pontuação avaliada oito itens sobre a metodologia que foram categorizados em três dimensões, incluindo a seleção, comparabilidade e resultado. Interpretação da escala é realizada pela atribuição de pontos, ou “estrelas”, por elementos de alta qualidade. As estrelas são então somados e usadas para comparar a qualidade do estudo de uma forma quantitativa. Nós especificado a priori que uma pontuação de 7 ou superior indicado de alta qualidade, uma pontuação de 5 ou 6 indicado qualidade moderada, e uma pontuação de 4 ou menos indicada baixa qualidade.
A análise estatística
dados sobre resultados de sobrevivência foram sintetizados usando o HR e seu intervalo de confiança de 95% (CI) para analisar o impacto de expressão LGR5 na sobrevida de pacientes com CCR. Vários dos estudos incluídos fornecida horas e ICs de 95%, o que agrupados diretamente. Caso contrário, foi calculado o HR e seu IC 95% a partir dos dados disponíveis ou de uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier usando Engauge digitador versão 4.1 (software livre baixado da https://sourceforge.net). Por convenção, uma HR observada 1 implícita pior sobrevida para um grupo com aumento da expressão LGR5. O impacto de expressão LGR5 na sobrevivência foi considerado estatisticamente significativo se não houve sobreposição do IC 95%, com 1. A heterogeneidade entre os estudos foi avaliada por um teste estatístico com base qui-quadrado-Q [22], ea I
2 valor foi utilizado para quantificar a heterogeneidade (I
2 = 0-50%, não ou heterogeneidade moderada; I
2 50%, heterogeneidade significativa) [23]. Se a homogeneidade não foi significativa (P 0,10 para o ensaio de Q), foi utilizado o modelo de efeito fixo; caso contrário, foi utilizado o modelo de efeito aleatório. viés de publicação foi avaliada pelo teste de Egger e teste de Begg [24], [25]. Para ajustar para comparações múltiplas, foi aplicado o método stepdown Bonferroni, que controlam a taxa de erro familywise (poucos). Além disso, a análise de sensibilidade foi realizada para examinar a estabilidade dos resultados agrupados. As análises estatísticas foram realizadas utilizando STATA 12.0. Todos os valores de P foram em frente e verso, e P . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
selecção Estudo e características
Como mostrado na Fig. 1, um total de 58 artigos foram inicialmente recuperados a partir das bases de dados acima, utilizando a estratégia de pesquisa descrita acima, e os detalhes de resultados de buscas em bases de dados diferentes são apresentados na tabela S1. Depois de analisar os títulos e resumos dos artigos, 41 artigos que eram irrelevantes para o nosso objectivo, foram excluídos. Os restantes 16 artigos foram então analisadas de forma independente por dois dos autores. Dos artigos, 10 artigos foram excluídos: texto completo não pôde ser encontrado para 2 artigos [13], [26], um artigo era sobre a expressão LGR5 no sangue periférico [18], 4 artigos não forneceu dados mínimos ou DFS [ ,,,0],10], [27] – [29], 2 artigos eram sobre as variantes ou polimorfismos de LGR5 [29], [30] e um artigo duplicado uma coorte de pacientes [17]. Eventualmente, 7 artigos preencheram os critérios de inclusão e foram incluídos na meta-análise [14] – [16],
Todos os 7 artigos elegíveis avaliou a correlação entre a expressão LGR5 em tecidos CRC e o prognóstico. do CRC. As principais características dos 7 estudos estão resumidos na Tabela 1. Estes estudos foram publicados a partir de 2010-2014 e conduzida em 3 países (EUA, Japão e China). O número total de pacientes inscritos foi de 1833, com amostras individuais que vão 52-891 (mediana 180). A média de idade relatou dos pacientes variou de 57-66.9 anos ao longo dos estudos elegíveis. O período de seguimento variou de 28.3-180 meses. Vários dos estudos definiu o valor de corte usando métricas de pontuação complexos que combinam a intensidade ea porcentagem de expressão LGR5, enquanto outros estudos só é utilizado o percentual de expressão LGR5. LGR5 expressão positiva foi observada a faixa de 36-60%. Havia 2 estudos que utilizaram tanto OS e DFS para avaliar o valor prognóstico da expressão LGR5 em pacientes CRC [16], [32]. Além disso, 4 estudos utilizados apenas OS como um indicador [15], [20], [31], [33], e um estudo usado apenas DFS [17]. Horas e ICs de 95% foram obtidos diretamente a partir de 5 estudos, e para os restantes 2 estudos, horas e ICs de 95% foram extrapoladas a partir de curvas de Kaplan-Meier. No geral, os estudos incluídos no mate-análise foram de alta qualidade, e dos 7 estudos, 3 (43%) teve 8, 3 (43%) teve 7 e 1 (14%) teve 6.
expressão LGR5 e prognóstico da CRC
6 de um total de 7 estudos apresentaram dados sobre a expressão LGR5 e oS no CRC [15], [16], [20], [31] – [33 ], de modo que os dados combinados de todos os 6 estudos foram agrupados na meta-análise. Como mostrado na Fig. 2, devido a um significativo grau de heterogeneidade (I
2 = 80,1%, P 0,001), os RHs agrupados e 95% IC foram calculados utilizando o modelo de efeito aleatório (REM). Os resultados mostraram que a expressão elevada LGR5 foi associada com mau OS em CRC (RH: CI 1,87, 95%: 1,23-2,84, P = 0,003, REM). Além disso, o HR reunidas para OS foi de 1,34 (IC 95%: 1,17-1,54, P 0,001), calculado pelo modelo de efeito fixo (FEM). 3 de 7 estudos apresentaram dados sobre a expressão LGR5 e DFS, e como mostrado na Fig. 3, a expressão alta LGR5 foi significativamente correlacionada com DFS, com uma estimativa de RH combinada de 2,44 (IC 95%: 1,49-3,98, P 0,001, FEM). Não foi observada uma heterogeneidade significativa (I
2 = 0%, P = 0,649)
HR .. 1 implícita pobres sobrevivência, e de expressão alta LGR5 foi significativamente associada com pior OS em pacientes CRC
HR 1 a sobrevivência pobre implícita, e expressão alta LGR5 foi significativamente associada com DFS piores em pacientes com CCR
foi realizada uma análise de subgrupo da associação de expressão LGR5 com oS by. região de estudo, número do paciente, idade, acompanhamento, estágio do tumor e valor de corte, e os principais resultados são apresentados na Tabela 2. os resultados mostraram que a expressão LGR5 foi significativamente correlacionada com oS (HR: CI 2,52, 95%: 1.75- 2,89) em pacientes de países asiáticos, mas não em pacientes de países não-asiáticos (HR: 1,09, 95% CI: 0,93-1,28), aqui, devemos observar o fato de que só estudar a partir de países não-asiáticos (EUA) foi incluído. A análise de subgrupo mostrou uma correlação significativa entre a expressão LGR5 e OS em estudos em que o número de pacientes foi inferior a 200 (HR: CI 2,22, 95%: 1,66-2,98). O subgrupo meta-análise dos estudos com um período de seguimento inferior a 60 meses indicaram que a alta expressão LGR5 foi um preditor de mau OS (HR: CI 2,38, 95%: 1,79-3,15). Quando agrupados de acordo com o estágio de CRC, observou-se uma relação significativa entre a expressão LGR5 e OS, tanto na fase inicial (HR: 2,27, 95% CI: 1,52-3,38) e a fase posterior (HR: CI 1,70, 95%: 1,01-2,87) do CRC. Observou-se também um efeito estatisticamente significativo de expressão LGR5 no OS com base nos estudos utilizando um corte 6, com uma HR de 2,09 (IC 95%: 1,36-3,21). Além disso, os resultados também mostraram que a expressão elevada LGR5 foi preditor independente de mau OS em pacientes com CCR com a média de idade ≤60 (RH: CI 2,27, 95%: 1,52-3,38). Devido ao baixo número de estudos, a análise de subgrupo da associação de expressão LGR5 com DFS não foi prosseguida.
análise de viés de publicação
Nesta meta-análise, o viés de publicação foi testada usando gráfico de funil de Begg e teste de Egger. Como mostrado na Figura 4, o gráfico de funil apresentou nenhuma prova de viés de publicação óbvio em qualquer um dos estudos incluídos para OS ou DFS, e teste de Egger também não mostrou nenhum viés de publicação óbvia nos estudos para qualquer um dos dois resultados (OS, P = 0,471; DFS, P = 0,749;. a Fig. 5)
(a) gráfico de funil de Begg avaliar a expressão LGR5 e OS em pacientes com câncer colorretal. gráfico de funil (B) de Begg avaliar a expressão LGR5 e DFS em pacientes com câncer colorretal.
(A) o teste de Egger avaliar a expressão LGR5 e OS em pacientes com câncer colorretal. teste (B) do Egger avaliar a expressão LGR5 e DFS em pacientes com câncer colorretal.
Análise de sensibilidade
Para avaliar a estabilidade do resultado, uma análise de sensibilidade foi realizada, em que um estudo foi eliminada de cada vez. Como mostrado na Tabela 3, a FC reunidas correspondente para OS não se alterou significativamente, independentemente de qual estudo foi eliminado, sugerindo que o resultado era robusta. No entanto, o HR reunidas para DFS parecia ser significativamente alterada, o que pode ter sido devido ao número insuficiente de estudos.
Discussão
CRC é uma doença maligna com alta mortalidade em todo o mundo , e seu prognóstico é ainda deficiente, embora tremendo progresso foi alcançado [4]. Recentemente, a alteração de marcadores moleculares biológicas em tecidos de tumor tornou-se uma parte importante da previsão do prognóstico de pacientes com tumores malignos. LGR5, conhecido como um alvo da via de sinalização Wnt, tem sido relatada como sendo um potencial marcador de células estaminais no intestino delgado e cólon [34], [35]. estudos têm mostrado que acumulados LGR5 está intimamente associada com a tumorigénese e invasão tumoral em CRC e é provável que seja um marcador relevante de CSCs em CRC [12], [36]. CSCs são pensados para ser responsável pela invasão local, metástase e recorrência de tumores malignos por causa de sua auto-renovação e potencial multi-diferenciação e, portanto, também são um grande obstáculo para melhorar a sobrevivência de câncer em geral.
Nos últimos anos , a correlação entre a expressão LGR5 ea sobrevivência dos pacientes tem sido explorado em muitos estudos devido ao papel fundamental da LGR5 na tumorigênese. expressão alta LGR5 tem sido amplamente relatado para ser um indicador de prognóstico desfavorável em vários cancros humanos [13], [15], [33], [37]. No entanto, alguns relatórios também têm sugerido resultados contrários para a correlação entre a expressão LGR5 eo prognóstico da CRC. Por exemplo, Ziskin et ai. relatado que a expressão LGR5 não foi significativamente associada com o resultado de tumores [20] e não era um marcador de prognóstico da CRC (HR: CI 1,09, 95%: 0,93-1,28). Para validar a relação exata entre a expressão LGR5 eo prognóstico de pacientes com CRC, uma meta-análise foi realizada, incluindo estudos relacionados recentes e geralmente usando uma estratégia de pesquisa abrangente. Para o melhor de nosso conhecimento, esta é a primeira meta-análise que tem documentado o valor prognóstico da LGR5 no CRC. No presente meta-análise, através da combinação dos resultados de 6 estudos publicados, compreendendo 1781 pacientes com CRC, chegamos à conclusão que a alta expressão LGR5 foi significativamente associada com a má OS (HR: CI 1,87, 95%: 1,23-2,84, P = 0,003), além disso, a expressão alta LGR5 também foi significativamente associada com pior DFS (HR: CI 2,44, 95%: 1,49-3,98, P 0,001), combinando os resultados de 3 estudos compreendendo 528 pacientes com CCR. Além disso, a análise de sensibilidade mostrou que a associação significativa entre a expressão elevada LGR5 e pobres OS não foi alterada, independentemente de um desses estudos foi omitido, sugerindo a robustez deste resultado. No entanto, a associação significativa entre a expressão elevada e pobre LGR5 DFS foi afectada pela omissão de estudo, o que pode ser devido ao pequeno número de estudos. Nesta meta-análise, a avaliação da qualidade foi realizada de forma independente e reproduzível por dois autores acordo com as diretrizes Newcastle-Ottawa. Ao avaliar os artigos de forma abrangente e cientificamente, que assegurou que os estudos incluídos eram de alta qualidade.
Warrants cautela é porque as características basais dos pacientes pode ter afetado a conclusão de cada incluída relatório, incluindo o tamanho da amostra, follow-up período, estágio clínico e notas de corte para a definição de coloração positiva, entre outros aspectos. Portanto, uma análise mais aprofundada de subgrupo foi realizada por região de estudo, número do paciente, idade, tempo de seguimento, palco e valor de corte. Descobrimos que a expressão alta LGR5 foi significativamente associada com a má OS nos estudos realizados na Ásia (HR: CI 2,52, 95%: 1,75-2,89), mas não em um estudo feito fora da Ásia. Portanto, mais estudos são necessários para verificar se o valor prognóstico da LGR5 no CRC está associado com a região habitada pelos pacientes. Observou-se uma associação significativa entre a expressão LGR5 e pobres OS somente quando o período de acompanhamento foi ≤ 60 meses; este dado deve ser interpretado com cautela, devido ao aumento da mortalidade com o prolongamento do tempo de seguimento. Além disso, a análise de subgrupo por estágio clínico revelou que a alta expressão LGR5 foi significativamente associada com a má OS em pacientes, independentemente do estágio (cedo ou tarde) de CRC, indicando que LGR5 foi um preditor independente do prognóstico durante a progressão da CRC. Esta observação era consistente com o papel de LGR5 na carcinogénese, incluindo enriquecendo CSCs e promover a formação e progressão tumoral. Como não existe um padrão uniforme para definir a expressão LGR5 positivo, o ponto de corte muito diferente entre os estudos, e os resultados podem também mudaram devido ao valor de corte. A análise de subgrupo mostraram que a expressão LGR5 foi significativamente associada com um prognóstico desfavorável em pacientes com CRC quando os estudos definir a nota de corte at 6 (HR: CI 2,09, 95%: 1,36-3,21), sugerindo que a nota de corte superior foi mais susceptível de conduzir a uma conclusão diferencial. Estudos anteriores demonstraram que a expressão LGR5 elevada se correlaciona significativamente com invasão linfática, invasão vascular, a profundidade do tumor, metástases linfonodais e recidiva do tumor [38], [39].
O viés de publicação é uma grande preocupação em todas as formas de meta-análise. No presente estudo, nenhum teste de Egger nem gráfico de funil de Begg mostraram evidências de viés de publicação. No entanto, existem várias limitações para o meta-análise atual, como não podíamos impedir que todos viés potencial entre os estudos. Em primeiro lugar, os estudos incluídos em nossa meta-análise foram restrito apenas artigos publicados em Inglês ou chinês, eo número era relativamente pequeno. Em segundo lugar, a heterogeneidade entre os estudos foram encontrados na análise principal, talvez devido à diversidade das técnicas utilizadas para identificar a expressão de LGR5. Por exemplo, todos os estudos foram incluídos necessária para detectar a expressão LGR5 por IHQ, mas os resultados de IHC dependia fortemente de factores tais como tipo metodológicas anticorpo primário e anticorpo de concentração, levando à heterogeneidade entre-estudo. Por esta razão, foram adoptadas modelo de efeito aleatório e análise de subgrupo para ajustar para esta deficiências. Em terceiro lugar, o método de RH e 95% CI extrapolação deve ser mencionada, como um de RH e um IC de 95%, calculado a partir dos dados ou a sua extracção a partir de curvas de sobrevivência pode ser menos fiável do que os obtidos por análise directa da variância. Além disso, é preciso considerar o fato de que os estudos com resultados positivos são facilmente aceites, enquanto que estudos com resultados negativos são muitas vezes rejeitadas.
Em resumo, apesar das limitações acima referidas, verificou-se que a alta expressão LGR5 pode ser uma fator de risco independente para pacientes com CCR. Com base em artigos publicados atualmente, alta expressão LGR5 é um fator prognóstico desfavorável em pacientes com CCR e poderia ser útil para otimizar esquemas terapêuticos. Além disso, estudos prospectivos maiores são necessários para validar os nossos resultados.
Informações de Apoio
Tabela S1.
Os resultados da pesquisa de artigos relevantes em bancos de dados diferentes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0107013.s001
(DOC)
Checklist S1.
PRISMA Checklist
doi:. 10.1371 /journal.pone.0107013.s002
(DOC)