Abstract

A esfingosina-1-fosfato (S1P) transporter Spns2 regula a migração precursor do miocárdio no peixe-zebra e linfócitos tráfico de ratos. No entanto, a sua função no cancro não foi investigada. Mostramos aqui que a expressão ectópica Spns2 induzida apoptose e sua knockdown reforçada migração celular em células de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Metabolicamente, expressão Spns2 aumentou o nível S1P extracelular, enquanto a sua knockdown o intracelular. A inibição farmacológica da síntese de S1P aboliu a migração celular aumentada mediada por Spns2 knockdown, indicando que S1P intracelular desempenha um papel-chave no presente processo. estudos com células sinalização indicou que a expressão Spns2 prejudicada GSK-3β e Stat3 mediada vias pró-sobrevivência. Por outro lado, estas vias foram ativados por Spns2 knockdown, o que explica o aumento da migração celular, uma vez que também são cruciais para a migração. Foram encontradas alterações de Spns2 a afetar várias enzimas envolvidas no metabolismo S1P, incluindo quinases esfingosina, fosfatases S1P, e liase S1P 1. Geneticamente, o nível de mRNA Spns2 foi encontrado para ser reduzida em câncer de pulmão avançado (LC) pacientes como quantificados por um pequeno dimensionar matriz qPCR. Estes dados mostram pela primeira vez que Spns2 desempenha um papel-chave na regulação das funções celulares em células NSCLC, e que a sua infra-regulação é um fator de risco potencial para a LC

Citation:. Bradley E, Dasgupta S, Jiang X, Zhao X, Zhu G, Ele Q, et al. (2014) papel crítico da Spns2, um transportador de esfingosina-1-fosfato, em Cell Lung Cancer sobrevivência e migração. PLoS ONE 9 (10): e110119. doi: 10.1371 /journal.pone.0110119

editor: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de junho de 2014; Aceito: 08 de setembro de 2014; Publicação: 20 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Bradley et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão no corpo e os arquivos de suporte de informação do papel

Financiamento:. Este projecto é apoiado por uma bolsa Intramural da Geórgia Regents University e um prêmio SDG da American Heart Association (GW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão (LC) é a principal causa de morte relacionada com cancro nos Estados Unidos e em todo o mundo [1], [2]. Em 2012, existem mais de 220.000 novos casos e mais de 160.000 mortes nos Estados Unidos sozinho [1], [3], [4]. LC é uma doença extremamente heterogêneo. Suas duas formas principais são não-pequenas LC células (NSCLC) e LC de pequenas células, entre as quais NSCLC é a forma mais comum que responde por cerca de 85% dos novos casos diagnosticados [1], [4].

anormalidades genéticas ligaram múltiplos genes e vias de sinalização para NSCLC, incluindo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) família, transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 (Stat3) e fosfatidilinositol 3-quinase

–

vias Akt-mTOR [ ,,,0],1], [2], [4]. Estas descobertas conduziram a terapias específicas unicamente com inibidor específico drogas, tais como gefitinib e erlotinib para mutações de EGFR em [5] ou Crizotinibe para a translocação do gene, resultando em que o oncogene EML4-ALK [6]. variações epigenéticas também estão ligados a NSCLC [7], [8]. Embora seu diagnóstico e tratamento está evoluindo rapidamente, melhorias significativas nos resultados para a maioria dos pacientes com NSCLC ainda são tímidas [1], [3]. tumores metastáticos mais agressivas muitos pacientes de recaída e formam [9]. Assim, uma compreensão mais profunda das origens e os mecanismos moleculares da metástase da doença é urgentemente necessária, a fim de melhorar a prevenção e tratamento.

A esfingosina 1-fosfato (S1P) é uma molécula de sinalização bioativo potente que desempenha um papel vital em diversos processos fisiológicos e patológicos, como a imunidade e câncer [10], [11], [12], [13]. Ele promove o câncer, regulando a proliferação de células /sobrevivência, migração, angiogênese e linfangiogênese [10], [14], [15]. Uma das enzimas que gera S1P, esf ingosina-quinase 1 (SphK1) (Fig. 1A), é considerada como uma enzima oncogénica, cuja actividade pode ser estimulada por uma grande variedade de agonistas, e.g. hormônios e fatores de crescimento [16], [17]. Por outro lado, a enzima que degrada a S1P, S1P-liase 1 (SGPL1) (Fig. 1A), é sub-regulada no cancro da próstata [17]. O silenciamento de SGPL1 aumenta a sobrevivência das células; e expressão SGPL1 aplicada sensibiliza células para a irradiação ou quimioterapia [17]. Além disso, muitos aspectos das vias de sinalização de S1P está intimamente relacionado com a tumorigénese (Fig. 1A) [10], [18]. S1P extracelular exerce a maior parte da sua função através de cinco superfície celular acoplados a proteína G os receptores de S1P1 S1P5-[10]. Estimula diferentes vias de transdução de sinal em diferentes tipos de células, bem como dentro da mesma célula, dependendo dos receptores expressos. Por exemplo, S1P1 é acoplado exclusivamente

através

proteína Gi para activar Ras, a proteína quinase activada mitogénio (MAPK), PI3K /Akt, e fosfolipase C vias [10], [19]. O S1P intracelular, por outro lado, promove a progressão do cancro de um modo independente do receptor [11], [12], por qualquer mediar a libertação de cálcio a partir do retículo endoplasmático, ou por interacção com os seus alvos intracelulares, tais como TNF e HDAC receptor- fator associado 2 (TRAF2) [20]. Mais importante ainda, a S1P elevação tem sido implicado como um factor de risco para LC em um estudo epidemiológico [21]

(A), uma representação esquemática do metabolismo e função S1P, SGPP, S1P fosfatase.; SPHK, esf ingosina-quinase; SGPL, S1P liase; ervilha, fosfoetanolamina. (B), análise por Western blot da expressão Spns2-EGFP detectado por um anticorpo anti-GFP. β-actina (actina) foi utilizada como um controlo de carga. As células A549 foram transfectadas com Spns2-EGFP e os lisados ​​celulares recolhidos 48 horas mais tarde. O peso molecular de Spns2-GFP é de cerca de 84 kD (58 + 26; seta). (C), a expressão Spns2 aumento do nível extracelular de S1P, esfingosina (SPH), e dihydrosphingosine (dhSph). As células foram mudadas para meio com FBS delipidadas 24 horas após a transfecção. Mais 24 horas mais tarde, o meio foi recolhido e centrifugado, e o sobrenadante analisado por lipidomics. (D), Time Lapse imagens de células positivas Spns2. As células A549 foram transfectadas com Spns2-EGFP como em A. 12-16 horas mais tarde, as células foram colocadas numa câmara ambiental que mantém a 37 ° C e 5% de CO

2 e imagens de lapso de tempo tomadas em pontos de tempo indicados. barra de escala é de 10 mm. (E), confocal digitalizar imagens a laser de células imuno-coradas com ativa (clivada) caspase 3 (CASP3). As células A549 foram transitoriamente transfectadas, fixadas e coradas com um anticorpo contra CASP3 clivado. A barra de escala representa 20 um.

S1P é gerado intracelularmente por SphKs e o seu nível celular é mantida por um equilíbrio aperfeiçoá-lo entre a geração, conversão, a degradação, e exportação (Fig. 1A). S1P é exportado para fora das células por proteínas transportadoras (Fig. 1a). Vários de ligação de ATP da cassete (ABC) membros da família, tais como ABCA1, ABCC1, e ABCG1 têm sido propostos para o transporte de S1P com base em observações de que o knockdown ou inibição farmacológica de libertação diminuição S1P [22], [23], [24], [ ,,,0],25], [26]. No entanto, esta noção permanece controversa desde S1P exportação não é alterada quando estas proteínas são exogenamente expressa em células ou nocauteado em ratos [18], [27], [28]. Recentemente, solteirona homólogo 2 (Spns2), um membro da grande superfamília facilitador de transportadores não-dependentes de ATP, foi mostrado para o transporte de S1P ambos

in vitro

e

in vivo

[27 ], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. Mais interessante, embora reduzida no plasma, os níveis de S1P são aumentados em alguns tecidos, incluindo pulmão em ratinhos deficientes em Spns2 [33], o que é consistente com um relatório anterior que mostra que Spns2 é expressa mais abundantemente no pulmão humano [18].

Estas descobertas anteriores levaram-nos a hipótese de que Spns2 está envolvido no desenvolvimento LC. Temos realizada ganho-de-função e experiências de perda de função em células NSCLC. Nós também detectaram níveis de expressão de Spns2 em amostras de pacientes LC.

Materiais e Métodos

Materiais

Os anticorpos contra fosfo-GSK-3β (Ser 9), a GSK-3β, fosfo-Stat3, Stat3, caspase 3 clivada e Survivina foram de Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). Os anticorpos contra o FIA e β-actina foram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). O anticorpo contra LC3B foi de Abcam (Cambridge, MA). O anticorpo contra SphK2 foi de Exalpha Biologicals (Dublin, OH). A marcação fluorescente de inibidores de caspases (FLICA) kit era de Imunoquímica Technologies (Bloomington, MN). SPHK inibidor Ski-1 era de Biovision (Milpitas, CA). A panela de inibidor de caspase z-VAD foi da Promega (Madison, WI). O inibidor de PI3K LY294002 foi de Cayman (Ann Arbor, MI). E o inibidor de Jak JAKI foi de Millipore (Billerica, MA). tempo real matrizes LC humanos PCR eram de Origene (Rockville, MD).

Métodos

plasmídeo de clonagem.

SPNS2 humano foi amplificado por PCR a partir de um BAC usando primers hSpns2forward: AAG CTT ATG TGC CTG GAA TGC GCC TCG, e hSPns2reverse: GGT ACC AA GAC TTT CAC AGA TGC GGG CGG; e foi subclonado em pGEM vector Teasy (Promega, Madison, WI). O fragmento foi digerido com as enzimas HindIII e KpnI e clonados em pEGFP-N1 vector (Clontech, Mountain View, CA), resultando na pSPNS2-EGFP construir. Para HA marcado Spns2, primers contendo o marcador de HA foram concebidos. O produto de PCR foi clonado em pcDNA3.1 (Vida Tech., Carlsbad, CA, EUA) semelhante ao pSPNS2-EGFP.

Cultura celular e tratamento.

O NSCLC humano e linhas de células A549 H1299 (ATCC, Manassas, VA) foram generosos presentes de Dr. Zhonglin Hao, Cancer Center, Georgia Regents University. As células epiteliais primárias humanas braquial (HBEpC) eram de ATCC (Manassas, VA). As células A549 e as células H1299 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Cellgro, Herndon, VA, EUA) contendo 10% de FBS (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Austin, TX), e Pen /Strep (Vida Tech.). HBEpC foram mantidos de acordo com as instruções do fabricante. A transfecção de siRNAs Spns2 foi realizada por qualquer Lipofectamine 2000 de acordo com as instruções do fabricante (Life Tech.), Ou a electroporação utilizando um Nucleofactor (Lonza, Allendale, NJ).

tempo células vivas lapso de imagem, imunocitoquímica, e confocal a laser microscopia.

imagens de células vivas foi realizada seguindo os procedimentos publicados anteriores [35], [36], [37], [38]. Resumidamente, as células foram transfectadas com Spns2-GFP. Dezasseis horas mais tarde, a cultura foi colocado em um Live micrografias câmara de imagem celular e contraste de fase tomadas a cada 30-60 minutos com uma Nikon Eclipse TE300 (Nikon Instruments, Inc., Melville, NY, EUA. Para imunocitoquímica e microscopia confocal laser, o células fixas foram imunocoradas com anticorpos cotadas e as imagens tiradas usando um laser confocal microscópio de varredura Zeiss LSM510 equipado com um laser de argônio dois fótons a 488 nm (Cy2), 543 nm (Cy3) e 633 nm (Cy5, Alexa Fluor 647), respectivamente . LSM 510 Meta 3.2 software foi utilizado para aquisição de imagem. Adobe Photoshop CS4 foi utilizado para a redução de fundo e de edição. as imagens obtidas com o anticorpo secundário, só foram usados ​​como controlos negativos representam a intensidade de fundo de um canal de laser particular. imunomarcação específica de antigénio foi quantificada por células que mostraram sinais duas vezes, ou mais, acima do fundo de fluorescência contagem.

extracção de ARN, a RT-PCR, e qPCR.

o ARN foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen). A primeira cadeia de ADNc foi gerado pelo kit de síntese de ADNc iScript (BioRad, Hercules, CA, EUA). qPCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green /qPCR Rox Master Mix num PTC-200 Gradiente Cycler equipado com um detector fluorescente contínua chromo 4 (BioRad). Os primers para qPCR foram: hSpns2 humana para a frente: TTA CTG GCT CCA GCG TGA, hSpns2 reversa: TGA TCA TGC CCA GGA CAG; hPOLR2A frente: GGGTGGCATCAAATACCCAGA; hPOLR2A reversa: AGACAC AGCGCAAAACTTTCA; hSphK1 frente: GGC TGC TGT CAC CCA TGA A, hSphK1reverse: TCA CTC TCT AGG TCC ACA TCA G; hSphK2 frente: AGC GTG GTA GCC ACT TCA G, hSphK2 reversa: GAG CAG TGT ACC GAT GCC A; hSGPP1 frente: ATC ATC ATC GGG CTT CAT TTA GC, hSGPP1reverse: GTG CTC CAG GTG TCA AGA GT; hSGPP2 frente, TCA C CG CAC TCC TCA TCG T, hSGPP2 reversa: CCG GGT TGG GCT GTA GTA ATC; hSGPL1 frente: CCT AGC ACA GAC CTT CTG ATG T, hSGPL1 reversa: ACT CCA TGC AAT TAG CTG CCA; hABCA1 frente: TTA AAC GCC CTC ACC AAA GAC, hABCA1reverse: AAA AGC CGC CAT ACC TAA ACT; hABCC1 frente: TTA CTC ATT CAG CTC GTC TTG TC, hABCC1reverse: CAG GGA ATT GGG TCG TGG AT; hABCG1 frente: ACT GCA GCA TCG TGT ACT GGA, hABCG1reverse: CGT CTC GTC GAT GTC ACA GTG; hABCG2 frente: TGA GCC TAC AAC TGG CTT AGA, hABCG2 reversa:. CCC TGC TTA GAC ATC CTT TTC AG

ensaios

viabilidade celular e morte celular

ensaios de proliferação e apoptose foram realizadas com A549. e células H1299 transf ectadas com hSPNS2-EGFP ou HA-Spns2 como descrito anteriormente [39], [40], [41]. O número de células vivas foi medida por um leitor de microplacas usando o Kit-8 (CCK8) Contagem celular (Dojindo Molecular Technologies, Inc, que é baseada na actividade de desidrogenase em células viáveis). Resumidamente, a solução CCK8 foram adicionados à cultura de células tratadas, incubadas durante 2-4 horas, e a sua absorção no comprimento de onda de 450 nm lida por um leitor de microplacas. A absorção a 450 nm foi correlacionada com o número de células vivas presentes no poço. O ensaio foi realizado com FLICA células A549 transf ectadas com o plasmídeo Spns2-EGFP utilizando inibidor marcado com sulforodamina cetona fluorometilo péptido (vermelho) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 48 horas pós-transf ecção com os plasmídeos Spns2-EGFP, o reagente FLICA foi adicionado ao meio e as células foram incubadas durante 1 hora a 37 ° C sob 5% de CO

2. As células foram lavadas uma vez com solução de lavagem e, em seguida, fixadas com 4%

P

-formaldehyde em fosfato salino tamponado para posterior análise por microscopia.

análise de citometria de fluxo.

Spns2 -GFP transfectadas células A549 foram colhidas, fixadas em 4% de paraformaldeído, e imuno-3 marcado com anticorpo caspase seguido de Alexa Fluor 555 anticorpo secundário. As células marcadas foram analisadas por um Becton Dickinson FACSCalibur analisadores de 4 cores equipadas com 4 lasers (BD Biosciences, San Jose, CA).

ensaios de migração celular.

A migração celular foi medida pela ferida Os ensaios de cura, tal como publicado anteriormente [42]. Resumidamente, as células foram transfectadas com ARNsi Spns2 ou mexidos controlo por Lipofectamine 2000. As células foram cultivadas durante 72 horas, altura em que se haviam tornado confluentes. Uma diferença de cerca de 400 um foi gerado por uma ponta de pipeta. A largura da fenda foi medido em diferentes pontos de tempo. Para o tratamento Ski-I, 10 mM Ski-I foi completado 24 horas após siRNA transfecção. As células foram cultivadas por mais 48 horas e, em seguida, ensaio realizado.

esfingolípido e S1P medição.

Células transfectadas com ARNsi Spns2 Spns2 ou foram cultivadas durante 48 horas e, em seguida, ambos os sedimentos celulares foram recolhidos e meios . As pelotas de células foram lavadas três vezes com PBS frio. Os meios de cultura foram centrifugadas durante 10 minutos a 4 ° C para remover as células flutuantes e os detritos celulares. níveis de S1P em células e meios de cultura foram medidos no Lipidomics núcleo da Medical University of South Carolina (sob a supervisão do Dr. Jacek Bielawski) de acordo com protocolos publicados em um triplo espectrómetro de massa quadrupolo ThermoFisher TSQ Quantum, operando em um monitoramento de reações múltiplas (MRM) o modo de ionização positivo, utilizando a versão modificada [43]. Resumidamente, os sedimentos celulares ou mídia correspondente a cerca de 2-3 × 10

6 células, foram enriquecidos com as normas internas (ISS: C

17 de base D-eritro-esfingosina (17CSph), C

17 esfingosina -1-fosfato (17CSph-1P), N-palmitoil-D-eritro-C

13 esfingosina (13C16-Cer) e heptadecanoílo-D-eritro-esf ingosina (C17-Cer)), e extraiu-se com acetato de etilo /iso-propanol /água (60/30/10 v /v) como sistema solvente. Após a evaporação e a reconstituição em 100 ul de amostras de metanol foram injectados no sistema /TSQ Quantum LC /MS e gradiente HP1100 eluída da BDS Hypersil C8, 150 × 3,2 milímetros, 3 uM de partícula coluna de tamanho, com 1,0 mM de formato de amónio em metanol /2 sistema de fase móvel aquosa de formato de amónio mM. Os picos correspondentes aos analitos alvo e os padrões internos foram recolhidos e processados ​​usando o sistema de software Xcalibur. A análise quantitativa foi baseada nas curvas de calibração obtidas pela adição de uma matriz artificial com as quantidades conhecidas dos padrões sintéticos alvo de analitos e uma quantidade igual de padrões internos (ISS). O alvo analito /IS rácios de áreas de pico foram plotados contra a concentração de analito. O analito alvo /IS proporções de áreas de pico a partir das amostras foram normalizadas de modo semelhante ao respectivo ISS e em comparação com as curvas de calibração, utilizando um modelo de regressão linear. Outros esfingolipídeos, como a ceramida e esfingosina, também foram analisadas.

Estatísticas.

As médias e desvios-padrão foram calculados pelo Microsoft Excel. A significância estatística foi calculada usando uma maneira de variância e teste de Tukey ou repetida medida ANOVA com GraphPad Prism. P 0,05 é considerado significativo células

Resultados

A expressão ectópica Spns2 induz a morte celular nas células NSCLC

para estudar a função de Spns2 na LC, usamos NSCLC.. Em primeiro lugar, tentou estabelecer uma linha de células A549 que expressam EGFP-Spns2 estável, mas não foi obtida a tal linha (dados não mostrados). Assim, nós nos concentramos em expressão transitória de Spns2. A análise de Western blot utilizando um anticorpo anti-GFP Spns2 indicou que foi expressa como uma proteína de fusão ~84 kD (58 kD + 26 kD; seta, Figura 1B.). Para assegurar que o ectópica expressa Spns2 era funcional, medimos seja transportado S1P. dados Lipidomics mostrou que o nível de S1P no meio de cultura foi aumentado de 5,6 ± 0,55 de dobragem (Fig. 1C), consistente com relatos anteriores [29], [31], [32], [33], [34], e confirmando que o Spns2 transfectadas foi totalmente funcional. Interessantemente, os níveis extracelulares da esfingosina (SPH) e dihydrosphingosine (dhsph) foram também aumentadas em 1,5 e 2,8 vezes, respectivamente (Fig. 1C), o que implica que Spns2 pode transportar estes dois esfingolípidos bem. Diferentes espécies de ceramida foram testados, mas nenhum mostrou uma diferença significativa quando comparado ao grupo controle (Fig. S1A).

Em seguida, investigou as funções celulares de Spns2 em células A549. imagem de células vivas mostraram que as células Spns2 passou por mudanças morfológicas drásticas e separadas dos pratos de cultura de células (setas na Fig. 1D), sugerindo morte celular por apoptose. Assim, imuno-rotulados as células com um anticorpo de detecção activada (clivada) da caspase 3 (CASP3) (Fig. 1E). análise quantitativa duplo-cego indica que 34,2 ± 9% de células positivas foram Spns2 CASP3 positiva (Fig. 1E e 2A). Esta indução de CASP3 foi confirmada por análise de transferência de Western e citometria de fluxo; e bloqueado por um inibidor de caspases Z-VAD panela (Figs. 2B, S1B e S1C). Indução de CASP3 foi reproduzida por expressão de HA-Spns2 que tem uma etiqueta mais pequena (não representada). Em linha com a activação Casp 3, o gene da Survivina anti-apoptose foi significativamente reduzida (Fig. 2B) [36], [44]. factor de indução de apoptose (AIF) e LC3B clivado também foram medidos, mas nenhum foi aumentada pela expressão Spns2 (Fig. 2B), o que sugere que Spns2 não induz a apoptose independente de caspase ou autofagia.

(A), Quantificação de células positivas CASP3 mostrados em D. Veículo (pEGFP) células transfectadas foram usadas como controlo (Con). N 100 células são contadas a partir de três experiências separadas. (B), análises de Western blot para marcadores de morte celular. As células A549 foram transfectadas transientemente como em A. Os lisados ​​celulares foram recolhidos e colocados a hibridar com os anticorpos indicados. Veículo (pEGFP) células transfectadas foram usadas como controlo negativo e actina foi utilizado como um controlo de carga. (C), Imagens representativas de FLICA coloração de células positivas Spns2. As células A549 vivas foram incubadas com FLICA durante 1 hora 48 horas após a transfecção. As células foram fixadas e imagens microscópicas tomadas. barra de escala é de 10 mm. (D), A quantificação de células positivas FLICA mostrados em C. N 100 células a partir de três experiências separadas foram contadas dupla cega. (E), expressão Spns2 reduzido número de células viáveis ​​em células A549. As células foram transfectadas como em A. 48 horas mais tarde, o número de células vivas relativa foi medida por um kit de CCK-8, utilizando um leitor de microplacas. N = 4. (F), a expressão Spns2 reduzido número de células em células H1299. Vive número de células H1299 foram medidos como em I. N = 4. No B, E, H, I, J, barras de erro representam SD, *, p 0,05, **, p 0,01

Para validar ainda que Spns2 apoptose induzida, foi realizada FLICA (fluorescente inibidor marcado de caspases pan) ensaios em células vivas. A Figura 2C mostra imagens micrográficas típicos do ensaio. quantificação duplo cego demonstrou que 70 ± 15,9% de células positivas foram Spns2 FLICA positiva (Fig. 2D).

Um resultado final de morte celular é a redução no número de células viáveis ​​total. de contagem de células imparcial utilizando um leitor de microplacas (CCK-8) indicaram que a expressão Spns2 resultou na redução de 59 ± 1,2% de células A549 viáveis ​​em 48 horas (Fig. 2E). Estes resultados foram reproduzidos em outra linha celular NSCLC H1299 (Fig. 2F).

Em conjunto, os dados acima demonstram que a expressão ectópica Spns2 induz apoptose dependente da caspase em células NSCLC.

expressão Spns2 modula o metabolismo S1P

Nós mostramos que a expressão Spns2 transportados S1P fora das células (Fig. 1C). Interessantemente, os níveis celulares de S1P, esfingosina, ceramidas e diferentes espécies não foi significativamente alterada pela expressão Spns2, excepto dhSph e cadeia longa C20:1were ceramida aumentou cerca de 2,0 e 1,4 vezes, respectivamente (Fig. 3A e não mostrado).

(a), a expressão Spns2 não alterou o nível intracelular de S1P. As células A549 foram mudadas para meio com FBS delipidadas 24 horas após a transfecção. Mais 24 horas mais tarde, as células foram recolhidas, lavadas e analisadas por níveis lipídicos lipidomics. (B), a expressão Spns2 levou a um aumento agudo da SphK1 em células A549. As células foram transfectadas, ARNm recolhido, e em tempo real qRT-PCR realizada para medir SphK1. (C), a expressão Spns2 levou a um aumento agudo da SphK2. As células A549 foram tratadas como em B, excepto que qRT-PCR realizada para medir SphK2. (D), expressão Spns2 levou a uma redução de SGPP1 em células A549. As células foram tratadas como em B, excepto que qRT-PCR realizada para medir SGPP1. (E), expressão Spns2 reduzida receptores S1P. As células foram tratadas como em B, excepto que qRT-PCR realizada para medir S1P1, S1P2, S1P3 e. N = 3. As barras de erro representam DP. *, P 0,05, **, P 0,01. Os dados foram normalizados para GAPDH.

Para delinear o mecanismo metabólico subjacente, analisamos as enzimas-chave no metabolismo dos esfingolípidos por PCR em tempo real quantitativo (qPCR). Ambos SphK1 e ARNm SphK2 foram significativamente elevados dentro de 24 horas de transfecção Spns2, e voltaram aos níveis normais por 48 horas (Figs. 3B e 3C). Aumento de expressão SphK2 foi confirmada por análise Western Blot, excepto que o seu nível de proteína permaneceu a um nível alto em relação ao mesmo 48 horas após a transfecção Spns2 (Fig. S1D). Isto é razoável, já que as proteínas em geral demoram mais tempo para se degradar de mRNA. S1P fosfatase 1 (SGPP1), a enzima que desfosforila S1P, foi drasticamente reduzido para 8,5% do nível de controlo no prazo de 24 horas, e manteve-se baixa até 48 horas após a transfecção (Figs. 3D e s1e). SGPP2 e S1P liase 1 (SGPL1) não foram significativamente afetadas pela expressão Spns2 (Fig. S1E-S1F). Estes dados indicam que as células de alterar os níveis de múltiplas enzimas chave de expressão para compensar S1P exportação mediada por expressão Spns2, incluindo aumentar a geração (aumento em SphKs) bem como a conversão de parada (redução SGPP1).

expressão Spns2 leva à redução dos receptores de S1P e múltiplas vias pró-sobrevivência

Como mencionado anteriormente, S1P é geralmente um fator pró-sobrevivência. Para entender por que a apoptose foi induzida quando o S1P extracelular foi aumentada após Spns2 transfecção, foram detectados os níveis de receptores S1P e descobriu que os níveis de mRNA de receptores S1P1, S1P2 e S1P3 foram significativamente regulada para baixo após expressão Spns2 (Fig. 3E ).

Para confirmar esta observação, determinou-se a célula vias a jusante desses receptores S1P sinalização. expressão Spns2 levou a uma redução drástica das fosfo-GSK-3β (pGSK-3β, serina 9) em ambos A549 e células H1299 (Figs. 4A e 4B). Para validar esta observação, nós ensaiada activador a montante da GSK-3β Akt [35], [45]. As Figuras 4A e 4B demonstram que os níveis de pAkt foram reduzidos por expressão Spns2, indicando que Spns2 prejudica a via PI3K /Akt. Jak /Stat3 via, uma outra via de sinal a jusante dos receptores S1P, desempenha papéis cruciais na sobrevivência celular, migração, e a resposta imune [46], [47]. Nós determinado se Spns2 afecta esta via medindo a actividade Stat3. As análises Western blot revelaram que os níveis de fosfo-STAT3 (pStat3) foram grandemente reduzida pela expressão Spns2 em ambas as linhas celulares (Fig. 4A e 4B). CASP3 foi activada por Spns2 em células H1299 o que é consistente com os dados obtidos a partir de células A549 (Fig. 4B). A seguir, imuno-rotulados Spns2-EGFP células transfectadas com anticorpos contra pGSK-3β e pStat3 e descobriram que os seus sinais de fluoresccia foram significativamente reduzidos em todas as células da mesma cultura, se Spns2 positivo ou negativo, quando comparado com células de controlo GFP transfectadas ( con) (Figs. 4C e 4D). Isto é provavelmente devido a acumulação extracelular de esfingolípidos, tais como Sphl. Mais interessante, o sinal fluorescente para pGSK-3β foi ainda mais reduzida em células Spns2-GFP do que as células não transfectadas (setas na Fig. 4C). Estes dados confirmam que estas vias pró-sobrevivência foram comprometidos quando Spns2 foi expresso ectopicamente.

(A), análises de Western blot em amostras de células A549. As células A549 foram transfectadas de forma transiente e lisados ​​recolhido 24 e 48 horas mais tarde e testados com os anticorpos indicados. pGSK, fosfo-GSK-3β; TGSK, o total de GSK-3β; pAkt, fosfo-Akt; pStat3, fosfo-Stat3; tStat3, Stat3 total; Actina foi utilizado como um controlo de carga. (B), análises de Western blot em amostras de células H1299. células H1299 foram transfectadas transientemente como mencionado anteriormente. Os lisados ​​celulares foram recolhidos 48 horas mais tarde e testados com os anticorpos indicados. (C), de laser confocal de varredura imagens de células coradas para pGSK-3β. As células A549 foram transfectadas com Spns2-GFP e lamelas recolhidos após 48 horas. (D), confocal digitalizar imagens a laser de células A549 coradas para pStat3. As células foram preparadas como em C.

Spns2 knockdown aumenta o nível de S1P intracelular

Os dados acima referidos demonstram que Spns2 regula o metabolismo de S1P e a sua expressão ectópica conduz a apoptose em células NSCLC. Para dissecar ainda mais o papel do Spns2 na LC, nós derrubado Spns2 por siRNA. As Figuras 5A e 5B mostram que o siARN Spns2i-A reduziu significativamente o nível de ARNm Spns2 por mais do que 80%. Assim, utilizou-se Spns2i-A nos nossos estudos posteriores. RNA mexidos (SCR) e Spns2i-C (doravante SPC), que não suprimiu a expressão Spns2, foram utilizados como controles negativos.

(A), (B), Caracterização de Spns2 siRNAs. 20 nM de ARNsi Spns2 A, B, e C foram transfectados individualmente em células A549. 48 horas mais tarde, o ARN total foram recolhidas e RT-PCR (A) e qRT-PCR (B) realizada para medir Spns2. ARN codificado (SCR) foi utilizado como um controlo negativo. (C), por Spns2 knockdown-A Spns2i significativamente aumento do nível intracelular de S1P. As células A549 foram transfectadas com ARNsi Spns2 como em A, 24 horas após a transfecção, o meio de cultura de células foram mudadas para meio com FBS a deslipidado. Mais 24 horas mais tarde, os sedimentos celulares foram recolhidos e analisados ​​por S1P lipidomics. N = 3. (D), Spns2 knockdown altera os níveis de SGPP1, SGPP2, e SGPL1. As células A549 foram tratados como em A, com excepção de qRT-PCR foi realizado para medir SGPP1, SGPP2, e SGPL1. N = 4. Os dados qPCR foram normalizados para GAPDH.

Para caracterizar o efeito de Spns2 knockdown no metabolismo dos esfingolípidos em células NSCLC, determinou-se os níveis de esfingolípidos e os de suas enzimas relacionadas. Lipidomics dados mostra que Spns2 knockdown por Spns2i-A aumentou significativamente o nível de S1P intracelular, enquanto que o nível Sph reduzida, em células A549 quando comparado com Scr e SPC (Figs. 5C e S2A). Os níveis de diferentes espécies de ceramida não foram alterados pela Spns2 knockdown (Fig. S2B). Isto é consistente com um relatório anterior que a deficiência de S1P em ratinhos conduz a um aumento do nível de S1P no pulmão [33]. A fim de analisar o mecanismo de aumento de S1P celular, foram medidos os níveis de enzimas importantes no metabolismo de S1P. Figura 5D mostra que os níveis de múltiplas enzimas foram alteradas após Spns2 knockdown por Spns2i-A: SGPP1 foi significativamente aumentou 8 vezes; SGPP2 foi reduzido em -50%; e SGPL1 foi reduzida em mais de 80%. Aumento em SGPP1 irá acelerar a conversão de S1P para reduzir o nível de S1P celular, que irá ser contrariada por redução SGPP2 e aumento SGPL1. No entanto, SGPL1 foi muito mais abundantemente expresso de SGPP1 em células A549 (22 vezes mais elevado) (Fig. 5D). Isso explica por que S1P aumentou após Spns2 knockdown. Outras enzimas, tais como SphKs, não foram significativamente afectados pela Spns2 knockdown (Fig. S2C e S2D).

Spns2 knockdown reforça o papel do células NSCLC migração

Funcionalmente, examinamos primeiro Spns2 knockdown no celular sobrevivência /proliferação vez que a expressão ectópica Spns2 apoptose induzida. ensaios ao vivo de contagem de células concluiu que Spns2 knockdown com Spns2i-A, não resultou num aumento significativo no número de células viáveis ​​em qualquer células H1299 (não mostrado) A549 ou, indicando que Spns2 regulação negativa não afecta a sobrevivência ou proliferação das células em células NSCLC.

em seguida, examinaram o papel de Spns2 knockdown sobre a migração celular desde S1P intracelular é essencial para migração de células do pulmão e motilidade [48]. ensaios de raspar a cicatrização de feridas foram realizadas com ambas as células A549 e células H1299. Quatrocentos mm lacunas foram gerados em culturas confluentes e imagens microscópicas tomadas em 8 e 24 horas após a coçar. A Figura 6A mostra imagens típicas do ensaio em células A549. análises quantitativas cegas duplas mostrou que as células de controlo A549 (SCR) migrou a uma velocidade de 8,0 ± 1,5 um /h e 5,4 ± 0,8 um /h durante o período de 8 e 24 horas, respectivamente (células SPC tem um resultado semelhante) (fig. 6B). No entanto, as células migraram knockdown Spns2 a uma velocidade de 14,9 ± 3,1 uM /h e 10,0 ± 0,3 pm /h, no mesmo período de tempo, o que representa um aumento de 1,86 vezes e 1,85, respectivamente (Fig. 6B). Esta observação foi replicado em células H1299 (Fig. 6C).