Abstract
DLC2 (excluído no cancro do fígado 2), uma proteína Rho GTPase-activating, foi previamente mostrado para ser underexpressed no carcinoma hepatocelular humano e tem funções supressoras tumorais em modelos de cultura de células. Geramos ratos DLC2 deficiente para investigar o papel supressor de tumor de DLC2 na hepatocarcinogênese e a função de DLC2 in vivo. Neste estudo, verificou-se que, ao contrário DLC1 homóloga, que é essencial para o desenvolvimento embrionário, DLC2 era dispensável para o desenvolvimento embrionário e ratos DLC2 deficiente poderia sobreviver até a idade adulta. Nós também não observamos uma maior incidência de formação de tumores do fígado ou dietilnitrosamina (DEN) hepatocarcinogênese induzida em ratos DLC2 deficiente. No entanto, observou-se que os ratos DLC2 deficientes eram menores e tinham menos tecido adiposo do que os ratinhos de tipo selvagem. Estes fenótipos não eram devidas a redução do tamanho da célula ou defeito em a adipogénese, como observado no modelo de ratinho deficiente em RhoGAP 190B. Juntos, estes resultados sugerem que a deficiência em DLC2 sozinha não melhora hepatocarcinogênese
Citation:. Yau TO, Leung THY, Lam S, Cheung DE, Tung EKK, Khong PL, et al. (2009) Excluídos no cancro do fígado 2 (DLC2) era dispensável para o Desenvolvimento e sua deficiência Será que não a agravar hepatocarcinogênese. PLoS ONE 4 (8): e6566. doi: 10.1371 /journal.pone.0006566
editor: Alfred Lewin, da Universidade da Flórida, Estados Unidos da América
Recebido: 07 de abril de 2009; Aceite: 10 de julho de 2009; Publicação: 10 de agosto de 2009
Direitos de autor: © 2009 Yau et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O estudo foi financiado por subvenções para pesquisa Fundo Hong Kong Conselho Geral de Investigação (HKU 7436 /04M) e RGC Fund Research Collaborative (HKU 1 /06C). I.O.L. Ng é Loke Professor Yew em Patologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o carcinoma hepatocelular (HCC) é um tumor maligno primário e é um dos cancros mais comuns na Ásia e África. A infecção com hepatite B ou C e vírus da exposição a aflatoxina B1, tem sido bem documentado como as principais causas. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes que conduzem ao desenvolvimento e progressão do HCC permanecem obscuros.
A inactivação de genes supressores de tumor é uma característica das células cancerosas. Em busca de supressores tumorais envolvidos na hepatocarcinogênese, identificou um novo gene
DLC2
(excluído no cancro do fígado 2) em 13q12.3 região cromossômica, que é frequentemente perdido no HCC [1]. Semelhante ao seu homólogo DLC1, DLC2 é underexpressed no HCC humana e tem funções supressoras tumorais em células cultivadas [1], [2].
DLC1 e DLC2 são Rho GTPase-activating proteínas (GAPs). Eles têm três domínios funcionais, um domínio RhoGAP catalítica [1], [3], um motivo alfa estéril (SAM) de domínio de interação proteína [4], [5] e um (START) de domínio lipídico de transferência relacionados com a StAR de ligação de lípidos [6], [7]. As GTPases da família Rho tem 18 membros, incluindo os três representantes bem estudadas, Rac1, RhoA, e Cdc42. Estas GTPases pequenas regular várias vias de sinalização celulares [8], [9]. Tem sido sugerido que as proteínas Rho desempenham papéis importantes na transformação oncogénica mediada por Ras e outras oncoproteínas regulando actina organização do citoesqueleto, a proliferação celular e sobrevivência celular [10], [11]. Além disso, eles estimulam a invasão da célula tumoral e metástase [9]. Rho GTPase-activating proteínas (GAPs) inativar-los, convertendo o estado ligada a GTP activa para o meio da ativação da atividade GTPase intrínseca de proteínas Rho ligada a GDP inactiva. BPA tem, portanto, sido sugerido para ser supressores de tumor que neutralizam o potencial oncogénico de proteínas Rho.
Houve várias linhas de evidência in vitro para suportar o papel de supressor de tumor estas duas proteínas Rho GAP, DLC1 e DLC2 [ ,,,0],1], [2], [3], [5], [12], [13], [14], [15], [16]. Os modelos animais que possam ser exploradas para investigar as funções de supressor de tumor de estas duas proteínas são ainda limitadas. Durkin et ai. [17] tem gerado um modelo de ratinho deficiente em DLC1 para estudar as funções biológicas de DLC1. No entanto, a deficiência de DLC1 leva a letalidade embrionária por midgestation. Sordella et al [18] mostraram que os embriões falta p190B RhoGAP eram cerca de 30% menor em tamanho e forneceu evidências que sugerem que esta redução no tamanho do embrião foi devido à redução no tamanho da célula. Eles também demonstraram que os fibroblastos embrionários de murídeo derivados destes embriões eram defeituosos em adipogénese, quando comparado com o tipo selvagem correspondente [19].
Neste estudo, foram gerados ratinhos deficientes em DLC2 para investigar as funções biológicas dos DLC2 e o seu papel na hepatocarcinogenese in vivo. Ao contrário do modelo knockout DLC1, DLC2 era dispensável para o desenvolvimento embrionário e ratos DLC2 deficiente poderia sobreviver até a idade adulta. camundongos DLC2 deficiente não mostrou maior incidência de hepatocarcinogênese ou dietilnitrosamina (DEN) hepatocarcinogênese induzida. No entanto, os ratinhos deficientes em DLC2 foram significativamente menores e tinham menos tecido adiposo do que os ratinhos de tipo selvagem. Análise da adipogênese de DLC2 deficientes e tipo selvagem fibroblastos embrionárias de murino não apresentou diferença significativa entre eles. Além disso, não observamos qualquer diferença significativa no tamanho da célula entre o tipo imortalizado fibroblastos fase G1 DLC2 deficientes e selvagens com citometria de fluxo.
Materiais e Métodos
Geração de ratos DLC2 deficiente
Um clone PAC contendo o mouse
região DLC-2
genômico foi obtido a partir do Centro Sanger (Cambridge, Reino Unido). Para construir o mouse
DLC-2
gene alvo vetor, um 2.8 kb
Eco
RI /
Bam
fragmento HI, que é 3 ‘ao exão 5, foi clonado
Eco
RI /
Bam
local HI de pPNT (Figura 1a). Um par de iniciadores (para a frente, 5′-ttactcgagttgctgatgcacaggtcttc; reverso, 5′-ttactcgagttctcgtgttaggaatgggg) foi utilizada para amplificar uma região genómica, de 2,7 kb em tamanho e 5 ‘ao exão 5 (Figura 1a). O fragmento foi então clonado no pPNT [20]. O vector de direccionamento foi linearizado com
not * I e foi electroporado para a estaminais embrionárias (ES) linha celular AB2.2 (129s7 /SvEBrd Hprt-b-m2), e as células foram cultivadas em meio de cultura de células ES suplementado com G418 e fialuridina. clones resistentes foram analisados por Southern blot (ver abaixo) para identificar
DLC2
-targeted clones.
(a) Diagrama esquemático para mostrar estratégia de segmentação de genes. caixas pretas, exons do gene de rato DLC2 (números de exão são escritos na parte superior); caixas cinzentas, sequência de ADN do gene de resistência à neomicina da construção de direccionamento; caixa branca, sequência de ADN do gene da timidina-quinase de construção de direccionamento. Restrição sítios de digestão de enzimas: B, BamHI; Bg, BglII; E, EcoRI; N, Ncol; apenas os locais de restrição de diagnóstico são mostradas por simplicidade. (B) análise de transferência de Southern. BglII digestão foi sondado com uma sonda 5 ‘, conforme indicado; tamanhos de bandas de diagnóstico: alelo selvagem, 4,7 kb; alelo alvo, 5,7 kb. NcoI digestão foi sondado com uma sonda 3 ‘, como indicado; tamanhos de bandas de diagnóstico: alelo selvagem, 9,1 kb; alelo alvo, 5,7 kb. (C) a genotipagem de PCR; tamanhos de bandas: alelo selvagem, 414 pb; alelo alvejado, 339 pb. (D) RT-PCR para detectar a expressão DLC2 no coração, fígado e músculo esquelético.
Todas as pesquisas envolvendo o trabalho animal foi aprovado pela Comissão sobre o Uso de Animais Vivos em Ensino e Pesquisa (Culata) da Universidade de Hong Kong. As células a partir destes clones foram injectados em blastocistos C57BL /6N. Quimeras foram acasaladas com camundongos C57BL /6N e descendentes contendo
DLC2
alelo -targeted foram identificados. Ratos com origens genéticas misturadas foram back-cruzadas para C57BL /6N durante pelo menos cinco gerações.
análise de Southern blot, genotipagem PCR e RT-PCR
Para a análise Southern blot, duas sondas, 5 ‘e 3’ externo, foram usadas (Figura 1a).
Bgl
II digestão foi sondado com uma sonda 5 ‘e os tamanhos de bandas de diagnóstico foram 4,7 kb para o alelo selvagem e 5,7 kb para o alelo alvejado.
Nc
oI digestão foi sondado com uma sonda 3 ‘, e os tamanhos de bandas de diagnóstico de 9,1 kb para o alelo selvagem e 5,7 kb para o alelo alvejado.
Dois pares de primers foram utilizado para genotipagem por PCR. Para a detecção do alelo de tipo selvagem, para a frente (5′-AATGGAAGCACCATGTAGCC) e iniciador 5′-AATGGAAGCACCATGTAGCC) inverter foram utilizados, com o tamanho esperado do produto de PCR 414 pb. Para a detecção do alelo alvejado, para a frente (5′-CTGGGAAGACAGGGAACAAA) e foram utilizados iniciadores (5′-GGGGGAACTTCCTGACTAGG), com o tamanho esperado do produto de PCR ser, 339 pb reversa.
para RT- semi-quantitativa análise de PCR, o ARN total foi preparado a partir de tecidos de rato, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen). O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir de 1 ug de ARN total, utilizando hexâmeros aleatórios com o kit GeneAmp RNA PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). Dois ul de cDNA foi então usada para detectar os níveis de expressão
DLC1, DLC2
e
DLC3
utilizando os seguintes iniciadores: Para rato
gene DLC1, iniciador directo (5 ‘- CCCATTCAGTCAGTCCACCTTGA) e iniciador inverso (5’-GAGTCTCCCTCGTCGGAAAAC) foram usados; Para mouse
DLC2
gene, iniciador directo (5′-GATGAGAAACACAGCCAGCA) e iniciador inverso (5′-GTTGGGTATCTGGACGCACT) foram usados; Para
DLC3
, foram utilizados iniciador directo (5′-TCCACAGGCAGCCATGCCAG) e iniciador inverso (5′-TCTTGCTCAAGATCCTGGGCC). condição de PCR foi como se segue: desnaturação a 95 ° C durante 15 min, seguido de 25 ciclos de (
DLC1
e
DLC2
) ou 27 ciclos (
DLC3
) de desnaturação durante 30 seg, emparelhamento a 55 ° C durante 30 seg, com extensão a 72 ° C durante 30 s e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram resolvidos em gel de agarose a 1,2%.
experimento gaiola metabólica
Os ratos foram alojados individualmente em gaiolas metabólicas num 12:12 horas de ciclo escuro-luz e foram alimentados
ad libitum
. A água e o consumo de alimentos e urina e fezes de saída foram medidos durante 2 dias.
dietilnitrosamina (DEN) o tratamento de ratinhos
O protocolo hepatocarcinogenese foi como se segue. O macho de 15 dias de idade,
DLC2
ratinhos knockout homozigóticos e ratinhos do tipo selvagem foram injectados intraperitonealmente com 25 mg /kg DEN em PBS estéril. Com 35 semanas de idade, os ratinhos foram sacrificados e os fígados foram colhidas e examinadas. Os fígados foram então fixadas em 4% de formaldeído em PBS, embebido em parafina e cortada em secções de 4 uM para exame histológico.
Preparação de fibroblastos embrionários de murídeo (MEFs) e estabelecimento de linhas celulares
camundongos grávidas foram sacrificados em 13,5 dias o coito passado (DPC). Os embriões foram dissecados a partir do útero, e as membranas e as vísceras extra-embrionárias foram removidos. Os embriões foram cortados em pedaços pequenos e embebidos durante 30 minutos em 4 ml de 0,25% de tripsina-EDTA à temperatura ambiente. A tripsinização foi inactivada com meio de Eagle modificado por α (aMEM) suplementado com FBS inactivado por calor a 10%, 50 U de penicilina por ml, e 50 ug de estreptomicina por ml. As células foram suspensas por pipetagem e passados através de uma peneira. Os procedimentos padrão foram usados para estabelecer linhas celulares imortalizadas de fibroblastos [21]. Resumidamente, as células foram passadas a cada 3 dias em meio DMEM suplementado com soro de vitelo 10% e antibióticos, a uma densidade de 10
6 células por placa de 10 cm. Mídia foram alteradas no dia seguinte. As linhas celulares imortalizadas estáveis foram estabelecidas após 30 a 50 passagens.
Medição do tamanho das células
Os tamanhos relativos dos
DLC2
+ /+ Comprar e
DLC2
– /-
células foram determinados com citometria de fluxo. Resumidamente, as células foram utilizando FITC BrdU Fluxo Kit (BD Pharmingen ™, NJ, EUA) marcada com BrdU. população de células G1 foi fechado e determinou-se a dispersão de luz frontal (FSC) de 5000 G1-células. FSC foi usada para determinar os tamanhos de células relativos.
A indução da diferenciação dos adipócitos
Para a indução de diferenciação de adipócitos, células MEF foram usados dentro de duas passagens. Indução da diferenciação de adipócitos foi realizada como previamente descrito [19]. As células foram cultivadas em placas de 6 poços e propagado até à confluência. Dois dias mais tarde, o meio foi substituído por meio de indução da diferenciação padrão (α-MEM contendo isobutilmetilxantina 0,5 mM, 1 uM de dexametasona, 5 ug de insulina por ml, 10% de FBS, 50 U de penicilina por ml, e 50 ug de estreptomicina por ml, e o meio foi renovado a cada dois dias. as células foram induzidas durante 8 dias antes da análise
.
as células foram fixadas em formalina a 10%, lavadas duas vezes com tampão fosfato salino (PBS), e coradas com solução de óleo-O vermelho de coloração (0,5% óleo vermelho-O álcool em água destilada para a solução de isopropilo [60:40]) durante 30 min a 37 ° C e, em seguida, lavadas com água destilada três vezes. adipogênese em óleo vermelho-O- manchado MEF foi quantificada através da medição da absorvância de luz a 510 nm após extracção com álcool isopropílico.
Rhotekin ensaio de ligação
as células foram lisadas em 500 ul de tampão de lise contendo Tris 50 mM (pH 7,4 ), MgCl2 10 mM, NaCl 500 mM, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, 0,5% de desoxicolato de sódio, 10 ug /ml de aprotinina, 10 ug /ml de leupeptina, e 1 mM de PMSF. Os lisados foram clarificados por centrifugação a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C, e 500 ug de cada lisado foi incubado com 45 ug de GST-RBD (proteína de fusão GST contendo o domínio de RhoA de ligação de Rhotekin) ligada a glutationa-Sepharose grânulos (Amersham Pharmacia) durante 1 h. Após a ligação, as amostras foram lavadas com tampão de lise por três vezes. As proteínas ligadas foram fraccionados em 12% de SDS /PAGE e imunotransferidas com anticorpo policlonal para RhoA (Santa Cruz Biotechnology). lisado celular total foi também analisada com anticorpo anti-RhoA como um controlo de carga. O nível de RhoA activa foi determinada após normalização com o total de RhoA presente nos lisados celulares.
Imunofluorescência coloração
As células foram cultivadas sobre lamelas e foram lavadas em PBS, fixadas com 4% de paraformaldeído em PBS durante 15 minutos à temperatura ambiente, permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 em PBS durante 5 minutos e bloqueadas com 5% de albumina de soro bovino em PBS. Após lavagem com PBS, as células foram então incubadas com anticorpo de paxilina (Sigma), seguido por anticorpo secundário conjugado a FITC à temperatura ambiente. F-ácinos foram coradas com faloidina-isotiocianato de tetrametilrodamina B marcada (Sigma) durante 20 min à temperatura ambiente, e os núcleos foram coradas por DAPI. As células foram montadas com solução Antifade Vectashield (Vector Laboratories).
Resultados
Geração de ratos DLC2 deficiente
Para estudar a função do DLC2
In vivo
eo papel da DLC2 na hepatocarcinogênese, geramos camundongos DLC2-deficent. O rompimento do gene DLC2 rato foi conseguida por recombinação homóloga em células estaminais embrionárias (ES). Na recombinação, exão 5, o maior exão de
gene DLC2
, foi substituído pelo gene de resistência à neomicina do vector de abordagem selectiva (Figura 1a). Dois clones de ES-alvo foram utilizados para estabelecer os ratinhos deficientes em DLC2 (Figura 1B e 1C).
DLC2
– /-.
Ratos não expressam o
DLC2
mRNA como detectado por RT-PCR em tecidos selecionados, coração, fígado e músculo esquelético (Figura 1d)
camundongos DLC2 deficientes eram anatomicamente normal, mas menor e tinha menos gordura adiposa
ao contrário do
DLC1
– /-
camundongos, que morreram na fase embrionária,
DLC2
– /-
ratos poderiam sobreviver até a idade adulta. Isto sugere que DLC2 é dispensável para o desenvolvimento embrionário. A análise anatômica mostrou que
DLC2
– /-
ratos eram normal (a 30 semanas de idade), no entanto
DLC2
– /-
ratos eram menores em tamanho e mais leves em peso (p = 0,01) (Figura 2a) e tinham menos do tecido adiposo de ratinhos de tipo selvagem (p = 0,02) (Figura 2B 2c). Queríamos para excluir a possibilidade de que
DLC2
– /-
ratos pode comer menos alimentos do que
DLC2
+ /+
ratos e isso pode contribuir para o seu tamanho corporal menor. Nós, portanto, realizado experimento gaiola metabólica para verificar se existiam diferenças na alimentação e consumo de água. No entanto, não foi possível detectar diferenças significativas na ingestão de alimentos e água entre
DLC2
– /-
ratos e
DLC2
+ /+
ratos (Figura 3)
(a) O peso corporal. (B) o peso de almofadas de gordura epididimal. Em (a) e (b), os valores médios ± erros padrão e os valores p são mostrados. Os valores P foram calculados pelo teste t de Student não pareado. (C) As amostras representativas de bolsas de gordura do epidídimo.
(a) A ingestão de alimentos, (b) a ingestão de água, de saída (c) fezes e (d) a produção de urina em 24 horas. Valores médios ± erros padrão e p-valores são mostrados. Os valores P foram calculados pelo teste t de Student não pareado.
O esgotamento dos DLC2 não afetou o tamanho da célula e adipogênese em MEFs
Os embriões p190B RhoGAP com deficiência de rato foram menores do que o selvagem os embriões e os fibroblastos derivados a partir dos embriões p190B RhoGAP deficientes tipo foram menores do que aqueles derivados a partir de embriões de tipo selvagem [18]. Além disso, os fibroblastos derivados de embriões p190B RhoGAP deficientes eram defeituosos em adipogénese [19]. Por isso, procurou determinar se os fibroblastos derivados de
DLC2
– /-.
Embriões de ratinho foram menores em tamanho e com defeito na adipogénese
Tal como foi demonstrado com citometria de fluxo, o tamanho das células derivadas do
DLC2
– /- embriões
rato não foi significativamente diferente da do
DLC2 embriões
+ /+
rato (Figura 4a e 4b). Desde Sordella et ai. [18] mostrou que o Akt foi alvo a jusante de RhoA, e isto levou ao tamanho das células diminuiu de fibroblastos derivada a partir dos embriões p190B RhoGAP-deficientes, examinámos o Akt em células derivadas a partir do
DLC2
– /- Comprar e
DLC2
+ /+
embriões de camundongos. Nós não detectar qualquer diferença entre eles nesta via (Figura 4c). Anteriormente mostrou que era uma RhoGAP DLC2; a sobre-expressão de DLC2 regulada negativamente a actividade de Rho em linhas de células de hepatoma e resultou na inibição da formação de fibras de stress de actina [2]. No entanto, up-regulação da atividade Rho no
DLC2
– /-
células não foi observado (Figura 4d) e houve uma ligeira, mas não significativa diferença na formação de fibras de stress de actina ou adesões focais entre
DLC2
– /- Comprar e
DLC2
+ /+
células (Figura 4e). Estes sugerem que pode haver outras proteínas funcionalmente semelhantes que possam compensar a função de DLC2
(a) Comparação de tamanhos de DLC2 + /+ (n = 6) e DLC2 -. (N = 6) – /células por citometria de fluxo. dispersão de luz frontal (FSC) de fase células G1, tal como determinado por citometria de fluxo foi utilizado para medir os tamanhos de célula relativas. Valores médios ± erros padrão e p-valores são mostrados. Os valores P foram calculados pelo teste t de Student não pareado. (B) As amostras representativas dos resultados de citometria de fluxo. (C) análise de transferência de Western de DLC2 tratados com insulina + /+ e DLC2 – /- células. (D) A atividade RhoA de DLC2 + /+ e DLC2 – /- células detectadas por ensaio de ligação Rhotekin. (E) citoesqueleto de actina e adesões focais em DLC2 + /+ e DLC2 – /-. Células MEF foram detectados por imunofluorescência de fibras de stress de actina (vermelho) e Paxillin (verdes), respectivamente
Em seguida, examinou adipogênese em fibroblastos derivados de
DLC2
– embriões
e
DLC2
+ /+
rato – /. Quando
DLC2
– /- Comprar e
DLC2
+ /+
células foram induzidas por meio de indução de diferenciação dos adipócitos padrão, tanto
DLC2
– /
-. e
DLC2
+ /+
células eram competentes para se diferenciar em adipócitos e não diferiram significativamente na produção de lipídios quantitativamente (Figura 5)
(a) indução de adipogénese foi realizada em DLC2 – /- (n = 6) e + + (n = 6) MEFs /DLC2. Após a indução, MEFs foram coradas com Oil Red-O, e o corante foi em seguida extraído e a absorvância a 510 nm foi medida. Valores médios ± erros padrão e p-valores são mostrados. Os valores P foram calculados pelo teste t de Student não pareado. (B) As amostras representativas dos MEFs Oil-Vermelho O-manchados.
O esgotamento dos DLC2 não predispor à formação de tumores hepáticos nem agravar induzida por DEN hepatocarcinogênese
Nós não observar qualquer formação de tumores no fígado de adulto
DLC2
– /-
ratos até a idade de 18 meses. Para abordar o papel da DLC2 na hepatocarcinogênese induzida por produtos químicos, nós tratamos o macho de 15 dias de idade
DLC2
– /- Comprar e
DLC2
+ /+
ratos com DEN . Quando os ratos chegaram a 35 semanas de idade, foram dissecados e os seus fígados foram examinadas para a formação de tumores. Observou-se que os tumores do fígado desenvolvidas em todos os ratinhos tratados com DEN. Além disso, o número de tumores formados e os diâmetros tumorais máximas foram semelhantes em ambos os
DLC2
– /- Comprar e
DLC2
+ /+
ratos (p = 0,79 e 0,51, respectivamente) (Figura 6). Estes resultados sugerem que a deficiência de DLC2 não agravar hepatocarcinogênese química.
(a) Número de tumores formados no fígado após o tratamento DEN. (B) O tamanho do tumor como representado pelo diâmetro máximo (em milímetros). Em (a) e (b), os valores médios ± erros padrão e os valores p são mostrados. Os valores P foram calculados pelo teste t de Student não pareado. (C) amostras de fígado representativos tratados com DEN. As setas brancas indicam tumores. (D) Representante H . E coradas secções de amostras de fígado tratados com DEN
DLC1
e
DLC3
expressão de mRNA em tecidos com depleção de DLC2
PCR
Semi-quantitativa foi realizada em tecidos selecionados, incluindo fígado, músculos esqueléticos e corações do
DLC2
– /- Comprar e
DLC2
+ /+
ratinhos a 3 meses de idade para observar qualquer compensação dosagem do gene por outros membros DLC em nossos
DLC2
– /-
ratos. Nossos dados mostraram nenhum aumento significativo de qualquer DLC1 ou DLC3 nesses tecidos do
DLC2
– /-
ratos (Recurso Figura S1). Os experimentos foram realizados de forma independente por três vezes.
Discussão
Foi relatado que os embriões DLC1 deficiente tinha defeitos do tubo neural e morreu em cedo para midgestation [17]. Como sugerido por Durkin et ai. [17], esta também pode ser devido ao mau funcionamento primária de outros órgãos tais como o coração em desenvolvimento. O nosso grupo demonstrou recentemente que DLC1 regulada negativamente a Rho /ROCK [22]. Além disso, um nível relativamente elevado de expressão rocha foi anteriormente observada no coração em desenvolvimento de embriões, 7,0-9,0 DPC [23] e 9,5-11,5 DPC [24]. Isto sugere que a deficiência DLC1 pode perturbar a função normal de proteínas ROCHA no coração embrionário e levar a letalidade embrionária. No entanto, os fenótipos observados sugerem que DLC1 tem um papel crítico durante o desenvolvimento murino precoce.
Neste estudo, nós mostramos que a deficiência DLC2 não causou quaisquer defeitos de desenvolvimento observáveis, e os ratos DLC2 deficiente poderia sobreviver até a idade adulta. Isto sugere que as funções de DLC2 no desenvolvimento embrionário pode ser compensada pelo seu homólogo, DLC1, mas não vice-versa. É comum que os genes parálogos compensar as funções dos membros do grupo. Por exemplo, os membros de rato Hox grupo parálogos 3, Hoxa3, Hoxb3 e Hoxd3, interagem sinergisticamente para regular o desenvolvimento embrionário de uma forma dependente da dose [25], [26]. Embora a deficiência DLC2 não conduziu a letalidade embrionária, os ratinhos deficientes em DLC2 eram menores e tinham menos tecido adiposo. Uma vez que foi demonstrado que os fibroblastos derivados de embriões 190b RhoGAP deficientes foram menores [18] e foram menos eficazes em adipogénese [19], foram examinados os ratinhos deficientes em DLC2 ao longo destas linhas. No entanto, não observamos diferenças significativas no tamanho das células e adipogênese entre fibroblastos derivados de
DLC2
– /-
e
DLC2
+ /+
ratos. Além disso, o experimento gaiola metabólica não detectou qualquer diferença significativa entre
DLC2
– /- Comprar e
DLC2
+ /+
ratos. A este respeito, não foi possível excluir a possibilidade de que o experimento gaiola metabólica pode não ser suficientemente sensível para detectar a pequena diferença na quantidade de ingestão de alimentos que podem fazer com que o fenótipo observado no peso corporal. Também não poderia excluir o fato de que
DLC2
– /-
ratos poderiam ser mais ativo e consumidas mais calorias do que
DLC2
+ /+
ratos
foi demonstrado que DLC2 localizada nas mitocôndrias e pode desempenhar um papel no transporte de lípido [7]. Além disso, tem sido sugerido que o domínio START contendo proteína, estrela, é um componente essencial na produção de hormonas esteróides na translocação do colesterol a partir da membrana exterior para o interior da membrana da mitocôndria em células esteroidogénicas [27]. Desde DLC2 é um domínio START contendo proteína e é capaz de se localizar na mitocôndria, será de interesse para o estudo da função fisiológica de DLC2 em relação com o metabolismo lipídico, assim como a biossíntese de hormonas esteróides.
foi DLC2 mostrado para ser underexpressed em HCC [1], [2], [28] e têm funções supressoras de tumor, incluindo a supressão da proliferação celular, o crescimento e a formação de colónias independentes de ancoragem induzida por Ras [1], [2]. Um dos nossos principais objetivos na geração de camundongos DLC2 deficiente foi investigar o papel supressor de tumor de DLC2 in vivo. Descobrimos que a deficiência DLC2 não predispor à formação de HCC nem agravar hepatocarcinogênese induzida por DEN. Mais uma vez, a função supressora de tumores da função DLC2 pode ser compensada por DLC1. Uma vez que os ratinhos deficientes em DLC1 morre no estágio embrionário, seria interessante para ver se a deficiência específica do hepatócito de DLC1 podem predispor tais ratinhos para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular e para delinear o papel de deficiência DLC2 no desenvolvimento de HCC nestes ratinhos. Foi demonstrado que a perda de p53 aceleraria hepatocarcinogenese em ratinhos transgénicos que sobre-expressam c-myc [29]. Seria informativo para atravessar DLC2 ratinhos deficientes com outros ratinhos knockout de genes supressores de tumor, tais como p53 e /ou ratinhos transgénicos que sobre-expressam oncogenes, tais como c-myc e TGF-alfa [30]. Em alternativa, o sistema recentemente desenvolvido por Zender et ai. poderia ser explorada para estudar o papel de supressor de tumor DLC2 hepatocarcinogenese em [31]. Nesse sistema, as células progenitoras hepáticas deficientes em p53 podem ser infectadas com uma combinação de retrovírus que transportam ecotrópicas c-myc, RAS, AKT e DLC2. Isto permitir-nos continuar a investigar se DLC2 tem a função supressora de tumor in vivo.
DLC2 pertence a um membro da família de proteínas de DLC. Ele codifica um domínio RhoGAP com elevada homologia de sequência com membros da família de DLC, e DLC1 DLC3. Nos nossos estudos anteriores, foi demonstrado que DLC2 ou DLC1 foi capaz de inibir a actividade de RhoA que resultou na regulação para baixo da formação de fibras de stress de actina. Além disso, o estudo de Kawai et ai indicaram que DLC3 também pode inibir a actividade de RhoA por seu domínio RhoGAP. A expressão ectópica de DLC3 em células HeLa diminuiu o número de fibras de stress de actina [32]. Os resultados sugerem que os papéis funcionais de DLC1, DLC2 e DLC3 em linhas celulares e seus efetores a jusante são bastante semelhantes. No modelo de rato, esgotamento DLC1 era embrionário letal enquanto os nossos camundongos knockout DLC2 poderia sobreviver até a idade adulta. Isto sugere que as funções de DLC2 no desenvolvimento embrionário pode ser compensada por DLC1 ou DLC3. No entanto, a partir de nosso resultado semi-quantitativo de RT-PCR, não houve um aumento significativo de qualquer das DLC1 DLC3 ou no fígado, coração e músculos esqueléticos dos ratinhos knockout DLC2. O resultado implica que o nível fisiológico de DLC1 ou expressão DLC3 pode ser suficiente para a compensação das funções DLC2. Será interessante para gerar ratos knockout DLC3 para estudar a sua importância no desenvolvimento embrionário e examinar se a sua função pode ser compensado por outros membros DLC. Além disso, os dados indicam que os ratinhos knockout os membros DLC pode desempenhar diferentes papéis fisiológicos no desenvolvimento. Além do efetoras a jusante comum (RhoA), pode haver outros alvos moleculares diferentes que estão sendo especificamente regulada por um membro do DLC particular.
Além de estudar o papel supressor de tumor de DLC2 no HCC, os ratos DLC2 deficiente pode seja útil para o estudo de outros tipos de cancro, tal como a regulação negativa da DLC2 também foi observada no pulmão, ovário, renais, da mama, do útero, gástrico, do cólon e cancros rectais [33].
Apoiando informação
Figura S1. O nível de expressão de
DLC1 e DLC3 em DLC2 – /- e DLC2 + /+ ratinhos. PCR semi-quantitativa realizada sobre os fígados, os músculos esqueléticos e os corações dos DLC2 – /- e DLC2 + /+ camundongos de 3 meses de idade, não houve diferença significativa nos níveis de DLC1 e DLC3 expressão de mRNA. β-actina gene foi usado para a normalização
doi:. 10.1371 /journal.pone.0006566.s001
(0,39 MB TIF)