Abstract

Fundo

Tryptase é uma protease serina armazenado e libertado a partir de mastócitos (MCs), que desempenha um papel na angiogénese tumoral. Neste estudo teve como objetivo avaliar os níveis de triptase no soro de câncer colo-retal (CRC) pacientes antes (STLBS) e depois (STLAS) ressecção cirúrgica radical. Também foi avaliada a densidade de mastócitos positiva para triptase (MCDPT) e densidade microvascular (MVD) no tecido do tumor primário.

Métodos

Uma série de 61 pacientes com estágio B e C CRC (de acordo com foram selecionados o Astler e sistema de estadiamento Coller). amostras de sangue de soro foram coletadas de pacientes, um dia antes e um dia após a cirurgia. níveis de triptase foram medidos usando o UniCAP Tryptase Fluoroenzymeimmunoassay (Pharmacia, Uppsala, Suécia). secções de tumor foram imunocoradas com um anticorpo primário anti-triptase (AA1 clone; Dako, Glostrup, Dinamarca) e um CD-34 anticorpo anti (QB-FIM 10; Bio-Optica Milão, Itália), por meio de imuno-histoquímica e, em seguida, avaliado por imagem métodos de análise.

resultados

A média ± sd STLBS e STLAS foi de 5,63 ± 2,61 mg /L e 3,39 ± 1,47 mg /L, respectivamente, e foi encontrada uma diferença significativa entre os níveis médios: p = 0,000 pelo teste t. A média ± S.D. de MCDPT e MVD foi 8,13 ± 3,28 e 29,16 ± 7,39, respectivamente. Uma forte correlação entre STLBS e MVD (r = 0,83, p = 0,000); STLBS e MCDPT (r = 0,60, p = 0,003); e MCDPT e MVD (r = 0,73; p = 0,001)

Conclusão

Os resultados demonstraram STLBS mais elevados em pacientes de CRC, indicando um envolvimento de MC triptase no CRC angiogênese.. Os dados também indicam STLAS mais baixos, sugerindo a libertação da triptase do MCS-se infiltram no tumor. níveis séricos de triptase podem, portanto, desempenhar um papel como um romance preditivo bio-marcador de resposta à cirurgia radical. Neste contexto, os inibidores da triptase, como gabexato e nafamostat mesilato pode ser avaliado em ensaios clínicos de adjuvante como uma nova abordagem anti-angiogénica

citação:. Ammendola H, R Sacco, Sammarco G, Donato L, S Montemurro, Ruggieri E, et al. (2014) Correlação entre Serum Tryptase, mastócitos positiva para triptase e microvascular Densidade no Colo-Rectal pacientes com câncer: significado biológico-clínico possível. PLoS ONE 9 (6): e99512. doi: 10.1371 /journal.pone.0099512

Autor: Michael Muders, University Hospital Carl Gustav Carus Dresden, Alemanha |

Recebido: 02 de dezembro de 2013; Aceito: 15 de maio de 2014; Publicação: 10 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ammendola et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

CONFLITO dE iNTERESSES:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a angiogênese é um processo complexo envolvido no crescimento, invasão e metástases de vários tumores humanos e de animais [1] – [3]. Os mastócitos (MC) intervir neste processo libertando factores pró-angiogénicos clássicos, tais como o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), timidina fosforilase (TP), factor de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2), e interleucina-6 (IL- 6), assim como não clássicos factores pró-angiogénicos, tais como triptase, armazenados nos seus grânulos secretores [4] – [8]. Dados de modelos tumorais experimentais sugerem que MCs acumular perto às células tumorais antes do início da angiogénese e que são necessários para a expansão macroscópica e disseminação metastática de células de tumor primário. A evidência para um papel específico para MCs tem sido relatada em cânceres em animais e humanos, tais como tumores MC, cabeça e pescoço, estômago, colo-retal, de pulmão e doenças malignas cutâneas, onde MC densidade é altamente correlacionado com a extensão da angiogénese tumoral [9 ] – [19]

a triptase é uma serina-protease neutra com um peso molecular de 134 kDa e uma estrutura tetramérica composta por subunidades ligadas não covalentemente.. Quatro formas diferentes de triptase foram identificados em MCs humano até agora: α-, β-, γ- e δ-triptase [20]. Destes, α- e β-triptase são as duas isoformas melhor circulação descritos. α-triptase é constantemente liberado de MCs na corrente sanguínea. β-triptase está concentrada seletivamente nos grânulos de secreção de MCs e é liberado somente após a degranulação. A presença de uma elevada concentração de β-triptase na corrente sanguínea é, portanto, uma expressão clara da activação MC [21] – [23]. Estudos experimentais têm demonstrado a libertação da triptase do MCS para ser um estímulo angiogénico potente que é capaz de induzir a neo-vascolarization tanto em

vitro e in vivo e, por conseguinte,

está envolvida no desenvolvimento do cancro.

neste estudo piloto, foram analisados ​​os níveis de triptase séricas (ETAS) em pacientes com CCR antes (STLBS) e depois (STLAS) radical ressecção cirúrgica; densidade MC positivo para triptase (MCDPT); e a densidade microvascular (MVD) no tecido do tumor primário, a fim de correlacionar cada para os outros e para avaliar STLs como um possível preditivo biomarcador da resposta a uma cirurgia radical. Neste contexto, a inibição da triptase, por meio de gabexato nafamostat e podem ser avaliados em ensaios clínicos de adjuvante como uma nova terapia anti-cancro [24] – [26].

Materiais e Métodos

Estudo de Populações

foram selecionados Uma série de 61 pacientes CRC observados na Unidade de Clínica Cirúrgica da “Magna Grécia” University of Catanzaro. A tomografia computadorizada helicoidal do tórax, abdome e pelve revelou que nenhum dos pacientes com metástases distantes. foram usadas várias abordagens cirúrgicas: hemicolectomia aberta esquerda e direita para câncer de cólon; ressecção aberta anterior, a excisão total de meso-retal e ressecção abdomino-perineal aberta para o cancro rectal [27] – [30]. Pacientes com estágio B e C CRC de acordo com o sistema Astler e Coller estadiamento foram inscritos. Na série global, houve 61 adenocarcinomas; a classificação histopatológica foi realizada de acordo com o AJCC 7

ª Edição [31] – [32]. As características clínico-patológicos de pacientes estão resumidas na Tabela 1. homologação ética completa e assinaram o consentimento dos pacientes individuais foram obtidos para conduzir o estudo. O nome completo da ética conselho de revisão comitê institucional que aprovou nosso estudo é:. Comité University Hospital Ética “Mater Domini”, Germaneto, Catanzaro, Itália

Preparação Amostra

As amostras de sangue foram coletado 7:00-09h00 após jejum durante a noite, um dia antes e um dia após a ressecção cirúrgica do tumor. As amostras foram imediatamente distribuída em tubos de ensaio com tubos separadores de soro, sem aditivos (Becton Dickinson Vacutainer Sistemas Hemogard, Plymouth, UK) e mantido durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente para permitir um processo de coagulação completa. As amostras foram posteriormente centrifugadas a 1500 × g durante 15 min à temperatura ambiente e o sobrenadante foi recuperado. Os soros dos pacientes foram obtidas recolhido, dividido em alíquotas e congeladas a -80 ° C, até a fase de análise.

Antes de se iniciar a fase de análise, as amostras foram descongeladas à temperatura ambiente e misturou-se cuidadosamente por rotação a baixa velocidade, a fim de eliminar quaisquer resíduos de fibrina, outras partículas potencialmente afetando resultados reproduzíveis. As amostras lipémicas ou hemolisadas potencialmente interferem com o ensaio foram excluídas da avaliação analítica.

os níveis de triptase no soro foram medidos por flúor-enzima-imunoensaio (FEIA) para cada amostra, utilizando Uni-CAP100 (Pharmacia Diagnostics AB, Uppsala , Suécia).

a imuno-histoquímica

Para a avaliação de MCPT MVD e um sistema de biotina-avidina-peroxidase de três camadas foi utilizado [33]. Resumidamente, 4 mm de espessura cortes seriados de fixado em formol e amostra de tumor embebido em parafina e adjacente mucosa normal foram cortadas. As secções foram então micro-ondas a 500 W durante 10 minutos, após o que a actividade peroxidase endógena foi bloqueada com solução a 3% de peróxido de hidrogénio. secções de tumor foram incubadas com um anticorpo anti-triptase (AA1 clone; Dako, Glostrup, Dinamarca) diluída 1:100 durante 1 h à temperatura ambiente e um anticorpo anti-CD34 (QB-FIM 10; Bio-Optica Milão, Itália) diluída 1 :50 durante 1 h à temperatura ambiente como um marcador pan-endotelial, respectivamente. secções de mucosa normal adjacente foram incubadas com um anticorpo anti-triptase (AA1 clone; Dako, Glostrup, Dinamarca) e, em seguida, processada da forma descrita acima. secções de tumor foram também incubadas com um anticorpo anti-VEGF (clone VG-1) (Dako Glostrup, Dinamarca), diluída a 1:200 durante 1 h à temperatura ambiente. O anticorpo ligado foi visualizado utilizando um anticorpo secundário biotinilado, complexo de peroxidase avidina-biotina e rápido vermelho. A contracoloração nuclear foi realizada com hematoxilina de Gill não. 2 (Polysciences, Warrington, PA, EUA). O anticorpo primário foi omitido nos controlos negativos.

morfológica ensaio

Um sistema de análise de imagem (Quantimet500 Leica, Wetzlar, Alemanha) foi utilizado [34]. Em secções de tumor foram selecionadas cinco áreas mais imunocoradas (hot spots) em baixa ampliação e MCDPT individuais (Fig. 1A) e MVD (Fig. 1B) foram contadas na ampliação de x400 (0,19 mm

2 de área). Os detalhes foram avaliadas com uma ampliação X1000 em óleo (Figs. 2A e 2B, respectivamente). Em seções da mucosa normais adjacentes cinco áreas mais imunocoradas (hot spots) foram selecionados a baixa ampliação e MCDPT individuais (Fig. 3A) foram contadas na ampliação de x400 (0,19 mm área

2). Em tumor expressão VEGF tecido foi avaliada (Fig 3B).

A um anticorpo anti-triptase primário tem sido empregada. As setas indicam os mastócitos vermelhos positivos para triptase. Em B foi utilizado um anticorpo primário anti CD-34. As setas indicam microvasos positivos vermelho.

A um anticorpo anti-triptase primário tem sido empregada. As grandes setas indicam mastócitos vermelho único positivas a triptase. A seta pequena indica a frente a desgranulação dos mastócitos formando uma microvasos. Em B foi utilizado um anticorpo primário anti CD-34. A seta grande indica um positivo microvasos vermelho. A seta pequena indica o núcleo da célula endotelial. Nota do lúmen do microvasos.

A foi empregado um anticorpo anti-triptase primário. A seta indica um único e exclusivo mastócitos vermelho positivas a triptase no campo observado. Em B foi utilizado um anticorpo anti-VEGF primária. Muitas células cancerosas imunocoradas vermelhas. Grandes setas indicam células citoplasmáticos vermelho único cancerosas positivas para VEGF.

A análise estatística

valores médios MCDPT e MVD ± 1 desvio padrão (SD) foram avaliados por dois observadores independentes (GR e GD) para cada amostra de tumor e em toda a série de seções. MCDPT valores médios ± 1 SD também foi avaliada para cada mucosa normal adjacente. Correlações entre STLs, MCDPT, e MVD foram calculados usando análise de Pearson (r). As correlações entre os índices acima e as características clínico-patológicas listadas na Tabela 1 foram analisadas pelo teste do qui-quadrado. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o pacote de software estatístico SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultados

A média ± DP STLBS e STLAS foram 5,63 ± 2,61 mg /L e 3,39 ± 1,47 mg /L, respectivamente, e foi encontrada uma diferença significativa entre os níveis médios: p = 0,000 pelo teste t (Tabela 2, Fig. 4). No tecido tumoral a média ± S.D. de MCDPT e MVD foi 8,13 ± 3,28 e 29,16 ± 7,39, respectivamente (Tabela 2). (. R = 0,83, p = 0,000, Fig 5) A correlação significativa entre STLBS e MVD, STLBS e MCDPT (r = 0,60, p = 0,003, Fig. 6), e MCDPT e MVD (r = 0,73; p = 0,001 , a Fig. 7) foi encontrado. Na mucosa normal adjacente a média ± S.D. de MCDPT foi 2,63 ± 1,17 (Fig. 3A). Uma diferença significativa entre tumor MCDPT tecido significa e adjacente média normal mucosa MCDPT foi encontrada (p = 0,000). expressão de VEGF mostraram uma forte imunomarcação citoplasmática no tecido canceroso (Fig. 3B), porém com base em dados publicados anteriormente que demonstram uma forte expressão de VEGF no tecido e sangue fração CRC de pacientes, em comparação com mucosa normal e saudáveis ​​controles adjacentes, respectivamente, os dados não foram mostrados [35] – [38].

Não há outras correlações significativas entre os índices acima e as principais características clínico-patológicas listados na tabela 1 foi encontrado .

Discussão

neste estudo piloto nós mostramos pela primeira vez que STLBS fortemente correlacionada com MCDPT e MVD no tecido do tumor primário. Nossos dados também demonstram que STLs diminuir após ressecção cirúrgica em pacientes de CRC com um valor significativamente menor de STLAS. Devido à liberação de triptase da ativação MC, sugerimos que MCDPT no tecido tumoral CRC primário representa a principal fonte de triptase no soro. Na nossa hipótese, se o tecido de tumor primário é completamente removidos STLs deverá diminuir de uma dia, devido ao seu ciclo de vida, aproximadamente, 4-h muito tempo. Por estas razões, foram detectados STLS 24 h antes da cirurgia para avaliar o seu possível papel como um biomarcador circulante, sugerindo a presença de tecido tumoral, e novamente 24 horas após o tratamento para confirmar a diminuição da concentração e, em consequência, a sua possível implicação da ausência de tecido de tumor. Elaboramos o plano de fundo da nossa hipótese com base em dados piloto publicado anteriormente que sugeriu um aumento de MCDPT no tecido do tumor primário, e aqui os nossos resultados também confirmaram os dados relatados (Fig 1A, 3A). Nestes estudos STLBS e MCDPT foram correlacionados com MVD, sugerindo seu papel na CRC angiogênese. Nossos dados estão de acordo com um estudo publicado anteriormente, que demonstrou um envolvimento de MCs em diferentes neoplasias malignas, como doenças hematológicas malignas, melanoma, cancro da mama, gastrointestinal e cancros colo-rectal, e [38] também em modelos de tumores animais – [43]. No entanto, os estudos anteriores não se concentrar sobre as mudanças na STLs antes e após a cirurgia, e nenhuma correlação entre STLs, MCDPT e MVD foi avaliada. Curiosamente, triptase liberado de MCs está envolvido na angiogênese do tumor através de vários mecanismos: em primeiro lugar, triptase estimula a formação de tubos vasculares em

in vitro

e

in vivo

modelos experimentais; Em segundo lugar, a triptase é um agonista do receptor-2 em células endoteliais vasculares, que, por sua vez, induz a angiogénese [44] activado por proteinase; em terceiro lugar, triptase podem estimular a liberação de fatores angiogênicos latentes ligados à matriz extracelular [45] – [47]. Considerados em conjunto, os dados acima sugerem que a triptase podem ser um substituto potencial bio-marcador de angiogénese de tumor, que é capaz de prever a resposta a tratamento cirúrgico.

Portanto, com a fonte primária de produção de triptase não existente, depois 24 ha deve ser esperada redução significativa na STLs. Se STLs elevados persistem após a cirurgia, isto sugeriria que o tecido do tumor residual permanece após ressecção cirúrgica ou, em alternativa, que as metástases desconhecidos estão presentes. Neste contexto, vários inibidores de triptase como gabexato ou nafamostat mesilato pode ser avaliado em ensaios clínicos futuros como uma nova abordagem anti-tumorais e anti-angiogénicos.

Reconhecimentos

Os autores gostariam de obrigado Caroline Oakley para a edição do manuscrito.