Abstract

O câncer endometrial é o tumor maligno mais comumente diagnosticado ginecológica em todo o mundo; No entanto, o microambiente do tumor, especialmente as células de fibroblasto que rodeiam as células cancerosas, é pouco compreendida. Nós estabelecemos quatro culturas primárias de fibroblastos de tecidos humanos endométrio câncer (fibroblastos associados ao câncer, CAFS), utilizando anticorpos conjugados com o isolamento do grânulo magnético. Estas culturas de fibroblastos relativamente homogêneos expressa marcadores de fibroblastos (CD90, vimentina e alfa-actina de músculo liso) e hormonal (estrogênio e progesterona) receptores. Os meios condicionados recolhidos de FAC induziu uma proliferação dependente da dose de ambas as culturas primárias e linhas de células de cancro do endométrio

In vitro

(175%) quando comparado com as células não tratadas, em contraste com as de células de fibroblastos normais do endométrio line (51%) (

P Art 0,0001). Estes efeitos não foram observados em cultura de fibroblastos derivadas de tecidos benignos hiperplasia endometrial, indicando a especificidade de FAC em afectar a proliferação de células de cancro do endométrio. Para determinar o mecanismo subjacente aos efeitos de fibroblastos diferencial, comparou-se a activação da via PI3K /Akt e MAPK /Erk vias em células de cancro do endométrio após o tratamento com meios fibroblasts- normal e FAC-condicionado. A análise Western blot mostrou que a expressão de ambas as formas fosforiladas de Akt e Erk foi significativamente regulada negativamente em células de fibroblastos tratados normais, mas eram sobre-regulada /mantidas em células FAC-tratados. O tratamento com inibidores específicos de LY294002 e U0126 inverteu a proliferação de células mediada por FAC (

P

0,0001), sugerindo um papel para estas vias na modulação da proliferação de células de cancro do endométrio. A rapamicina, que tem como alvo uma molécula jusante em via PI3K (mTOR), também suprimiu a proliferação celular induzida por FAC-indução de apoptose. A análise de perfil de citocinas revelaram que FAC secretar maiores níveis de proteína quimiotática de macrófago (MCP) -1, interleucina (IL) -6, IL-8, RANTES e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) do que os fibroblastos normais. Os nossos dados sugerem que, em contraste com os fibroblastos normais, FAC pode exibir um efeito pró-tumorigénica na progressão do cancro endometrial, e a sinalização de PI3K /Akt e MAPK /Erk pode representar reguladores críticos no como endometrial células cancerosas responder ao seu microambiente.

Citation: Subramaniam KS, Tham ST, Mohamed Z, Woo YL, Mat Adenan NA, Chung I (2013) Cancer-associados fibroblastos promover a proliferação de células de câncer endometrial. PLoS ONE 8 (7): e68923. doi: 10.1371 /journal.pone.0068923

Autor: John W Glod, Robert Wood Johnson Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de fevereiro de 2013; Aceito: 03 de junho de 2013; Publicação: 26 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Subramaniam et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é financiado pela Universidade Malaya Bolsas de investigação RG336 /11HTM (Chung), UM HIR /Mohe /MED-12 (Chung) e HIR-Mohe e-00.025-20.001 (Mohamed). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer endometrial (CE) é o sexto tipo de câncer mais comumente diagnosticado entre as mulheres no mundo, com cerca de 288.000 novos casos e 50,327 mortes que ocorrem anualmente no mundo [1]. É a neoplasia maligna ginecológica mais comum nos Estados Unidos, com uma estimativa de 47,100 novos casos diagnosticados em 2012 [2]. De importância, as taxas de incidência e mortalidade para CE têm vindo a aumentar nos países desenvolvidos e em desenvolvimento e é esperado que aumente ainda mais com o crescente envelhecimento da população ea prevalência de obesidade [3]. Embora a sobrevivência de cinco anos para a CE é 85%, um subconjunto de tumores endometriais apresentam um fenótipo agressivo, caracterizado pelo alto grau histológico, invasão linfática regional e metástases à distância. O prognóstico para esses tumores é relativamente pobre, com sobrevida de cinco anos variando de 16-66% [4].

Cerca de 90% dos casos da CE são esporádicos e são classificados em tipo 1 e tipo 2, de acordo com sua etiologia e comportamento clínico [5]. Tipo 1 CE representa a maioria dos casos esporádicos, representando 70-80% dos novos casos de [5]. Tipo 1 tipos de câncer, principalmente endometrióides em histologia, muitas vezes são tumores de baixo grau com um prognóstico favorável. Estes cancros apresentam frequentemente PTEN, K-

ras

e mutações beta-catenina e aumento da expressão do receptor de estrógeno [6]. Sugere-se que a exposição excessiva de estrogénio pode levar a hiperplasia atípica do endométrio (EH), uma condição benigna da glândula endométrio proliferativo [7,8]. Além disso, atípica EH tem sido fortemente associado com invasiva CE em até 62% amostras de biópsia de endométrio, sugerindo que atípica EH pode ser o precursor direto endometrióides tipo 1 CE [9]. No entanto, a principal razão para o insucesso do tratamento em ambos os tipos 1 e 2 tipos de câncer de endométrio é a disseminação à distância de tumores primários (metástases) [10]. O mecanismo que leva a esta transformação agressivo está ainda a ser definido. No entanto, os estudos sobre outros tipos de tumor sugere que os fibroblastos circundantes podem ter um papel importante na progressão do tumor [11,12].

No aparelho reprodutor feminino, os fibroblastos podem promover o desenvolvimento e a diferenciação epitelial [13,14]. Eles são responsáveis ​​pela remodelação da matriz extracelular e a produção de factores de crescimento parácrinos que controlam a proliferação celular, sobrevivência e morte [15]. Na verdade, a contribuição de fibroblastos associados ao câncer (FAC) na progressão de vários tipos de cancro tem sido estudada, por exemplo, no cancro da próstata [16-18], câncer pancreático [12], cabeça e pescoço câncer [19] e de mama cancro [20]. Nestes modelos de tumor, FAC melhorada de células de tumor a proliferação, invasão e quimioresistência. Além disso, FAC também são pensados ​​para ter papéis importantes na modulação da angiogénese tumoral, infiltração de células imunes e colonização metastática [21-23]. O envolvimento de fibroblastos na progressão da CE, no entanto, é relativamente pouco estudado.

Caracterização de fatores de fibroblastos no cancro endometrial, enquanto alguns, são principalmente a partir de análises patológicas. fator de crescimento de hepatócitos e expressão cMet foi significativamente correlacionada com estágios superiores da CE, embora não era prognóstico da pior sobrevivência [24]. Outro estudo observou que a expressão de CXCR4 foi significativamente mais elevada em tumores com a infiltração muscular, um indicador de metástase [25]. Curiosamente, utilizando culturas primárias de tecidos endometriais, Arnold et ai demonstraram que a secreção a partir de células de fibroblasto endometriais normais inibiu a proliferação de células de Ishikawa, uma linha celular CE humana [26]. Esta observação foi mais suportada pelo grupo de Zhao em que eles sugeriram que tal efeito anti-proliferativo pode ser devido à inibição da PI3K [27]. No entanto, ainda é desconhecido se FAC em CE exibirão uma propriedade anti-tumor com fibroblastos como endometriais normais, ou um pró-tumoral característica como com FAC a partir de outros tipos de tumores.

Por isso, no presente estudo, nós estabelecidas várias culturas primárias de células de fibroblastos humanos endometriais de tecidos da CE, para investigar os efeitos da FAC sobre a proliferação celular CE. Nós ainda mostrou que, ao contrário de fibroblastos endometriais normais, FAC promoveu a proliferação de células CE, em parte através da modulação PI3K /Akt e MAPK /Erk vias de sinalização. Nós também testou a utilização de rapamicina, um inibidor de mTOR, tal como um potencial agente terapêutico na inibição da proliferação de células mediada por FAC. O estudo fornece novas evidências de elucidar o papel pró-tumorigénico de fibroblastos na tumorigênese da CE.

Materiais e Métodos

produtos químicos e reagentes

U0126 e LY294002 foram obtidos a partir de celular Signaling Technology (MA, EUA), e rapamicina (sirolimus) foi comprado de Clearsynth Labs (Mumbai, Índia).

declaração Ética

o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Malaya Medical Centro (Ref No. 865,19). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.

tecidos humanos e linhas celulares

Os tecidos de quatro tipos de câncer endometrial e um tecido hiperplasia foram obtidas de mulheres submetidas a cirurgia para remover o tumor parte do endométrio. Cerca de 1 g de tecidos foi transportado para o laboratório em meio consistindo em RPMI 1640 (Life Technologies, NY, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Life Technologies, Nova Iorque, EUA) e 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies , Nova Iorque, EUA). Os tecidos foram picadas para o tamanho de 1 mm

3 e, em seguida, digerido com 2 mg /ml de colagenase II para os tecidos CE e com a colagenase I por tecido hiperplasia (Worthington, New Jersey, EUA) num rotador durante 1 hora a 37

° C. Pós a digestão, os tecidos foram lavadas e cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina /estreptomicina a 37

° C. As culturas foram mantidas pelos meios de mudar a cada 72 horas e sub-cultivados após atingir confluência. linhas celulares de cancro do endométrio humano, ECC-1 (CRL-2923) e HEC-1-A (HTB 112) e imortalizadas linha normal humana de células de fibroblasto do endométrio, t-HESC (CRL-4003) foram adquiridas da American Type Culture Collection (Bethesda , MD, EUA) e foram cultivadas em meios de acordo com o protocolo do fabricante.

isolamento de células epiteliais e do estroma primário

Todas as células primárias cultivadas obtidas a partir de tecidos cirúrgicos foram submetidos ao isolamento de células do estroma usando anti microesferas magnéticas -fibroblast (Miltenyi Biotech, Colónia, Alemanha). Resumidamente, 1×10

6 células foram centrifugadas a 300x

g

durante 10 minutos. As pelotas de células foram então ressuspensas em 100 ul de tampão contendo uma concentração final de 0,5% de albumina de soro de bovino e 2 mM de ácido etilenodiaminotetra-acético dissolvidos em pH 7,2, cálcio e magnésio livre a solução salina tamponada com fosfato e incubadas com 20 uL de anticorpo microesferas anti-fibroblastos humanos (Miltenyi Biotec, CA, EUA) durante 1 hora. As células foram então separados utilizando MiniMACS ™ separador de células (Miltenyi Biotec, CA, EUA). As células isoladas foram em seguida continuaram a ser cultivadas nos meios mencionados acima. população de células epiteliais também foi colhida usando um método semelhante, utilizando CD326 humana (EpCAM) anticorpo microesferas magnéticas (Miltenyi Biotec, CA, EUA).

análise de citometria de fluxo

Células cultivadas foram tripsinizadas e 1×10

6 suspensão única célula foi bloqueada com 10% de soro de cabra normal (Biowest, Nuaillé, França) antes de coloração com AlexaFluor 647 (AF647) -conjugated molécula humana adesão celular epitelial (EpCAM) e PE-conjugado anticorpos CD90 humana (BioLegend, San Diego, EUA). controlos utilizados foram do isotipo IgG2b de ratinho AF647, κ e PE de IgG1 de ratinho, κ, respectivamente. A coloração foi então analisada usando fluxo BD FACSCanto II citômetro e os resultados foram visualizados usando software DiVa FACS (BD Bioscience, Califórnia, EUA).

quantitativa em tempo real reação em cadeia da polimerase (qRT-PCR)

O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas utilizando TRIzol (Invitrogen, California, EUA) e ARN 1 ug foi convertido em ADNc utilizando o kit de síntese de ADNc dínamo (Finnzymes, Vantaa, Finlândia). Sequência de iniciadores utilizados para a detecção de marcadores de células epiteliais (EpCAM, E-caderina, citoqueratina 8) e marcadores de células de fibroblasto (alfa-actina de músculo liso (α-SMA) e vimentina) estão listados na Tabela 1. qRT-PCR foi realizada utilizando ABI StepOne Plus (Applied Biosystem, Califórnia, EUA) em 35 ciclos usando 5x HOT FIREPol Mix EvaGreen qPCR (Solis Biodyne, Tartu, Estónia), 10 pmol /l frente e verso, primer, 10 ng /mL modelo de cDNA e PCR grau H

2O. Os ensaios foram realizados pelo menos em triplicado, e os valores médios foram usadas para calcular os níveis de expressão relativa, utilizando o método ΔΔC (t). Os níveis de expressão foram primeiro normalizados para arrumação do gene GAPDH. Em seguida, a expressão de genes testados em células epiteliais foi comparado com o nível de ARNm correspondente observada em células de fibroblasto representativos (t-HESC), e de forma semelhante, os genes relatados expresso em células de fibroblastos foram comparados com o seu nível de ARNm correspondente num células epiteliais representativos ( ECC-1).

Gene

Primers

Origem e EpCAMForward5′-AATGTGTGTGCGTGGGA-3 ‘[79] Reverse5′-TTCAAGATTGGTAAAGCCAGT-3’E-cadherinForward5′-TTTGTACAGATGGGGTCTTGC-3’ [80] Reverse5 ‘-CAAGCCCACTTTTCATAGTTCC-3’Cytokeratin 8Forward5′-CTGGTGGAGGACTTCAAGAAC-3′ [81] Reverse5′-GACCTCAGCAATGATGCTGTC-3’αSMAForward5’-GACGAAGCACAGAGCAAAAGAG-3 ‘[82] Reverse5′-TGGTGATGATGCCATGTTCTATCG-3’VimentinForward5′-TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3′ [83 ] Reverse5’-GGTCATCGTGATGCTGAGAA-3’Table 1.

Primers sequências

utilizados para qRT-PCR.

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Preparação de fibroblastos células-condicionado mídia

células

fibroblastos foram semeadas e cultivadas em meio completo durante 24 horas, antes de ser cultivadas em meios contendo FBS a 2% para as 72 horas seguintes. O meio condicionado foi recolhido utilizando Amicon filtros centrífugos ultra-(Merck Millipore, Massachusetts, EUA) por centrifugação a 5000x

g

a 4

° C por 1 hora. A proteína no meio concentrado foi quantificada utilizando o ensaio de Bradford (Biorad, CA, EUA).

Metil tiazolil tetrazólio (MTT)

A proliferação de células epiteliais foi avaliada por metilo tiazolil tetrazólio (MTT) teste. Resumidamente, as células foram semeadas em meio completo em 1-3 x10

3 células /cavidade em placas de 96 poços. Ao fim de 24 horas após sementeira, as células foram tratadas com quer meio completo, meios com 2% de FBS, meio condicionado de fibroblastos-e /ou inibidores durante 72 horas. No final do tratamento, 20 ul de solução de MTT (5 mg /ml) foi adicionado a cada poço. Após 4 horas de incubação a 37

° C, foram adicionados 100 ul de dodecilsulfato de sódio a 10% para dissolver os cristais de formazano por mais 4 horas de incubação a 37

° C. A absorvância foi medida usando espectrómetro a 575 nm com referência de 650 nm.

extração de proteína total e western blot

células ECC-1 foram semeadas a 1×10

4 células /poço em 6- bem placas em meio completo. Ao fim de 24 horas após sementeira, as células foram tratadas com meio completo, meios com 2% de FBS, meios e /ou inibidores de fibroblastos-condicionadas durante 72 horas. Os lisados ​​de proteína foram recolhidas por raspagem das células em tampão de lise frio contendo concentração final de 0,1% de Triton-X, SDS a 0,1%, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 1x fosfatase e inibidores da protease 1x. A concentração de proteína foi quantificado usando o ensaio de Bradford (Biorad, CA, EUA). Aproximadamente 20 ug de proteína foram resolvidas em electroforese em gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio a 10% antes de ser transferida para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. Os anticorpos utilizados foram de coelho anti-humano de Akt, fosfo-Akt, ERK e de fosfo-Erk β-actina (Cell Signaling Technology, EUA). As manchas foram visualizadas utilizando ECL nobre ocidental reagente de detecção blotting (Amersham, GE Healthcare Lifesciences, Suécia), utilizando o sistema de documentação de gel (Biospectrum 410, UVP) e software Visão Works LS (CA, EUA)

ensaio imunoenzimático (ELISA)

Os níveis de fosforilada-Akt e fosforilada-Erk em células ECC-1 tratados com 1 mg /media ul condicionado de T-HESC e FAC foram quantificadas utilizando kits ELISA (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA). Resumidamente, placas de 96 poços foram revestidas com anticorpo de captura diluído durante a noite, antes do bloqueio e incubação com lisados ​​de células durante 2 horas cada. a detecção de anticorpo diluído foi incubado durante 1 hora antes da incubação do anticorpo secundário durante mais 30 minutos. substrato TMB foi então adicionada a cada poço durante 15 minutos para desenvolvimento da cor antes de terminadas com solução STOP. A absorvância foi lida a 450 nm de comprimento de onda utilizando espectrómetro (Tecan Systems, CA, USA). Os dados apresentados foram média de pelo menos três repetições normalizados com leituras a partir de células ECC-1 tratados com meios contendo 2% de FBS.

Identificação e medição dos níveis de citocinas

As citocinas secretadas por fibroblastos normais (T -HESC) e fibroblastos associados ao câncer (FAC de EC6, 7 e 11) foram medidos usando Raybiotech Quantibody citocinas Humano array (Raybiotech, Geórgia, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, o meio condicionado foi preparado a partir de fibroblastos de 72 horas-cultivadas tal como descrito acima. 100 ug de proteína de cada secreção de fibroblastos foi adicionada a respectiva matriz bem e incubou-se durante a noite a 4 ° C. Cada poço foi lavado, incubado com cocktail de anticorpos reconstituída durante 2 horas à temperatura ambiente, lavou-se de novo, antes da adição de estreptavidina conjugada com Cy3. Após a lavagem extensiva complementar, sinal de fluorescência foi medida usando o Agilent alta resolução Microarray Scanner (C-modelo) e dados de sinal matérias foram extraídos imagem TIFF a partir com GenePixPro 6.1 antes analisados ​​com Q-Analyzer. Os níveis de citocinas a partir de cada secreção de fibroblastos foram comparados com meio contendo FBS a 2% (controle). Os dados apresentados para cada amostra foram média da intensidade de fluorescência a partir de quatro poços de matriz.

A análise estatística

A análise estatística que avaliou as diferenças entre as médias de grupo controle e teste foi realizado usando Student

t

-test no IBM SPSS Statistics 20. a

P

-valor. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

resultados

Isolamento de fibroblastos associados ao câncer As células a partir de tecidos de cancro do endométrio humano

Para estabelecer células de fibroblastos primárias de tecidos endometriais, cancro endometrial (CE) tecidos humanos (EC6, 7, 11 e 14) foram digeridos com colagenase, seguido de isolamento das células utilizando contas magnéticas conjugadas com anticorpo anti-fibroblastos. Para EC6 e EC14, as células seleccionadas negativamente foram então sujeitas a-CD326 anti esferas conjugadas magnéticos para o enriquecimento do homólogo epitelial. As células epiteliais e de fibroblastos isolados foram designados como “Ep” e “Fib ‘, respectivamente. Como mostrado na Figura 1, houve uma clara diferença na morfologia entre as células epiteliais (EC6-PE e EC14-PE) e células de fibroblastos (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib, EC14-Fib). As células epiteliais expostas subiu morfologia em forma de pétala e tendem a crescer em colônias, enquanto as células do estroma exibido características fusiformes alongadas

Hematoxilina eosina (H e E) de coloração de tecidos e imagens de contraste de fase de células primárias isoladas estabelecidas a partir de cancro do endométrio: EC6 (A), EC14 (B), CE7 (C) e EC11 (D). Ampliação: 100x. Subsequentemente, estes foram digeridas com colagenase e cultivadas, antes da epiteliais e isolamento de células de fibroblastos utilizando CD326 (EpCAM) e anti-fibroblastos marcado esferas magnéticas.

Para determinar a pureza das culturas de células epiteliais e de fibroblastos isolado , que as células coradas com ambos marcador epitelial, Alexa Fluor 647 conjugado com EpCAM e fibroblastos de marcadores, anticorpos CD90 conjugado com PE. A linha de células do endométrio humano adenocarcinoma, ECC-1 demonstrou uma expressão elevada de EpCAM (98%), enquanto que, linha celular de fibroblastos de endométrio humano normal, o t-HESC demonstraram elevada expressão de CD90 (74%) (Figura 2A, D). A coloração com controlos de isotipo de anticorpo mostrou o mínimo de ligação, o que indica a especificidade dos anticorpos primários (dados não mostrados). As células epiteliais isoladas a partir de CE6 e 14 (EC6-PE e CE14-PE) mostrou expressão moderada de EpCAM (55%) sem evidência de expressão de CD90, indicando que esta cultura epitelial não estava contaminado com células de fibroblasto (Figura 2B, C). Em contraste, as células de fibroblastos isolados a partir de tecidos CE (Fib-EC6, CE7-Fib, Fib-EC11, EC14 e-Fib) foram negativos para a expressão de EpCAM mas altamente positiva para o marcador CD90 de fibroblasto (75-81%), indicando que as células de fibroblastos foram isolados relativamente pura e livre de contaminação de células do epitélio (Figura 2E-H). Todas as células primárias utilizadas foram a seguir passagem 10 pós cultura, para manter o fenótipo mais próximo para os tecidos primários.

análise de citometria de fluxo de células primárias epiteliais e de fibroblastos isolados a partir de tecidos de cancro do endométrio foi realizada após marcação das células com o anticorpo CD326 -conjugated com AlexaFluor647 CD90 e anticorpo conjugado com PE. A linha de células do endométrio epitelial, ECC-1 (A), células epiteliais EC6-EP (B) e CE14-PE (C), linha celular de estroma endometrial normal de primário, t-HESC (D) e células de fibroblastos primários, EC6-Fib ( e), caracterização molecular EC7-Fib (F), EC11-Fib (G) e EC14-Fib (H).

de culturas primárias de endométrio

Para caracterizar ainda mais o isolado células epiteliais e fibroblastos, foi realizada RT-PCR quantitativo para determinar a expressão de vários marcadores epiteliais e de fibroblastos. As células epiteliais EC6-PE e EC14-EP mostrou alta expressão de EpCAM, citoqueratina 8 e E-caderina, com baixa expressão de vimentina e α-SMA (Figura 3A, B). O nível de expressão mostrada foi normalizado com o nível de GAPDH. Em contraste, as quatro células de fibroblastos isolados a partir de tecidos de cancro do endométrio (EC6-Fib, CE7-Fib, EC11-Fib e CE14-Fib) mostrou uma maior expressão de vimentina e α-SMA, com baixa expressão de EpCAM, E-caderina e citoqueratina 8 (Figura 3A-C). Estes dados sugerem que fomos bem sucedidos no isolamento de células epiteliais relativamente puros com os seus homólogos de fibroblastos a partir de tecidos de cancro do endométrio.

O RNA total foi sujeito a quantitativo em tempo real A análise de PCR de marcadores epiteliais (EpCAM, citoqueratina 8, E -cadherin), marcadores de fibroblasto (actina de músculo liso alfa (αSMA), vimentina) (A-C), o receptor de estrogénio e 2 1 (ER1, 2), receptor de progesterona (PR), associado com progestagénio proteína do endométrio (Paep) e metaloproteinase de matriz 1 e 9 (MMP1, 9) (D-F). Dados, média; barras de erro, S.E.M. Os dados apresentados são representativos de três experiências independentes.

Além disso, nós também determinou que ambas as células epiteliais e de fibroblastos de tecidos CE, revelaram variados graus de receptores de estrogênio e progesterona (ER1, ER2 e PR) (Figura 3D-F), consistente com a observação de que CE são tumores sensíveis a hormônios. Medimos a expressão de ARNm de três proteínas normalmente segregadas pelo endométrio, proteína associada ao progestagénio endometrial (Paep) e da metaloproteinase de matriz 1 e 9 (MMP1, 9) nestas células. Tal como mostrado na Figura 3D-F, Paep foram expressos principalmente por fibroblastos, e uma maior expressão de MMP1 foi observada em comparação com a de MMP9 em ambas as células epiteliais e de fibroblastos. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem fortemente que estas células epiteliais e de fibroblastos primários foram mantendo seus

In vivo

fenótipos.

Efeitos diferenciais da secreção de fibroblastos endometrial em células de cancro do endométrio

tinha sido previamente demonstrado que as secreções das células endometriais normais de fibroblasto foram inibidor do crescimento para a linha celular de cancro do endométrio, as células de Ishikawa [26]. Consistentemente, meios condicionados da linha de células normais de fibroblasto endometrial t-HESC inibiu a proliferação de ECC-1 e HEC-1A, de um modo dependente da dose (Figura 4A, B). A 2 ug /mL, observou-se uma inibição significativa do crescimento de 51% e 69% em ECC-1 e HEC-1A, respectivamente. Da mesma forma, as células de cancro do endométrio primários, EC6-Ep e EC14-Ep também foram o crescimento inibido pelos meios de comunicação T-HESC condicionado (EC6-Ep: 60%; EC14-Ep: 67%). (Figura 4C, D)

ECC-1 (A) e HEC-1A (B) As linhas celulares e EC6-EP (C) e CE14-EP (D), as células de cancro do endométrio primários foram testados com meios condicionados preparados a partir de f ibroblastos associados a cancro (EC6-Fib , EC7-Fib, EC11-Fib e EC14-Fib) ea linha endometrial normal de células de fibroblastos (T-HESC) durante 72 horas. A viabilidade celular foi examinada utilizando um ensaio de MTT e foram normalizadas com o controlo (meio contendo 2% de FBS). FAC mostrados são a média de todas as quatro fibroblastos associados ao cancro testadas. Dados, média; barras de erro, S.E.M. *,

P Art 0,005 ;. **,

P Art 0,0001. Os dados apresentados são representativos de três experiências independentes.

Para determinar e comparar os efeitos da FAC secreções em células de câncer de endométrio, colhemos meios condicionados a partir de células de fibroblastos 72 horas-cultivadas, e depois tratada ECC-1 e linhas celulares de cancro HEC-1A humanas do endométrio durante 72 horas. Curiosamente, meios condicionados a partir de fibroblastos associados ao câncer (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib e EC14-FIB) induziu um efeito contrastante: os crescimentos de ambas as células de cancro do endométrio primárias (EC6-Ep e EC14-Ep) e as células de cancro do endométrio comerciais (ECC-1 e HEC-1A) foram marcadamente aumentada de uma maneira dependente da dose (Figura 4A-D). maiores efeitos foram observados com ECC-1 e linhas de células HEC-1A do que em culturas primárias, EC6-Ep e EC14-Ep. Entre os FAC, CE-11-Fib demonstraram as a maioria dos efeitos de promoção de crescimento, que varia de 135% a 274% de crescimento em comparação com células não tratadas. Quando estes efeitos CAF individuais foram combinados (rotulado como FAC), houve uma diferença significativa do crescimento celular mediada por cento por FAC e t-HESC a 2 ug /uL de tratamento (

P

0,05) (Figura 4A -D).

para excluir a possibilidade de que o FAC-promotora do crescimento efeitos foram devidos aos nossos procedimentos de cultura de células, foram isoladas a partir de um tecido fibroblastos hiperplasia atípica, uma condição benigna endométrio, utilizando abordagem semelhante. Os fibroblastos isolados (EH-FIB) apresentaram morfologia fibroblástica semelhante

in vitro

, e expressou alto nível de CD90 (65%) (Figura 5A-C). Usando o meio condicionado a partir destas células, foram examinados os seus efeitos sobre a proliferação de células de ambas as linhas celulares de cancro (ECC-1 e HEC-1a) e células epiteliais primárias (EC6-PE e CE14-PE). Tal como mostrado na Figura 5D, meios condicionados EH-Fib não afectou de forma significativa a proliferação de células ECC-1 e HEC-1A. No entanto, quando testados em células epiteliais primárias EC6-PE e CE14-PE, EH-Fib inibiu o crescimento de uma forma dependente da dose, com uma média de 69% a 2 ug /mL de concentração (Figura 5D). Estes dados sugerem que os efeitos de promoção do crescimento por FAC é específica, e não devido à seleção pelo nosso procedimento experimental.

hematoxilina e eosina (A) e da imagem de contraste de fase (B) de células de fibroblastos isolados de humanos tecido hiperplasia atípica (EH-Fib); Ampliação, 100x. (C) A citometria de fluxo análise do EH-Fib coradas com o marcador epitelial CD326-Alexa Fluor 647 e fibroblastos marcador CD90-PE. (D) Ensaio de viabilidade celular para determinar os efeitos de meio condicionado EH-Fib em linhas celulares de cancro do endométrio (ECC-1 e HEC-1a) e células epiteliais primárias (EC6-PE e CE14-PE) após 72 horas de tratamento. Dados, média; barras de erro, S.E.M. *,

P Art 0,01. Os dados apresentados são representativos de três experiências independentes.

A ativação do PI3K /Akt e MAPK /Erk percursos na proliferação de células de câncer endometrial mediada por fibroblastos associados ao câncer

Para elucidar o mecanismo subjacente o crescimento promovendo efeitos da secreção FAC na CE, determinou-se a ativação de PI3K /Akt e MAPK /Erk, duas grandes vias de sobrevivência implicado no cancro endometrial. Consistente com o estudo anterior [27], tratamento de-t-HESC meio condicionado de fibroblastos normais marcadamente reduzida fosfo-Akt e a expressão da proteína fosfo-Erk em células ECC-1, como mostrado com transferência de Western e ensaios de ELISA (Figura 6A, B). Em contraste, o nível de proteína de fosfo-Akt estava moderadamente elevada quando as células ECC-1 foram tratados com EC6-Fib, CE7-Fib, EC11 e EC14-Fib-Fib (Figura 6A, B). Além disso, FAC-tratada ECC-1 de células demonstraram também aumentou o nível de fosfo-Erk, quando comparado com aqueles tratados com meio de controlo (Figura 6A, B).

(A) análise de transferência de Western de phosphorylated- Akt (Ser473) e expressão da proteína em células -Erk ECC-1 depois de tratados com a utilização de células T-células estaminais embrionárias humanas de fibroblastos endometrial normais e em células de fibroblastos associados ao câncer (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib e EC14-FIB). análise de densitometria comparação dos níveis de expressão relativa de P-Akt e Erk-p ao seu teor de proteína total. (B) A análise quantitativa dos fosforilado-Akt (Ser473 e Thr308) e níveis-Erk fosforiladas em células ECC-1 depois tratado com t-HESC ou FAC, em comparação com as células tratadas com o controlo (meio contendo 2% de FBS). ECC-1 (C) e EC6-EP (D) As células foram tratadas com quer via PI3K inibidor selectivo (LY294002) ou Erk via inibidor selectivo (U0126) na presença de f ibroblastos associados a cancro meio condicionado (1 ug /uL) durante 72 horas. Os dados apresentados são a viabilidade celular após normalizada com o controlo (meio contendo 2% de FBS). Dados, média; barras de erro, S.E.M. *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,0001. Os dados apresentados são representativos de duas experiências independentes.

Para investigar ainda mais o papel funcional da via PI3K /Akt e MAPK /Erk vias na proliferação celular mediada por FAC, o próximo tratado ECC-1-EP e EC6 células com PI3K inibidor selectivo (LY294002) e Erk inibidor selectivo (U0126) na presença de EC6-Fib e meios condicionados EC11-Fib durante 72 horas. Ambos LY294002 e U0126 reduziu significativamente a proliferação de células mediada por FAC nestas células (

P

0,0001) (Figura 6C, D). Notavelmente, U0126 causou um efeito inibidor do crescimento em células de maior EC tratadas com meio condicionado EC11-Fib. Os efeitos de LY294002 e U0126 na inibição da proliferação de células de cancro do endométrio foi evidente apenas na presença de FAC meios de secreção, uma vez que estes inibidores afectada minimamente a proliferação das células em meios de controlo (Figura S1). Estes inibidores também exerceram efeitos similares sobre outras células CE, HEC-1A e EC14-EP (Figura S1). Estes dados sugerem que o status de ativação de PI3K /Akt e /ou MAPK /ERK pode ser o ponto-chave pela qual fibroblastos de condições normais e cancerosas regular a proliferação de células de câncer endometrial.

Nós ainda avaliou se rapamicina, um conhecido inibidor de PI3K a jusante, pode ser clinicamente útil para inverter a proliferação celular CE FAC-mediadas. Na presença de EC11-Fib meios de comunicação, o tratamento da rapamicina durante 72 horas eficazmente inibida ECC-1 e a proliferação de células EC6-EP (

P

0,0001) ar (Fig. 7A, B). Na dose mais elevada testada (2 uM), a rapamicina reduziu ECC-1 a partir de células de 180% (ar de tratamento apenas meio) a 40% (meios condicionados e rapamicina) tratamento (

P

0,0001), ao passo que o mínimo inibição foi observada quando as células foram cultivadas em meio de controlo (Fig.7A, B). resultado semelhante foi observado com os efeitos da rapamicina sobre outras células CE, HEC-1A e CE14-EP (Figura S2). Usando rotulagem anexina V, que ainda determinado que a rapamicina inibiu FAC mediada por proliferação de células CE

via

indução de apoptose (Figura 7C-E). Tratamento de ECC-1 com 1 ug /uL EC11-Fib meio condicionado durante 72 horas, não afecta significativamente a percentagem de células em apoptose;