Sumário

Uma plataforma bio-imagem quantitativa é desenvolvido para análise da disseminação do câncer humano num ensaio de vertebrados xenotransplante de curto prazo. Seis dias após a implantação das células cancerosas em embriões de peixe-zebra, imagiologia automatizado em placas de 96 poços acoplados a algoritmos de análise de imagem quantifica espalhar por todo o hospedeiro. Achados neste modelo de correlação com o comportamento em modelos de roedores de xenotransplante de longo prazo para os painéis de poorly- contra linhas celulares altamente maligna da mama, colo-rectal e cancro da próstata. Além disso, as células cancerosas com características mesenquimais dispersas apresentam maior capacidade de difusão do que os tipos de células com a aparência do epitélio. Além disso, a interferência RNA estabelece o papel metástase-supressor para E-caderina neste modelo. Este ensaio bio-imagem inteira animais quantitativa automatizada pode servir como uma primeira linha

in vivo

triagem etapa no pipeline alvo descoberta de drogas anti-câncer

Citation:. Ghotra VPS, Ele s, de Bont H, van der Ent W, Spaink HP, van de Water B, et al. (2012) Automated Whole animal Bio-Imaging Ensaio para o cancro Divulgação Humano. PLoS ONE 7 (2): e31281. doi: 10.1371 /journal.pone.0031281

editor: Laurent RENIA, Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa – Singapore Imunologia Rede, Singapura

Recebido: 02 de agosto de 2011; Aceito: 04 de janeiro de 2012; Publicação: 08 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ghotra et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Sociedade holandesa Câncer (UL-2010-4670) e do projeto do cancro da ZF FP7 UE (HEALTH-F2-2008-201439). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

telas de drogas anti-cancerígenas tradicionais são realizados utilizando linhas celulares crescidas em cultura 2D ou utilizando

em ensaios de ligação in vitro

proteína. a progressão do cancro, no entanto, é um processo complexo de interacções dinâmicas entre as células cancerosas e o organismo que envolve alterações genéticas que conduz para a sobrevivência e proliferação desregulada, angiogénese, invasão e metástase [1]. Idealmente, os genes que desempenham um papel neste processo são identificados pelo

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ablação ou silenciamento. Embora os modelos genéticos do rato para o câncer e tumores humanos modelos xenotransplante celular em roedores continuam a ser essenciais, tais sistemas são caros, lentos e menos passível de ensaios de alto rendimento para a descoberta de drogas-alvo câncer. Há uma clara necessidade de desenvolver rápidos,

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sistemas semi-automáticos para médio e aplicações de rastreio de alto rendimento em alvo descoberta pré-clínica e chumbo identificação de compostos.

A este respeito, peixe-zebra ( ZF) oferecem uma série de vantagens exclusivas para investigar os mecanismos que conduzem a formação e progressão do câncer. ZF são os animais vertebrados que podem ser levantados em grandes números de uma forma rentável. Uma sequência de genoma quase completa revela que a maioria dos genes do cancro e genes supressores de tumores são altamente conservadas entre ZF e seres humanos (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish) e forma ZF tumores espontâneos com histopatológico semelhante e perfis de expressão de gene como tumores humanos [2] – [4]. Importante, a xenotransplantação com células cancerosas humanas é possível [5], [6]. embriões ZF que são usados ​​para esta finalidade carecem de um sistema imune adaptativo, o que aumenta o sucesso do xenotransplante, enquanto que proporcionam um microambiente onde as células tumorais humanas proliferam, migram, formam massas tumorais, e estimulam a angiogénese [5] -. [8]

ZF embriões são particularmente úteis para as plataformas semi alto rendimento da análise microscópica em que são translúcidos, e podem ser mantidos em placas de 96 poços. A transparência óptica da ZF oferece oportunidades de pesquisa emocionantes, permitindo a visualização do processo metastático em alta resolução [8], [9]. Descobertas recentes indicam que uma ampla gama de compostos farmaceuticamente activos ilícito respostas fisiológicas em embriões ZF e inibir o desenvolvimento da doença semelhante aos efeitos em sistemas de mamíferos [10] – [12]. Estes resultados sublinham o potencial para um modelo de xenotransplante de embriões ZF para ser usado no processo de descoberta de drogas anti-cancro. No entanto, nesta altura, utilizando ZF para o rastreio de cancro do fármaco relevante – e genes alvos é limitada pela falta de bioensaios automatizados abrangentes. Aqui, aplicamos automatizado procedimentos de imagem e análise de imagem para um modelo de xenotransplante ZF para desenvolver o ensaio primeira semi-automatizado de todo o organismo quantitativa bio-imagem para a análise de disseminação do câncer em um vertebrado.

Resultados

Nós desenvolvemos um método não invasivo animais bioimaging quantitativa inteiro para a disseminação de células cancerosas humanas xenotransplantadas em embriões ZF em formato de 96 poços. Todas as etapas são descritas resumidamente na Figura 1.

(A) a implantação do saco vitelino de CM-DII rotulados células tumorais em Tg (Fli: EGFP) embriões ZF 2 dias pós-fertilização. (B) O formaldeído fixa 6 embriões dpi dispostas em placas de 96 poços. (C) automatizado de aquisição de imagem usando a plataforma CLSM equipado com palco móvel capta várias pilhas Z por embrião usando 488 e 561 linhas de laser nm. (D e E) a criação automática de imagens compostas prolongado de profundidade. (F) Várias imagens de profundidade estendida que descreve embriões que encontram-se em diferentes orientações laterais. (L) Automated reorientação uniforme de imagens. (H) Gráfico de dispersão representando ônus focos tumorais em vários embriões pertencentes a uma condição experimental.

Automated captura de imagem e pré-processamento de

células tumorais

CMDiI marcados foram injetados na gema sac de embriões fli-EGFP 2 dias de idade [13] e fixas 6 dias pós-implantação (dpi) (Figura 1A). embriões fixos foram dispostos em 96 poços de vidro placas de fundo para a imagem latente automatizado ( 5 minutos por placa) (Figura 1B). microscopia de epi-fluorescência falhou para detectar células tumorais disseminada devido a um excesso de fundo da massa do tumor primário. Portanto, o uso de um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM), combinada com uma fase automatizado; várias pilhas z por embrião foram capturados em cada poço num processo totalmente automatizado (Figura 1C, 1D e vídeo S1). imagens confocais foram automaticamente convertidos em imagens compostas de profundidade estendida (Figura 1E) que foram rearranjadas para uma orientação uniforme (Figura 1F e G) para permitir uma análise quantitativa de imagens automatizada (Figura 1H).

análise multiparamétrico automatizado de câncer disseminação de células

Depois de ter condições para geração de imagens automatizada e imagem de pré-processamento de células tumorais embriões implantados ZF estabelecido; que posteriormente desenvolvido um algoritmo para análise automatizada de carga focos tumorais nas imagens pós-processados ​​ZF. Para isso, software baseada em imagem-Pro foi desenvolvido, que realizou essencialmente três funções principais (ver secção materiais e métodos para obter informações detalhadas sobre a macro ‘s).

1)

Reorientação das imagens (Figura 2): todos os embriões foram automaticamente reorientado para uma orientação horizontal, com a cabeça para a direita e o saco vitelino para o fundo.

2)

Determinação da posição de injecção de células tumorais marcadas (Figura 3A-C): a posição de injecção foi calculada a partir das imagens com base no canal de GFP segmentada (e confirmada por inspecção visual utilizando o canal vermelho).

3)

detecção de focos de tumor (Figura 3D e E):. O canal vermelho foi segmentada usando um limiar de intensidade e mínimo e filtros máximos área

(A) imagem Maior profundidade de 6 dpi embrião ZF. (B) imagem cinzento valor da combinação de canais de verde e vermelho. (C) borrada imagem cinzenta após a aplicação do filtro fechar para otimizar determinação do contorno. (D) após a aplicação do embrião segmentado limiar de intensidade e filtro de área. Arrowhead indica um objeto vermelho fora do contorno que é excluída de segmentação. (E) Imagem colhida com objeto somente selecionado. (F) Embryo rodado por X ° para a reorientação horizontal. (G e H) Determinação do valor x posição do centro de massa (

cm

) e centro de baricentro (

cc

). (I) aleta horizontal da imagem somente se

cm

está no lado esquerdo do

cc, resultando em imagens com a cabeça do embrião sempre para o lado direito. (J) após a aplicação de Imagem filtro fechado para o canal verde e vermelho combinados para obter o contorno do embrião. Ponto deitada em 75% distância do extremo esquerdo do esboço do embrião é calculado. Eixo Y é desenhado neste X-posição de superior para contorno inferior. retângulo superior 1 é desenhada. (K) rectângulo inferior 2 é desenhada. (L) aleta vertical da imagem somente se intensidade do vermelho no retângulo 1 é maior do que no rectângulo 2. (M) Representação esquemática de cálculos para etapas E-I. No total, este procedimento resulta em imagens em que a cabeça está do lado direito e o saco vitelino fica na parte inferior da imagem. Barra de escala = 200 mm na imagem Maior profundidade de 6 embrião fixa dpi após realinhamento E e I.

(A). (B) esboço do embrião a partir do canal GFP segmentado e do eixo Y se cruzam eixo X em 75% a partir de extrema esquerda. (C) ponto de injecção calculado em 75% distância da extrema esquerda e 75% a partir da posição de topo Y. (D) Segmentado canal vermelho mostrando fardo focos tumorais no embrião. (E) focos tumorais identificadas. (F) Vários parâmetros de carga focos tumorais calculados por embrião. Cada número na imagem corresponde a um foco de tumor. (G) disseminação do tumor focos em um único embrião representada como gráfico de dispersão (coordenadas 0,0 representa no local da injecção calculado). (H) Combinado gráfico de dispersão mostrando tumor focos divulgação de 39 embriões injetados. (I) Quantificação da distância cumulativa (CD). Cada quadrado preenchido representa distância acumulada do ponto de injecção de todos os focos do tumor identificado em um único embrião. distância média cumulativa (MCD) nos 39 embriões injetados neste experimento é 15024 m. Barra de escala = 200 mm em A.

Os dados foram exportados para o Excel e vários parâmetros numéricos foram calculados para descrever a carga de células tumorais por embrião. Estes número total de focos tumorais incluído, a distância média de focos do tumor no local da injecção, e a distância percorrida acumulada no local da injecção (Figura 3F). Como apenas o parâmetro de distância número cumulativo combinado de células disseminadas com sua distância do local da injecção, que argumentou que este parâmetro melhor refletiu a capacidade de disseminação do tumor (Figura S1). Os dados foram representados na forma de gráficos que indicam posições de focos do tumor em relação ao ponto de injecção (nas coordenadas x, y = 0,0) para cada embrião (Figura 3G) ou todos os embriões de uma única condição experimental (Figura 3H). A partir destes dados, a distância cumulativa de todos os focos de tumores detectados foi calculado por embrião (CD) e, subsequentemente, em médias de todos os embriões injectados em um grupo experimental como uma quantificação final da disseminação de células de tumor (distância média cumulativa (MCD) (Figura 3I e S1) .

Foram realizadas experiências para determinar o ponto de tempo mais curto que permitiu a discriminação robusta entre linhas celulares mal agressivos e altamente agressivos Usando LnCAP e PC3, como tal, um exemplo para o câncer de próstata [14] – [19]. não observamos diferença a 2 dpi; MCD de PC3 poderia ser distinguido do MCD de LnCAP a 4 dpi; e aos 6 dpi MCD foi marcadamente maior em PC3 comparação com LnCAP com forte significância (Figura 4) Portanto, 6 dpi foi escolhido para análise em todos. mais experiências.

diagramas de dispersão (a e B) LnCAP (a) ou as células PC3 (B) foram implantadas e os embriões foram fixados em 2, 4, ou 6 dpi para imagens (imagens de imunof luorescência e de análise de imagem automatizada ( )). imagens linha inferior (barra de escala = 50 mm) mostram zoom-in da área marcada pela linha pontilhada em imagens linha superior (barra de escala = 100 mm). (C) CD em 2, 4 e 6 dpi para LnCAP (cinza) e embriões injetados-PC3 (preto) calculados a partir de gráficos de dispersão em A e B, respectivamente. teste estatístico para diferença entre LnCAP e PC3 em diferentes dpi é indicado. * P 0,05, *** p . 0.001

Para caracterizar focos tumorais identificadas por este método, foi calculado o diâmetro médio de objetos vermelhos segmentadas na região da cauda do PC3 implantado embriões. O diâmetro médio da média era ~ 15 pM com alguns objectos maiores, até -45? M, mas não há objectos com diâmetro médio de 8 uM sendo seleccionado para a análise, encaixando com a identificação de células tumorais individuais ou pequenos grupos (Figura 5A). Analisamos ainda mais focos tumorais identificadas por imagens de alta resolução, a reconstrução 3D e renderização de superfície (Figura 5B e Vídeo S2). Isto confirmou e ampliou a constatação de que as células tumorais individuais ou pequenos grupos foram identificados pela análise de imagem automatizado e mostrou células tumorais que interagem com a vasculatura do hospedeiro (Figura 5B). Para descartar artefatos devido à rotulagem CMDiI, injetamos mCherry rotulados células PC3. Em completo acordo com as propriedades de objetos vermelhos identificados após a injeção de PC3 CMDiI marcado, foram observadas células PC3-mCherry individuais em estreita associação com os vasos sanguíneos do host (Figura 5C e Vídeo S3). Finalmente, experimentos usando embriões não implantados (Figura 6A) e comparação de células PC3 CM-DII rotulados injetado em embriões faltam todos os pigmentos (Figura 6B e C) padrão fli-EGFP ou Casper fli-EGFP, descartou qualquer falsos positivos devido a autofluorescência de células de pigmento.

(a) Quantificação do diâmetro médio de focos de células de tumor de macro-identificado a partir da região da cauda de embriões injectados com PC3. Os dados obtidos a partir de 5 embriões. (B) de imagem de alta resolução de focos de células tumorais PC3 CM-DII marcado. (B1) focos de células tumorais PC3 macro-identificado. (B2) Zoom-in na área indicada no

B

1 mostra células tumorais em associação com a vasculatura do hospedeiro. (B3 e B4) Três reconstrução e superfície de reprodução tridimensional da área em inserção de B2; setas apontam para células tumorais parcialmente dentro vaso anastomose longitudinal distal (Vídeo S2 e S3). (C) de imagem de alta resolução de PC3-mCherry focos de células tumorais. C 1-4, como B1-4 para PC3-mCherry. barra de escala é de 100 mm em B1 e C1; 50 um em B2 e C2; 15 um em B3 e C3; 10 um em inserções em C3 e B3; 5 mm em B4 e C4.

(A-C) Em cada caso superior imagem da esquerda mostra o sinal verde (Fli-EGFP) e imagem superior direita mostra o sinal vermelho para células tumorais. imagens de fundo mostrar zooms de área de box em imagem superior esquerdo proporcionando verde (à esquerda) e sinal vermelho (meio) e luz transmitida (à direita). barra de escala é de 100 mm em imagens que mostram embrião inteiro e 50 mm em imagens ampliadas. (A) de embriões não-implantado fli-EGFP fotografada em 8 dias após a fertilização. Número de embriões, o número de células tumorais não implantados (falsamente) detectada pelo método de imagem e análise de imagem automatizada está indicado à direita. (B) Fli-EGFP embrião implantado com PC3 CM-DII marcado fotografada em 6 dpi. (C) Fli-EGFP Casper embrião implantado com PC3 CM-DII marcado fotografada em 6 dpi.

No seu conjunto, este método elimina a necessidade de escore visual e permite a geração automatizada e arquivamento de imagens e dados numéricos, descrevendo a disseminação de células tumorais num organismo vertebrado. Além disso, para as células tumorais identificadas por este ensaio bio-imagem automatizado, interações tumor-hospedeiro pode ser ainda estudada em detalhe por microscopia de alta resolução

Validação do ensaio:. Correlação com o comportamento em modelos do rato e epitelial contra o fenótipo disperso

para demonstrar a aplicabilidade da nossa plataforma automatizada para diferenciar células cancerosas entre mal agressivos e altamente agressivos, foram analisados ​​três diferentes painéis de linhas celulares:

1)

para o câncer de próstata, PC3 (altamente metastático em modelos de ratos; próstata metástase de carcinoma /osso, o crescimento espalhados na cultura 2D;; andrógeno independente marcadores mesenquimais) e LNCaP (muito mal metastático em modelos de ratos; carcinoma nó de próstata /linfa; expressão de marcadores de diferenciação da próstata; ilhas epiteliais na cultura 2D; marcadores epiteliais) foram analisados ​​[14] – [19].

2)

Para o cancro da mama, BT474 (metastático em modelos de ratos; mama invasivo carcinoma ductal /conduta; ER + /+ /PR p53mutated; expressão alta Her2; “epitelial fracamente luminal como” fenótipo na cultura; expressão reduzida de células epiteliais marcadores) e MCF7 (potencial muito fraco metastático na ausência de oncogenes ectopicamente expressas, o adenocarcinoma da mama /derrame pleural; ER + /PR + /p53 normal; baixo Her2; ilhas epiteliais em cultura 2D; marcadores epiteliais) foram analisados ​​[20] – [23 ].

3)

para o cancro colorectal, SW620 (adenocarcinoma colorretal Dukes ‘Tipo C /linfonodo metástases, crescimento espalhados na cultura 2D; marcadores mesenquimais) e HT29 (colorectal adenocarcinoma /cólon; ilhas epiteliais na cultura 2D; marcadores epiteliais ) foram analisados ​​[24]. Surpreendentemente, para cada tipo de cancro testadas, difusão neste ensaio de xenoenxerto ZF significativamente correlacionada com a capacidade metastática relatada em modelos de rato e /ou características que se sabe estarem associados com a progressão do cancro, incluindo marcadores de diferenciação ou epitelial contra fenótipo disperso (Figura 7A e B; A Figura S2 ). Estes dados validar este método de bio-imagem automatizado de curto prazo e mostra que ele representa uma poderosa ferramenta para prever a agressividade das células cancerosas em mais complexa e de longo prazo

In vivo

sistemas.

( a) representação gráfico de dispersão de disseminação de células tumorais de próstata indicada (

gráficos superiores), mama (

média

) e linhas celulares de cancro colo-rectal (

inferiores

gráficos). Número de embriões injectados a partir de 2 repetições biológicas é indicado. (B) MCD determinada a partir dos dados representados em A. Os dados estão apresentados como média ± S.E.M. * P 0,05, *** p 0,001. (C) 6 dpi embriões injectados com PC3 mostrando fardo focos tumorais determinada a partir canal vermelho segmentada (

esquerdo

), e representado como gráfico de dispersão (

direita). (D) a determinação automatizada da região de exclusão de focos de tumor em torno do local de implantação e na área do desenvolvimento intestinal (

esquerdo

) e restantes focos tumorais representada como gráfico de dispersão (

direito

). (E) MCD antes (

black

) e após a exclusão (

barras brancas

) para a próstata indicada (

esquerdo

), mama (

média

), e as linhas de câncer colorretal (

gráfico da direita

). Dobre diferença entre linhas de células mal e altamente agressivos é indicado. Os dados são apresentados como média ± S.E.M. * P 0,05, *** p 0,001. (F) MCD após a exclusão de PC3 e MCF7 em vários experimentos independentes demonstra reprodutibilidade. Os dados são apresentados como média ± S.E.M.

Ampla movimento celular ZF ocorre na região do saco vitelino, onde o desenvolvimento intestinal ocorre dentro do prazo de nossa análise [25]. Queríamos excluir qualquer influência da migração passiva de células tumorais implantadas devido a este processo de desenvolvimento, perto da área de implantação primário. Por esta razão, foi ampliada a macro com uma etapa adicional na qual todos os focos tumorais dentro de um quadrado que abrange esta região foram excluídos da análise de uma forma automatizada imparcial (Figura 7C e D). Embora isso possa levar a uma subestimação do parâmetro cumulativo distância, descobrimos que este passo exclusão ampliou ainda mais a janela entre o não-agressivo contra tipos de células altamente agressivos (Figura 7e). Além disso, a análise das várias experiências independentes, utilizando PC3, BT474 e MCF7, demonstraram que esta metodologia é altamente reprodutível (Figura 7F).

Nós expandimos a análise a um painel mais amplo de linhas celulares de cancro humanas de diferentes origens, incluindo da próstata, da mama, do pulmão, colo-rectal, da pele, e tecido conjuntivo. Curiosamente, quando estas linhas foram agrupados de acordo com sua morfologia em cultura 2D e expressão de epiteliais ou mesenquimais marcadores, houve uma correlação clara de alta difusão com um fenótipo disperso (uma notável exceção foi HT1299, que não divulgar de forma eficaz); todas as linhas de células que crescem como ilhas epiteliais tinha muito baixa capacidade de disseminação (Figura 8A; Tabela S1). Nós testados funcionalmente o papel de um marcador normal do fenótipo epitelial, a célula-célula receptor de adesão da caderina-E. Para isso, utilizou-se células 4T1 de ratinho de carcinoma da mama que possuem um fenótipo intermediário, que crescem como aglomerados de células frouxamente ligados em 2D e que expressam E-caderina, bem como alguns marcadores mesenquimais, tais como a vimentina (Figura 8B). E-caderina foi silenciados resultando num fenótipo completamente dispersos em 2D (Figura 8B e C) e as células foram injectadas em ZF para determinar a capacidade de difusão. Com efeito, shRNA segmentação de E-caderina, mas não fortemente controlar shRNA aumento da disseminação de células 4T1 e o método de bio-imagem automatizada permitiu a separação significativa entre 4T1shCdh1 por um lado e 4T1Wt 4T1shCtr e no outro (Figura 8D-F).

(a) MCD num painel de linhas celulares de cancro humano, a partir de diferentes origens. Número de embriões injectados é indicado.

As barras brancas indicam

linhas de células que mostram um fenótipo espalhados em cultura de células 2D.

As barras pretas

indicam linhas de células que crescem como ilhas epiteliais na cultura 2D.

barras cinza

indicam linhas de células com características de células epiteliais /mesenquimais intermédios /mista. células (B) 4T1 de câncer de mama crescer como ilhas de células fusiformes frouxamente ligados (

esquerdo) e crescimento completamente dispersa de 4T1 células após silenciamento E-caderina (

direito

). expressão na superfície (C) E-caderina por FACS. representação lote (D) de dispersão dos indicados 4T1 variantes. Número de embriões injectados a partir de 2 experiências independentes é mostrado. (E) Imagens representativas de embriões injectados com indicados 4T1 variantes. (F) MCD determinada a partir dos dados representados em D. Os dados são apresentados em relação ao tipo selvagem 4T1 como a média ± S.E.M. ** P 0,01. barra de escala é de 200 mm em E.

modelo de bio-imagem de todo o organismo todo, um caudal médio de curto prazo totalmente automatizado foi desenvolvido que distingue com boas tipos de células cancerosas reprodutibilidade que crescem como ilhas ou ter marcadores epiteliais ou têm sido mostrados para ser fracamente agressivo em modelos de ratinho a partir de linhas de células que são dispersos ou ter mais CARACTERÍSTICAS mesenquimais ou são conhecidos para metastizar em ratinhos. É compatível com RNAi para identificação de reguladores de disseminação de células cancerosas, e permite a mudança de imagem rápido de baixa resolução para de alta resolução de uma análise detalhada para estudar os efeitos sobre as propriedades da célula tumoral ou interações célula-hospedeiro tumorais.

Discussão

Aqui, nós desenvolvemos um curto prazo

in vivo

ensaio de xenoenxerto ZF que é compatível com a imagem automatizada em placas de 96 poços e acoplado a análise de difusão de células de tumor totalmente automatizado. Este ensaio representa o primeiro ensaio bioimaging organismo inteiro automatizado num vertebrado que permite estudar os aspectos da progressão do cancro. Nossos resultados mostram que este ensaio reflete de perto os resultados obtidos em mais caro e muito mais baixos ensaios de rendimento tais como xenoenxertos de roedores

O modelo de xenotransplante ZF foi previamente aplicado a estudos de migração câncer [5] – [9].. Existem limitações para este modelo, incluindo as diferenças de potencial no microambiente de acolhimento e a necessidade de trabalhar a temperaturas que são compatíveis com a sobrevivência e migração de células de mamíferos e, ao mesmo tempo que é favorável para a fisiologia normal ZF. No entanto, temos modificado condições experimentais tais que o comportamento de um grande painel de linhas celulares de cancro humano, a partir de várias origens se assemelha de perto o comportamento conhecido em modelos de roedores. Além disso, o nosso trabalho fornece este modelo com a automatização em imagem e análise de imagem, bem como com o poder estatístico necessário para aplicação em procedimentos de triagem.

Nós fornecemos prova de princípio para essa aplicabilidade testando um regulador conhecido de migração de células de cancro. Usando um painel de linhas celulares que mostram que esta plataforma de imagem pode discriminar entre tipos de células com características mais epiteliais ou crescendo em ilhas contra aqueles com mais características mesenquimais ou exibir um fenótipo disperso). Em seguida, combinar o ensaio com RNAi para silenciar a molécula de adesão célula-célula, E-caderina. Obtemos rapidamente dados de ~ 90 animais por grupo experimental em duas réplicas biológicas apoiando o papel inibitório de E-caderina na disseminação do cancro.

Tomados em conjunto, este ensaio de transferência forma relativamente rápida podem ser utilizadas como uma primeira

in vivo

plataforma de análise na calha descoberta alvo. Ele fornece a automação e poder estatístico para identificar os hits de grande escala nos esforços de triagem vitro RNAi que merecem mais tempo e estudos de consumo de dinheiro em modelos de ratos. direções futuras incluirão incorporação da análise semelhante automatizada de indução de angiogênese tumoral e proliferação de células tumorais para capturar vários aspectos da progressão do cancro dentro deste ensaio bio-imagem.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e ZF manuseamento

Todas as linhas celulares de cancro humano, foram obtidas de ATCC e cultivadas de acordo com o protocolo fornecido. ZF e embriões foram levantadas, encenado e mantido de acordo com os procedimentos padrão em conformidade com as normas de protecção dos animais locais. A linha transgénica ZF Tg (FLI1: EGFP) expressando GFP em células endoteliais no fundo de tipo selvagem ou “Casper”, foi mantida de acordo com os protocolos padrão (https://ZFIN.org). células PC3-mCherry foram gerados utilizando um vector lentiviral pCMV-mCherry-bc-puro-Kl201 (fornecida pelo Dr. R.C. Hoeben, Leiden University Medical Center, Leiden, NL). células 4T1-shCdh1 e 4T1-shCtr foram geradas por transdução lentiviral usando TRC shRNA constrói (Sigma)

procedimento de implante

As células de mamíferos foram marcadas com rastreador celular fluorescente lipofílico (CM-DII;. excitação no máximo 553 nm, lote n C7000;. Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A suspensão celular marcada foi carregados em agulhas capilares de vidro de borosilicato (1 mm × 0,78 milímetros D.O. I.D .; Harvard Apparatus) e as injecções foram realizadas intrayolk usando uma bomba pneumática Pico e um manipulador (WPI). Dechorionated 2 dias pós-fertilização ZF embriões foram anestesiados com 0,003% tricaína (Sigma) e posicionado sobre uma placa de Petri 10 centímetros revestida com 1% de agarose. Ao controlar a pressão de injecção e a duração do número de células injectadas foi fixado em -100 por embrião como determinado por contagem de células padrão de gotas de injecção. embriões injectados foram mantidos em água de ovo a 34 ° C e fixas 6 dpi com paraformaldeído a 4%.

microscopia automatizada e imagens de alta resolução

embriões fixos estavam dispostas manualmente em 96 placas de fundo bem de vidro (no.655892 materiais; Greiner) com cada uma das cavidades contendo um único embrião. Isto foi feito facilmente em 5 min por placa. A aquisição de imagens foi realizada usando uma Nikon Eclipse Ti CLSM, que integra a óptica avançada, detecção de fluorescência e hardware de digitalização em uma única plataforma controlada por software EZ C1. 488 e 561 luzes de laser nm foram usadas para excitar Tg (FLI1: EGFP) embriões e DiI- células tumorais positivas. sagital seções (laterais) de série foram capturados 6 dpi de forma automatizada (14 × 30 mm) usando uma objetiva seca Plano de Apo 4X Nikon com 0,2 NA e 20 WD. Para imagens em três dimensões de 0,5 mm pilhas Z passo (1024 × 1024 planos focais, 50-74 mm de profundidade) foram adquiridos usando 40 × Nikon objectivo do plano de fluor seco com 0,75 e 0,66 NA WD.

software de análise de imagem

imagem automatizada de pré-processamento, análise automatizada e reconstrução e superfície de renderização 3D foram realizados pelo programa image-Pro Plus-base da Media Cybernetics.

Maior profundidade de campo

o software utilizado imagens coloridas Z-stack do microscópio confocal. As imagens cinzentas obtidos foram pseudo colorida com verde para GFP e vermelho para CM-DII rotulados células tumorais. A macro foi construído que usa dois canais para processamento em lote de todas as imagens em uma pasta. Primeiro do Z-stack um único, em foco, imagem composta foi feita. Pixels na Z-pilha foram analisados. Para cada posição, o elemento de imagem do plano com a maior variância ou o contraste local foi seleccionado. Esse pixel foi então utilizado para a imagem composta final.

orientação automatizada dos embriões (Figura 2)

Para a análise de imagem, todos os embriões devem ter a mesma orientação. Para isso, foi desenvolvido um macro em que as imagens foram modificados de modo a que todos os embriões eram orientados horizontalmente, com a cabeça para a direita e o saco vitelino no sentido da parte inferior da imagem

alinhamento horizontal automatizado:. A cor imagem foi convertida para uma imagem de valor de cinzento para dar uma combinação da GFP e canais vermelho. O embrião foi então segmentado utilizando valor de intensidade histograma média e filtro de mínima e máxima área. Em seguida, determinou-se um valor de direcção do objecto segmentado, o qual foi utilizado para dar o embrião de uma posição horizontal

orientação horizontal automatizado:. O valor da posição X do centro de massa foi determinada a partir da GFP combinados e cinza canais vermelho. Se esse valor foi localizada à esquerda do centro de centróide, a imagem foi virado horizontalmente. Em todos os casos, o que proporcionou imagens em que a cabeça do embrião foi orientada para a direita

Automated orientação vertical:. A partir das posições horizontais exteriores, o ponto situado no eixo-X a 75% distância do foi determinada extrema esquerda do esboço do embrião. Nesta posição X do eixo Y foi desenhada de cima para contornos inferiores. Um rectângulo foi desenhado a partir de -20 a 20 pixels horizontalmente a partir do ponto de 75%, calculado e verticalmente 80 pixels acima do meio do eixo Y superior. Outro retângulo foi elaborado com os parâmetros horizontais idênticas e verticalmente 80 pixels abaixo do meio do eixo Y inferior. A intensidade média de fluorescência no canal vermelho foi determinada para ambos os rectângulos. Se a intensidade foi maior do rectângulo superior em comparação com o rectângulo inferior, a imagem foi virado verticalmente. O mesmo procedimento pode ser realizado utilizando o canal de GFP em que as imagens de casos foram invertidos se a intensidade foi maior no rectângulo inferior. A inspecção visual mostrou que este procedimento, em todos os casos, resultou em imagens onde o saco vitelino foi orientada para a parte inferior da imagem.

cálculo automático da posição de injecção das células marcadas com Cy3

Primeiro foram determinados o mais à esquerda e mais à direita as posições X do esboço embrião. A partir dessas posições X, foi determinado um ponto de mentir a 75% da extrema esquerda. Então, a partir desta posição X foram determinadas as posições Y superiores e mais baixas. Subsequentemente, a partir destas posições Y foi determinado um ponto encontra-se a 75% a partir da posição mais elevada Y, que foi designado como o ponto de injecção arbitrária.