Abstract

O receptor co-inibitória morte programada-1 (PD-1) limita as respostas imunes e evitar auto-imunidade, no entanto, os tumores explorar esta via para escapar da destruição imune. O receptor co-estimulador OX40 é regulada positivamente em células T após a activação e aumenta a sua expansão clonal, a sobrevivência e a produção de citoquinas quando engatada. Embora os anticorpos anti-OX40 antagonista anti-DP-1 ou agonistas podem promover a rejeição de vários tumores murinos, alguns tumores fracamente imunogénicas foram refractários a este tratamento. No presente estudo, foram avaliados os efeitos e mecanismos de PD-1 bloqueio combinatória e OX40 disparo em um modelo de câncer de ovário murino ID8 antitumorais. Embora indivíduo anti-DP-1 ou tratamento OX40 mAb foi ineficaz na protecção do tumor contra 10 dias estabelecido tumor ID8, desenvolvimento de tumor combinada anti-DP-1 /tratamento OX40 mAb inibiu marcadamente com 60% de ratinhos livres de tumor 90 dias após a inoculação tumoral . protecção do tumor foi associada com uma resposta imunitária sistémica com a memória e a especificidade do antigénio e necessária CD4

+ e CD8 células

+ células T. O anti-PD-1 /tratamento OX40 mAb aumento CD4

+ e CD8

+ células e diminuiu imunossupressora CD4

+ células FoxP3

+ T reguladoras (Treg) e CD11b

+ Gr- 1

+ células mielóides supressoras (MDSC), dando origem a proporções significativamente maiores de ambos efetoras CD4

+ e CD8

+ células para Treg e MDSC na cavidade peritoneal; os dados quantitativos de RT-PCR demonstrou ainda a indução de um meio imunoestimulante local, anti-DP-1 tratamento /OX40 mAb. O baço CD8

+ células T de ratinhos tratados mAb combinados produziram altos níveis de IFN-γ após estimulação antigénio tumoral e exibiram actividade citolítica específica de antigénio. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a testar os efeitos antitumorais de um anti-PD-mAb OX40 combinado /em um modelo de câncer de ovário murino, e os nossos resultados fornecem uma base racional para estudos clínicos que avaliaram a imunoterapia do cancro do ovário usando esta combinação de mAb.

Citation: Guo Z, Wang X, Cheng D, Xia Z, Luan M, Zhang S (2014) PD-1 bloqueio e OX40 Disparo sinergicamente Protege contra o crescimento tumoral em um modelo murino de cancro do ovário. PLoS ONE 9 (2): e89350. doi: 10.1371 /journal.pone.0089350

editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japão

Recebido: 10 de novembro de 2013; Aceito: 20 de janeiro de 2014; Publicação: 27 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Pesquisador Projeto livre de Shengjing Hospital (No.200806). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Fundo

carcinoma do ovário (OC) é o tumor maligno mais letal em mulheres, com 22,280 novos casos e 15.460 mortes estimadas nos Estados Unidos para 2012 [1]. A alta taxa de letalidade de OC é principalmente devido ao estágio avançado da doença no momento do diagnóstico. cancros da fase inicial pode ser curada em até 90% dos pacientes com as terapias actuais [2], mas esta taxa cai substancialmente para a doença avançada, com aproximadamente 30% dos pacientes com OC fase avançada sobrevivem 5 anos após o diagnóstico inicial [3]. O tratamento padrão para câncer de ovário é debulking cirúrgico seguido de quimioterapia à base de platina-taxano [4]. Embora a maioria dos pacientes são sensíveis à quimioterapia no início, a maioria deles acabará por ter uma recaída e morrer da doença. Portanto, novas estratégias são urgentemente necessárias para melhorar os resultados de câncer de ovário.

Acumulando a evidência sugere que a imunoterapia deve ser eficaz para o tratamento OC [5]. Em primeiro lugar, as células expressam OC muitos antigénios associados ao tumor contra as quais foram detectadas respostas imunes específicas [6] – [10]. Em segundo lugar, os estudos pioneiros de Coukos e colegas indicam tumor resposta imune é um determinante crítico dos resultados clínicos dos pacientes com OC apoiados pela estreita correlação entre a sobrevivência desses pacientes e infiltração tumoral com CD3

+ células T na grande anotada clínica amostras [11]. Em terceiro lugar, embora OC é uma doença devastadora, metástases são frequentemente restringida à cavidade peritoneal onde o microambiente do tumor é directamente acessível, o que elimina a necessidade para a entrega sistémica de tratamentos imunoestimulantes [12]. Apesar da abundante evidência de apoio OC imunoterapia, o sucesso clínico com a terapia de base imunitária para OC tem sido geralmente modesto [13].

morte programada uma proteína (PD-1) é um receptor coinhibitory chave nas células T com um estrutura semelhante à de CTLA-4, mas com uma função biológica e ligando de especificidade distinta [14]. funções primariamente em tecidos periféricos, em que as células T podem encontrar o imunossupressor PD-1 ligandos PD-L1 (B7-H1) e PD-L2 (B7-DC), que são expressos por células tumorais, células do estroma, ou ambos 1 PD- [15], [16]. O bloqueio da interacção entre DP-1 e DP-L1 potencia as respostas imunes de células T in vitro e medeia a actividade antitumoral pré-clínica [16] – [18]. PD-L1 é o principal ligando de DP-1, que é sobre-regulada em tumores sólidos, em que podem inibir a produção de citocinas e a actividade citolítica de DP-1

+ CD4 infiltrantes do tumor

+ e CD8

+ células T [14], [19]. Estas características tornam PD-1 /PD-L1 via de um alvo de intervenção promissora para imunoterapia de tumor, que é validado pelo recentemente relataram resultados de dois ensaios clínicos que mostram mAbs específicos para PD-1 e PD-L1 provocar um efeito antitumoral impressionante em não cancro do pulmão de células pequenas, melanoma e cancro das células renais com regressão completa conseguido em alguns doentes [20] – [22]

OX40 (CD137 AKA) é uma molécula co-estimuladora que pertence à família de receptores de TNF expresso principalmente em. efetoras ativadas T (T ef) e células T reguladoras ingênuos [23]. Ligadura de OX40, principalmente em células CD4 +

T, activa NF-kB via e-regula as moléculas anti-apoptóticas da família Bcl-2, que conduz à expansão de células T clonal, a activação, a memória, e a produção de citocinas [24] – [26]. acoplamento OX40 em CD4

+ FoxP3

+ Treg células leva à expansão, a desactivação ou a morte das células, dependendo do meio local [27] – [30]. Dado que OX40 desencadeamento pode potentemente estimular as células T e potencialmente bloquear /eliminar as células T reguladoras, agonistas OX40 foram investigados em vários modelos de tumores pré-clínicos [31] – [34] e um anticorpo monoclonal OX40 anti-humano está actualmente a ser avaliada em testes clínicos (números de registo de ensaios clínicos NCT01303705, NCT01416844, NCT01862900, NCT01644968 e NCT01642290).

Embora os anticorpos PD-1 ou agonistas antagonistas OX40 pode promover a rejeição de alguns tumores murinos, os tumores no entanto, pouco imunogênicas, tais como câncer de ovário ID8 não respondem à terapia com anticorpos sozinhos [35]. Nossa hipótese é que combinado de PD-1 bloqueio e activação OX40 iria promover a imunidade antitumoral. Aqui, usando ID8 murino modelo de cancro do ovário, que mostram que os anticorpos anti-DP-1 tratamento combinado /OX40 mAb significativamente suprimida os 10 dias de crescimento peritoneal do tumor estabelecido ID8, resultando em 60% dos ratinhos tratados tumorais livre 90 dias após a injecção do tumor. Um exame mais minucioso revelou que combinada anti-DP-1 /OX40 mAb proeminente aumento nas células T efectoras e células atenuadas os imunossupressores em locais de tumor com a indução de resposta sistémica específica de antigénio de CTL.

Métodos

Ratos

fêmea C57BL (6-8 semanas de idade) foram adquiridos a partir do Centro Experimental animal da Universidade Medical China. uso de animais foi aprovado pelo Conselho de China Medical University

Cultura de Células

ID8, um clone do carcinoma do ovário MOSEC de C57BL origem /6 foi um presente do Dr. George Coukos (Institutional Review University of Pennsylvania, Filadélfia, EUA) [36]. células de melanoma B16 de murideo, o cancro do pulmão e células EL4 TC1 linfoma de células T foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA). As células de tumor foram cultivadas em meio DMEM completo suplementado com 10% de FBS (Thermo Scientific, Rockford, IL), 100 U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina antes de suspensões de células foram preparadas e transplantada para ratinhos. As células EL4 e os esplenócitos foram mantidas num meio completo de RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, HEPES 25 mM, glutamina 2 mM, 100 U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina.

Anticorpos Monoclonais ( mAbs)

terapêutica anti-OX40 (clone OX-86; Catalog #: BE0031), anti-DP-1 (clone RMT3-23; Catalog # BE0115), anti-CD4 (clone GK1.5; Catálogo #: BE0003-1), anti-CD8 (clone 2.43; Catalog #: BE0061), anti-NK1.1 (clone PK136; Catalog #: BE0036) e controlo de IgG2a de rato de mAb (clone 2A3; Catalog #: BE0089) foram adquiridos de BioXcell (West Lebanon, NH). Os anticorpos usados ​​para a citometria de fluxo foram adquiridos a Tianjing Sungene (Tianjing, China) e eBioscience (San Diego, CA).

As experiências com animais

Ratos (5 ou 10 ratinhos /grupo) foram injectados por via intraperitoneal (ip) com 1 × 10

células 6 ID8 em 0,1 mL de PBS. Nos dias 10, 14 e 18 após a inoculação do tumor, cada ratinho recebeu a injecção i.p. injecção de 200 ug de controlo, anti-DP-1, anti-OX40 ou anti-DP-1 /mAb OX40 em 200 ul de PBS. Os ratos foram pesados ​​duas vezes por semana e verificados diariamente para o sinal clínico de barrigas inchadas indicativo da formação de ascite e para a evidência de toxicidade tais como dificuldade respiratória, mobilidade, perda de peso, diarreia, postura curvada, eo fracasso para comer enquanto histopatologia foi realizado em principais órgãos (ou seja, fígado, rins, intestinos, pulmões, e cólon). Seguindo as diretrizes institucionais, os ratos foram mortos quando eles desenvolveram ascite e teve um aumento de peso 30%. As massas tumorais peritoneais foram recolhidos e pesados, a sobrevivência de cada rato foi registado e calculou-se a sobrevivência global.

Para a avaliação imunológica memória, reunidas (2 experiência independente) 12 ratinhos sobreviventes de longo prazo (90 dias após o primeiro a injecção do tumor) do grupo de terapia anti-DP-1 /OX40 combinada ou ratinhos não afectados com a mesma idade (que serviu de controlo) foram inoculados ip ou por via subcutânea (s.c.) com 1 × 10

6 células ID8 ou 1 × 10

6 sing�icos mas antigenicamente diferentes células TC1. Três diâmetros perpendiculares de s.c Os tumores foram medidos a cada dois dias utilizando um compasso de calibre e os volumes tumorais foram calculados de acordo com a fórmula: 1/2 × (comprimento) x (largura)

2. Os ratinhos foram sacrificados quando pareceram moribundos ou os seus tumores atingiram 10 mm de diâmetro. A sobrevivência de cada rato foi registado e calculou-se a sobrevivência global.

I.p.

Para a depleção de subpopulações de linfócitos, os ratinhos foram injectados com 500 ug do Acm contra CD8, CD4, ou NK1.1, 1 dia antes e dois dias após a inoculação do tumor, seguido de injecção de 200 ug a cada 5 dias durante todo o experimento. A eficácia da depleção de células foi verificada através de coloração de leucócitos do sangue periférico para subconjuntos específicos após a depleção (dados não mostrados).

i.p. Avaliação das células imunes peritoneais (PIC)

ratinhos que tinham sido transplantadas com ID8 células foram sacrificados 7 dias depois de terem sido tratados com o controlo, ou a combinação única mAb combinada descrita como em experiências com animais. Para obter o PIC, 3 ml de PBS foi injectada na cavidade peritoneal de ratinhos com tumores ID8 imediatamente após a eutanásia, o ventre foi massajado e o líquido foi removido, filtrou-se através de um filtro celular de 70 uM (BD Biosciences), lavadas e as células imunes foram isolados usando um tampão de isolamento rato de linfócitos (Cedarlane, Burlington, Ontário) seguindo as instruções do fabricante e a maioria das células resultantes ( 95%). foram as células imunitárias CD45-postive como confirmado por análise de citometria de fluxo (Figura S1)

por citometria de coloração de fluxo, as suspensões de células únicas de PIC foram lavadas com tampão de coloração de FACS e incubadas com o inibidor de ligação ao receptor FC de ratinho (eBioscience) durante 10 minutos antes da coloração com mAbs (Tianjing Sungene) contra CD45 de ratinho (clone 30-F11), CD3 (clone 145-2C11), CD4 (GK1.5 clone), CD8 (clone 53-6,7), CD19 (clone eBio1D3), CD11b (clone M1 /​​70) e Gr-1 (clone RB6-8C5), CD44 ( clone 1M7) e CD62L (clone MEL-14) durante 30 minutos. Para a coloração intracelular de FoxP3 (clone FJK-16 s; eBioscience), as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas seguindo as instruções do kit Cytofix /Cytoperm (BD Bioscience). A citometria de fluxo foi realizada utilizando FACSCalibur (BD Biosciences) e a população de células do sistema imunológico foi seleccionado por gating células CD45-positivas. Os dados foram analisados ​​usando o software Fluxo de Jo (árvore da estrela, Ashland, OR). Todos citometria de fluxo, as experiências foram realizadas pelo menos 3 vezes.

RT-PCR quantitativo

O ARN celular total foi extraído utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, GA) e reversamente transcrito em ADNc utilizando SuperScript III transcriptase reversa (Invitrogen). Expressão de genes de interesse foi analisado em PIC no dia 7 após a terceira injecção de mAb. Os iniciadores para todos os genes testados, incluindo GAPDH controlo interno, foram sintetizados pela Invitrogen, Xangai, China. As sequências dos iniciadores eram tão follows:GAPDH:For:5′-GTGGAGATTGTTGCCATCAACG-3′,Rev:5′-CAGTGGATGCAGGGATGATGTTCTG-3′;T-bet:For:5′-CGGTACCAGAGCGGCAAGT-3′, Rev: 5′-AGCCCCCTTGTTGTTGGTG-3 ‘; FoxP3: Para: 5’-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3 ‘, Rev: 5′-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3′; IFN-γ: Para: 5’-AAAAACCTAAAAAATCTAAATAACT-3 ‘, Rev: 5′-ATCAACAACAACTCCTTTTCCACTT-3′; IL-10: Por: 5’-CTCTTACTGACTGGCATGAGG-3 ‘, Rev: 5′-CCTTGTAGACACCTTGGTCTTGGAG-3’. Quantitative PCR em tempo real foi realizada através de ABI Prism 7500 Real-Time PCR Systerm (Applied Biosystems) com 1 × SYBR Green PCR universal Mastermix (Takara). níveis de transcrição foram calculados de acordo com o método 2-ΔΔCt, normalizadas para a expressão de GAPDH e expressos como alteração vezes em comparação com o controlo.

Análise de IFN-γ e a produção de IL-10 por PIC

Os ratinhos injectados ip com 1 × 10

6 células ID8 10 dia antes foram injectados três vezes em 4 dias de intervalo com 200 ug de controlo ou anti-DP-1 /OX40 mAb. Sete dias após a última injecção de Acm, reunidas PIC (2 × 10

6 /poço) colhidos a partir de ratinhos tratados foram então estimuladas com 50 ng /ml de PMA e 1 ug /ml de ionomicina durante 6 horas antes da análise de IL- 10 e IFN-γ secreção em sobrenadantes de cultura por rato IFN-γ /IL-10 Quantikine Kit ELISA de acordo com o manual. (R D systems, Minneapolis, MN)

a avaliação da resposta imunitária específica do antigénio

isolados esplenócitos de ratinhos tratados foram cultivados na presença de 10 ug /mL de H-2Db-restritos péptidos derivados de mesothelin (aminoácidos 406-414) ou controlar o péptido HPV-E7-derivado (aminoácidos 49-57 ; tudo a partir de GenScript, Nanjing, CA) durante 3 dias. IFN-γ nos sobrenadantes foi determinada por rato IFN-γ Quantikine Kit ELISA (R D systems). Os resultados também foram analisados ​​após a normalização para as percentagens de células do baço CD8

+ T.

Para os ensaios de CTL específicos de mesothelin, foram obtidas células efetoras por coculturing 5 × 10

6 esplenócitos com 5 × 10

5 ID8 células irradiadas com UV durante 4 dias. células alvo EL4 pulsadas com péptido foram gerados por adição de 10 ug /ml de péptido e incubou-se durante 4 horas. A actividade de CTL foi medida usando o kit CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, Madison, WI) seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, as células alvo foram incubadas com números variáveis ​​de células efectoras para cerca de 4 horas, e os sobrenadantes foram então analisados ​​para a libertação de lactato desidrogenase. Os resultados são expressos como percentagem de lise especifica, calculada como (libertação experimental-libertação espontânea /total libertação espontânea) x 100. Em algumas experiências, as células efectoras foram incubadas com anti-CD4 ou CD8 anticorpo (10 ug /mL) durante 2 horas antes do ensaio de CTL.

Para a avaliação de anticorpos específicos de mesotelina, aplicou-se o método descrito anteriormente [37] . O sangue foi obtido a partir de ratinhos ingénuos (5 ratos) ou de murganhos tratados mAb única quando sacrificados (5 ratos) ou tratadas com mAb dois sobreviventes de longo prazo (90 dias após a inoculação do tumor; 4 ratinhos). A presença de anticorpos específicos para mesothelin foi determinada por coloração das células cancerosas de ratinho ID8 ovário utilizando soro de ratinhos tratados em uma diluição 1:200, seguido por coloração com ficoeritrina secundário (PE) -conjugated anticorpo anti-IgG de ratinho (eBioscience). A coloração com disponível comercialmente IgG de ratinho anti-mesotelina (SC-33672; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas) mais anticorpo secundário ou o anticorpo secundário sozinho foi utilizado como controlo positivo ou negativo. Os rácios de intensidade média de fluorescência (MFI) do controle positivo ou soros para MFI de controlo negativo foram calculados.

Estatísticas

Os resultados foram expressos como média ± SEM. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de GraphPad Prism 5. Student foi utilizado para comparar a diferença estatística entre os dois grupos e one-way ANOVA foi utilizada para comparar três ou mais grupos. As taxas de sobrevivência foram analisados ​​utilizando o método de Kaplan-Meier e avaliadas com o teste log-rank com correção de Bonferroni. Diferenças significativas foram aceitos em p . 0,05

Resultados

Combinado anti-PD-1 /tratamento OX40 mAb induziu um efeito antitumoral sinérgica em camundongos portadores de tumor ID8

avaliaram a eficácia antitumoral de anticorpos anti-DP-1 único ou combinado e o mAb anti-OX40 em ratinhos C57BL /6 ip transplantado 10 dias antes com 1 × 10

células 6 ID8. ratos não tratados e ratinhos tratados com um mAb de controlo desenvolveram ascite cerca de 30 dias após a inoculação do tumor e tiveram de ser sacrificados tal como descrito anteriormente [38]. Como mostrado na Figura 1A, quer única mAb teve pouco efeito sobre o crescimento do tumor de 10 dias estabelecidos ID8 levando à formação de ascite ao mesmo tempo quase como ratinhos não tratados ou de controlo tratadas com mAb; No entanto, combinada anti-DP-1 tratamento /OX40 mAb aumentou significativamente a sobrevivência global dos ratinhos com 60% (6 de 10 ratinhos) de ratinhos livres de tumor (confirmado por laparotomia) 90 dias após a injecção do tumor (p 0,001, combinada mAb comparado para mAb única ou controle), e até mesmo ratos sucumbiu ao crescimento do tumor também significativamente prolongado tempo de sobrevivência (MST) significa comparado com o controle ou ratos tratados mAb individuais (Figura 1B; MST 30,90, 34,00, 75,75 34.00and dias para controle, anti- PD-1, anti-OX40 e grupo anti-DP-1 /OX40; p 0,001, em comparação com o mAb combinada única mAb ou controlo). O peso das massas tumorais de ratinhos tratados com o mAb combinada também grandemente reduzido comparado com o do controlo ou ratinhos tratados única mAb (Figura 1C). Uma repetição da experiência originou resultados semelhantes (dados não mostrados). Nestes experimentos com animais, não observamos qualquer toxicidade óbvia, como peso ou perda de cabelo em camundongos que receberam PD-1 anti-/OX40 mAb simples ou combinados. Além disso, também não se detectou qualquer expressão de moléculas de DP-1 e OX40 e os seus respectivos ligandos PD-L1 /PD-L2 e OX40L na superfície de células de cancro do ovário ID8 (dados não mostrados), excluindo a possibilidade de que a inibição de o crescimento do tumor ID8

in vivo

está diretamente mediada por anti-PD-1 ou anti-OX40 mAb.

a, ratos (10 ratos por grupo) transplantado ip com 1 × 10

6 células ID8 10 dias antes foram tratadas três vezes com 200 ug de controlo, anti-DP-1, anti-OX40 e anti-DP-1 /OX40 mAb em 4 dias de sobrevivência intervalo e em geral dos ratinhos foi gravada. B, a média de tempo de sobrevivência de ratos com o crescimento do tumor foi calculado. C, as massas de tumor peritoneal foi pesada quando os ratinhos foram sujeitos a eutanásia com cada ponto que representa cada ratinho. D, a longo prazo sobreviventes (90 dias após o desafio primeiro tumor) ratos (4 ratinhos por grupo) a partir de 2 grupos de tratamento mAb foram retomou com células ID8 dada i.p. ou s.c. ou com células TC1 independentes singeneicos transplantadas s.c., e, em seguida, a sobrevivência global dos ratos foi gravado. E, ratinhos (5 ratinhos por grupo) tratados com anti-DP-1 mAb combinada /OX40 também foram injectados com um anticorpo anti-CD4, anti-CD8, anti-NK1.1, ou mAb de controlo com 500 ug de cada mAb por ratinho 1 dia antes e dois dias após a inoculação do tumor seguido de injecção de 200 ug a cada 5 dias, subsequentemente, durante a duração das experiências. Tumor-rolamento ratos não tratados foram como controles negativos (UNT). A sobrevivência global dos ratos foi gravado. Os dados são representativos de três experiências independentes excepto para D e E, que foi a partir de um experimento. *** P 0,001, combinada mAb vs controlo ou tratadas com mAb única em ratinhos A-C; *** P 0,001, s.c ou i.p.ID8 vs s.c.TC1 em C; * P 0,05, controle ou NK1.1 vs UNT, CD4 ou CD8 em D.

Ratos rejeitando células ID8 tratamento após combinados eram resistentes a um i.p. rechallenge subsequente ou s.c. com a mesma linha de células, mas não s.c. com células de câncer de pulmão TC1 independentes (Figura 1D). Estes resultados indicam que o tratamento combinado induz uma resposta imune anti-tumor específica e de longa duração em ratinhos tratados. Linfócitos subconjunto experiências de depleção mostraram que a protecção de tumor por anti-PD-1 /OX40 mAbs foi dependente da CD4

+ e CD8

células + T como a remoção de células CD4

+ ou CD8

+ células T mas não células NK revogada completamente o efeito anti-tumoral conferida por anti-PD-1 /OX40 tratamento de mAb (Figura 1E).

combinada anti-DP-1 tratamento /OX40 mAb aumenta significativamente os rácios de CD4 e CD8 células para Treg e MDSC

Para explorar os mecanismos subjacentes a sinergia entre a PD-1 bloqueio e activação OX40, foram analisados ​​os efeitos do mAb simples ou combinados nas células infiltrantes de tumor peritoneal imunes (PIC) colhidas de ratinhos tratados 3 ou 7 dias após a última injecção de Acm. Comparado com o controle ou única mAb, combinado MAB aumentou significativamente as percentagens de efetoras CD4

+ FoxP3

– (valor para o controle de dizer, anti-PD-1, anti-OX40 e anti-PD-1 /OX40 grupo: 8,24%, 8,20%, 8,70%, 18,78% no dia 3 e 7,66%, 8,02%, 12,22%, 22,80% no dia 7; p 0,05) e CD8 + (valor médio 6,62%, 6,74%, 7,20%, 23,24% no dia 3 e 5,88, 7,22, 12,90, 29,26 no dia 7; p 0,01) células T e diminuiu a frequência de CD11b

+

+ células supressoras derivadas mielóides GR-1 (MDSC; valor médio de 12,58% , 10,86%, 13,62%, 6,53% no dia 3 e 14,58%, 10,28%, 14,20%, 3,28% no dia 7; p 0,05 e 0,01 para os dias 3 e 7, respectivamente) em PIC no dia 3 após o tratamento e as alterações tornou mais proeminente no dia 7 após o tratamento (Figura 2A-D); No entanto, não houve alteração na percentagem de células CD4

+ FoxP3

+ células T reguladoras (Treg) foi observada em ratos tratados mAb combinados em dois pontos de tempo avaliados. Estas mudanças de contraste em células efectoras e imunossupressores deu origem às proporções significativamente elevados de ambos efectoras CD4

+ e CD8

+ células T para Treg e MDSC na cavidade peritoneal de ratinhos que receberam tratamento com mAb combinada (Figura 2E-H) . No que diz respeito ao tratamento de mAb indivíduo, acoplamento OX40 elevou significativamente a percentagem de células CD4

+ FoxP3

+ Treg (1,01%, 0,93%, 1,33%, 1,03% no dia 3 e 1,07%, 0,84%, 1,84%, 0,97% no dia 7; p 0,05 no dia 7), com aumento modesto no percentual de efetoras CD4

+ FoxP3

– e CD8 + T células no dia 7 após o tratamento; no entanto, única PD-1 bloqueio ligeiramente atenuado os níveis de imunossupressores Treg e MDSC na cavidade peritoneal. Notamos um aumento no número absoluto de células imunes no total de 2 ratos tratados mAb em dois momentos analisados ​​(valor médio (× 10

6 /mouse): 3.5, 3.7, 3.8, 5.6 no dia 3 e 3,7, 3,8, 4.0, 6.2 no dia 7; p . 0,05) e as alterações no número absoluto de cada subgrupo teve uma tendência semelhante para as suas percentagens (dados não mostrados)

os ratinhos (5 ratinhos por grupo) injectado IP com 1 × 10

6 células ID8 10 dia antes foram injectados três vezes em 4 dias de intervalo com 200 ug de controlo, simples ou combinada anti-DP-1 /OX40 mAb. Três ou sete dias mais tarde, lavagens peritoneais de ratinhos tratados foram analisados ​​por citometria de fluxo para a composição de vários subconjuntos imunes. As percentagens de CD4

+ FoxP3

–

+ células T células T, CD8, CD4

+ FoxP3

+ Treg e CD11b

+ GR-1

+ MDSC em

+ células imunitárias peritoneais CD45 são mostradas em a, B, C e D, respectivamente, com cada ponto de dados representam a partir de cada ratinho. As proporções de células CD4 tanto

+ e CD8

+ células T para Treg e MDSC são mostrados em E, F, G e H, respectivamente, com cada ponto que representa dados a partir de cada ratinho. Os dados são representativos de 2 experimentos independentes, * P 0,05, ** P 0,01

Uma análise mais aprofundada fenótipo demonstrou que aumentou significativamente a percentagem de CD44

+ CD62L

– efetoras /memória. (valor de controlo, anti-DP-1 significa, anti-OX40 e anti-DP-1 /OX40 grupo: 9,4%, 10,3%, 14,0%, 33,4%, e 18,6%, 21,6%, 26,2%, 53,0% para as células T CD4 e CD8; p 0,01 para ambas as células) e CD44

+ CD62L

+ memória central (35%, 40,9%, 42,8%, 54,2% e 37,7%, 36,7%, 34,6%, 36,9 % de células T CD4 e CD8; p 0,05 para células CD4) células foi observada em células T CD4 + e CD8 + T peritoneais a partir de anti-DP-1 /OX40 mAb ratinhos tratados em comparação com a de controlo ou única mAb ratinhos tratados (Figura 3A, B ), cuja PIC continham níveis mais elevados de CD4 naïve

+ e CD8

+ células T (48,2%, 44,1%, 37,2%, 9,73% e 32,7%, 33,6%, 27,1%, 6,3% para CD4 e As células CD8; p 0,01 para ambos) com células CD44

-CD62L

+ fenótipo (Figura 3C). Os dotplots representativos são apresentados na Figura 3D.

Os ratinhos (5 ratinhos por grupo) injectados i.p. com 1 × 10

6 células ID8 10 dia antes foram injectados três vezes em 4 dias de intervalo com 200 ug de controlo, simples ou combinada anti-DP-1 /OX40 mAb. Sete dias mais tarde, a expressão de CD44 e CD62L em células CD4 peritoneal

+ e CD8

+ células T de ratinhos tratados foi analisada por citometria de fluxo. As frequências de CD44

+ CD62L

– efetoras /memória, CD44

+ CD62L

+ de memória central e CD44

-CD62L

+ células naive em células CD4 peritoneal

+ e células CD8

+ T são mostradas em a, B e C, respectivamente. Os dotplots representativos são mostrados em D com painéis superior, médio e inferior são visualizadas isotipo, CD44 e CD62L coloração em células CD4 fechado

+ e CD8

+ células T, respectivamente. Os dados são representativos de 2 expericias independentes, * P 0,05, ** P . 0,01

Em resumo, estes resultados indicam que concomitante de DP-1 e bloqueio OX40 accionamento cria rácios mais elevados de células T efectoras para células imunossupressoras na cavidade peritoneal de ratinhos tratados, o que representa a mudança do meio de tumor supressora normalmente a um estado mais estimuladora que é mais permissivo para imune mediada destruição do tumor.

combinada anti-DP-1 /mAb OX40 tratamento promoveu um microambiente imunoestimulante locais

para substanciar ainda mais o deslocamento do microambiente do tumor, nós próxima examinaram a expressão de genes imuno-associados no PIC fresco isolado no dias 3 a 7 após o tratamento mAb. Utilizando RT-PCR quantitativa, os factores associados com a activação imunitária (T-bet e IFN-γ) e as associadas com a actividade imunossupressora /reguladora (Foxp3 e IL-10) foram avaliados pelos seus níveis relativos de expressão. No dia 3 após o tratamento, num momento em que foram observadas frequências aumentadas de células T efectoras, os níveis de transcrição de T-bet e IFN-γ genes foram drasticamente aumentada no grupo de tratamento combinado (Figura 4A, B). Em contraste, a expressão do gene de citoquina imunossupressora IL-10 foi acentuadamente diminuída enquanto gene FoxP3 permaneceu inalterado (Figura 4C, D), o que foi consistente com a mudança de Treg e MDSC no PIC. A alteração na expressão de T-bet, o IFN-γ e IL-10 genes foram mais pronunciados no dia 7 após o tratamento. Com base nas relações dos transcritos do gene estimuladores-a-regulação (razão de ambos os T-bet /FoxP3 e IFN-γ /IL-10), concluiu-se que o tratamento combinado promoveu um microambiente tumoral de activação de imuno local (Figura 4E, F ). Um único OX40 Desencadeamento moderadamente aumentou a expressão de todos os quatro genes, no entanto, sem elevação de ambos os T-bet /FoxP3 e IFN-y /IL-10 foi rácios observados.

Os ratinhos (5 ratinhos por grupo) injectados i.p. com 1 × 10

6 células ID8 10 dia antes foram injectados três vezes em 4 dias de intervalo com 200 ug de controlo, simples ou combinada anti-DP-1 /OX40 mAb. Três ou sete dias mais tarde, a expressão de T-bet Th1 e genes associados IFN-γ e imunorreguladora FoxP3 e IL-10 genes em PIC de ratinhos tratados foi analisado por RT-PCR quantitativo. A expressão de T-bet, o IFN-γ, FoxP3 e IL-10 genes são mostradas em A, B, C e D, respectivamente. As proporções de ambos os T-bet /FoxP3 e IFN-γ /IL-10 são mostrados em E e F, respectivamente. PIC isolada de fresco de ratinhos tratados foram estimuladas com 50 ng /ml de PMA e 1 ug /ml de ionomicina durante 6 horas (tal como descrito em Materiais e Métodos) e os sobrenadantes foram analisados ​​para os níveis de IL-10 (L) e IFN-γ (H ). Os dados foram expressos como m ± EPM de 5 ratos e representativa de 2 expericias independentes, * P 0,05, ** P 0,01, *** P . 0,001

Para assegurar que as alterações no IFN -γ e IL-10 de expressão de ARN relacionadas com alterações ao nível da proteína, PIC foram isolados nos dias 3 a 7 após o tratamento e estimuladas in vitro, antes da análise de IFN-γ e IL-10 por ELISA níveis de secreção. Notavelmente, PIC isolada 3 e 7 dias após o início da terapia com mAb combinados produziu níveis significativamente mais elevados de proteína de IFN-γ e níveis mais baixos de IL-10 de citocina em relação ao que foi colhida a partir de controlo ou ratinhos único tratado mAb nesses mesmos pontos de tempo (Figura 4G , H).

combinada anti-DP-1 /OX40 tratamento mAb induziu uma resposta de CTL especifica para o antigénio

Como células ID8 expressar o mesotelina, um antigénio tumoral bem caracterizada [38], eu colhi esplenócitos de murganhos tratados, e o mesmo número de esplenócitos foi cultivada na presença de 10 ug /mL de H-2Db-ptido restrito (aminoácidos 406-414) específicas do mesotelina ou controlar o HPV-E7 péptido (aminoácidos 49 -57) durante 3 dias e analisados ​​a produção de IFN-γ em sobrenadantes de cultura por ELISA. Em comparação com a do controlo ou ratinhos individuais tratados com mAb, os esplenócitos de ratinhos tratados com o mAb combinados produzidos níveis significativamente mais elevados de IFN-γ quando estimulados com o péptido mesotelina (P 0,01; Figura 5A). Não há aumento na secreção de IFN-γ foram observadas em esplenócitos de todos os grupos de ratinhos em que foram estimuladas com o péptido de controlo HPV, demonstrando a indução de resposta imunitária específica para o mesotelina em ratinhos que receberam tratamento combinado mAb. Nós ainda avaliada a atividade citolítica de células de baço de controlo ou ratos tratados mAb combinados. Os esplenócitos foram estimuladas de novo com células ID8 UV-irradiada durante 4 dias antes dos ensaios de CTL foram realizados utilizando células EL4 pulsadas com mesotelina ou HPV-E7 péptido derivado como células alvo. Como se mostra na Figura 5B e 5C, os esplenócitos de anti-DP-1 /OX40 ratinhos tratados apresentaram níveis significativamente mais elevados de actividade citotóxica contra células EL4 pulsadas com mesotelina, mas não com o péptido HPV-E7.