Abstract

Fundo

KIAA0101 é um fator associado-antígeno nuclear de proliferação celular que é abundante em algumas malignidades humanas. adrenocortical neoplasma é um dos tumores humanos mais comuns para os quais as causas moleculares são mal compreendidos. Além disso, é difícil distinguir entre tumores adrenocorticais benignas e malignas localizadas. Por estas razões, estudamos a expressão, função e possível mecanismo de desregulação da KIAA0101 na neoplasia adrenocortical humano.

Metodologia principais conclusões

/níveis de mRNA KIAA0101 e expressão de proteínas foram determinadas em 112 tecido adrenocortical as amostras (21 córtex normal, supra-renal, 80 tumores adrenocorticais benignas, e 11 de carcinoma adrenocortical (ACC). knockdown SiRNA foi usada para determinar o papel funcional de KIAA0101 na proliferação celular, o ciclo celular, a apoptose, o crescimento independente da ancoragem em ágar mole e a invasão no ACC . linha celular, NCI-H295R Além disso, exploramos o mecanismo de KIAA0101 desregulação examinando o estado mutacional ARNm KIAA0101 (9,7 vezes) e a expressão da proteína foram significativamente maiores no ACC (p 0,0001).. KIAA0101 tinha a expressão da proteína escasso em apenas algumas amostras de córtex adrenal normal, que foi confinada a células progenitoras adrenocorticais. níveis de expressão KIAA0101 foram de 84% precisos para distinguir entre ACC e amostras de tumor adrenocortical normais e benignos. Knockdown da expressão do gene KIAA0101 diminuiu significativamente o crescimento independente de ancoragem em 80% e a invasão por 60% (p = 0,001; p = 0,006). Não foram encontradas mutações no KIAA0101 no ACC.

Conclusões /Significado

KIAA0101 é abundante no ACC. Nossos dados suporta que KIAA0101 é um marcador de proliferação celular, promove o crescimento e invasão, e é um bom marcador diagnóstico para distinguir benigna da neoplasia maligna adrenocortical

Citation:. Jain M, Zhang L, Patterson EE, Kebebew E (2011) KIAA0101 é abundante, e promove o crescimento e invasão em Câncer adrenal. PLoS ONE 6 (11): e26866. doi: 10.1371 /journal.pone.0026866

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 10 de junho de 2011; Aceito: 05 de outubro de 2011; Publicado: 11 de novembro, 2011 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

neoplasias supra-renais são uma das neoplasias humanas mais comuns, muitas vezes detectada incidentalmente [1]. A maioria das neoplasias supra-renais são benignos, mas muitas vezes é difícil excluir um tumor maligno, tais como carcinoma adrenocortical. carcinoma adrenocortical (ACC) é uma malignidade rara do córtex adrenal, com um mecanismo mal compreendida de desenvolvimento, e um resultado sombrio paciente devido à falta de uma terapia eficaz [2]. A incidência anual de ACC é de aproximadamente 1-2 milhões de casos por [3], [4], [5]. A ressecção cirúrgica completa é o único tratamento curativo possível, mas mais de dois terços dos pacientes apresentam doença metastática e mesmo aqueles pacientes que têm a ressecção completa desenvolver doença recorrente em mais de 50% dos casos [2], [6]. Os doentes com doença metastática têm uma taxa de sobrevivência de cinco anos de menos do que 10% e aqueles com doença recorrente ter uma sobrevivência de cinco anos de apenas 50% [2], [6].

ACC pode ser associada com síndromes hereditárias de cancro, como a síndrome de Beckwith-Wiedemann (associados com a linha germinal 11p15 alterações cromossômicas que levam a

superexpressão IGF2, OMIM # 130650), síndrome de Li-Fraumeni (

TP53

mutação, OMIM # 151623) , neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (as mutações no gene supressor de tumor Menin, OMIM # 131100), e síndroma de Gardner (

APC

mutação, OMIM # 175100). As alterações genéticas associadas a síndromes de cancro hereditário ter fornecido informações importantes sobre os mecanismos moleculares possíveis envolvidos no ACC. No entanto, a maioria dos casos de ACC são esporádicos, e os eventos moleculares que levam à iniciação e progressão de tumores adrenocorticais permanecem obscuros.

ampla Genome-expressão do gene profiling fornece informação importante sobre as vias moleculares que estão desregulados no cancro e podem estar envolvidas na iniciação e progressão do tumor. Uma vez que o mecanismo molecular da carcinogénese adrenocortical é mal compreendida, de cDNA microarray de tumores adrenocorticais foi usado para revelar genes cuja misexpression está associada com ACC [7], [8], [9], [10], [11]. Entre os genes que foram encontrados para ser regulada no ACC, KIAA0101 (também conhecida como L5; PAF; OEATC1; NS5ATP9; OEATC-1; p15) é um romance marcador diagnóstico e prognóstico potencial e alvo para a terapia ACC. KIAA0101 codifica um fator -associated antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) com uma função desconhecida. KIAA0101 é sobre-expressa em tumores humanos, tais como hepatocelular e carcinoma pancreático [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21 ], [22]. No entanto, o papel de KIAA0101 no cancro e o mecanismo que conduz a expressão desregulada de KIAA0101 não é clara.

Neste estudo, abordamos estas questões e mostrou que KIAA0101 é sobre-expresso em ACC e um marcador de proliferação celular. Além disso, a redução de expressão KIAA0101 em ACC resultou na supressão do crescimento e invasão sugerindo que KIAA0101 desempenha um papel oncogênico no ACC.

Métodos

Os espécimes de tecido

O conselho de revisão National Cancer Institute aprovou este protocolo de pesquisa, após consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. tecidos adrenais foram congeladas rapidamente no momento da cirurgia e armazenado a -80 ° C. Neste estudo, 112 amostras de tecido do córtex adrenal humanos foram analisados ​​incluindo 21 tecidos normais adrenocorticais, 80 tumores adrenocorticais benignos e 11 carcinomas adrenocorticais primários (78 dos tumores adrenocorticais benignos e 11 dos carcinomas adrenocorticais primários foram analisados ​​anteriormente) [11]. Um conjunto independente de metástases ACC (n = 29) e as recidivas (n = 2) foi também utilizado para validação. O diagnóstico de ACC inequívoca e tumor adrenocortical benigna foi confirmado em todos os casos por exame histológico e acompanhamento clínico. O tempo médio de acompanhamento foi de 26,3 meses para os pacientes com tumores adrenocorticais benignas e 44,4 meses para pacientes com ACC.

cultura celular

A linha celular NCI-H295R ACC (ATCC, Rockville, MD ) foi cultivado e mantidas em DMEM suplementado com 1% de ITS + Premix (BD Biosciences, San Jose, CA), 2,5% Nu-soro I (BD Biosciences), e 10.000 U /mL de penicilina /estreptomicina, numa incubadora humidificada padrão, a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera. Vinte e quatro horas depois as células foram semeadas em placas de 24 e placas de 6 poços (4 × 10

^ 4 células em 0,5 ml e 1,6 x 10

^ 5 células em 2 ml), as células foram transfectadas com um controlo negativo não específica siRNA e com um siRNA específico KIAA0101 a uma concentração final de 40 e 80 nM (AM4636 e AM46235, respectivamente, Applied Biosystems, Foster City, CA). O reagente de TransIT siQuest (Mirus Bio, LLC) foi utilizado para entregar siRNA para as células de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência knockdown foi similar para 40 e 80 nM. Todos os ensaios in vitro foram feitas tanto com 40 e 80 nM de concentração de siRNAs específicos KIAA0101 e controlo negativo não específica.

RNA e preparação proteína

O ARN foi isolado utilizando o reagente TRIzol seguindo as instruções do fabricante ( Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). quantidade e qualidade do ARN foi avaliada usando NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Thermo Fischer) e Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), respectivamente.

tampão RIPA foi utilizado para preparar lisados ​​de tecido e lisado celular total foi preparado com 1% de SDS, mais 10 mM de Tris [pH 7,5] tampão. A concentração de proteína foi determinada utilizando o ensaio de proteína da BioRad DC RC (Hercules, CA).

quantitativa em tempo real de reacção de transcrição reversa em cadeia da polimerase (RT-PCR)

O ARN total (125 ng) foi transcrito de forma inversa utilizando o kit de síntese de ADNc RT roteiro (Corporação USB, Cleveland, OH). PCR em tempo real quantitativo foi usado para medir níveis de expressão de ARNm relativos a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) a expressão do mRNA. nível de expressão genética normalizada = 2

– (Ct

de gene de interesse – Ct

de GAPDH) × 100%, onde C

t é o limiar de ciclo de PCR. Os iniciadores de PCR e sondas para KIAA0101 (Hs00207134_m1) e GAPDH (Hs99999905_m1) foram obtidos de Applied Biosystems (Ensaio kit®-on-Demand, Foster City, CA). Todas as reacções de PCR foram realizadas num volume final de 20 ul com 1 ul de matriz de cDNA em um PRISM®7900 Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems). A condição termociclador de PCR foi de 95 ° C durante 12 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 1 minuto. Todas as experiências foram realizadas em triplicado e repetidas três vezes.

análise Western blot

As amostras de proteína (40 ug) foram separados em 4% de gel de SDS-PAGE 20% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Western blotting foi realizado de acordo com procedimentos padrão utilizando anticorpos monoclonais de ratinho primário, anti-KIAA0101 (Abcam; ab56773) em 1:100 diluição e anti-β-actina (SC-81178, Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA) a 1: 2000 de diluição. detecção de sinal foi realizado utilizando o anticorpo secundário conjugado com HRP e um kit de quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia Biotech).

imuno-histoquímica (IHQ) e Immuunofluoroscence coloração

Os tecidos tumorais foram fixados em formalina, embebidos em parafina, e 5 microns de espessura foram cortadas para a imunocoloração. As secções foram incubadas com o anticorpo monoclonal de ratinho anti-KIAA0101 primária em 1:300 diluição durante a noite a 4 ° C (Abcam; ab56773) seguido de anticorpo secundário biotinilado durante 1 h à temperatura ambiente (1:150; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). As secções foram desenvolvidas utilizando 3,3′-diaminobenzidina como o cromogénio DAB (ABC Elite Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) e hematoxilina como contrastante. As secções foram re-hidratadas e montada com a montagem vectamount médio (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). As lâminas foram digitalizados sob Olympus microscópio de luz (Nikon, Tokyo, Japão) e as imagens foram tiradas em 20X e 40X ampliações. Um sistema de pontuação semi-quantitativo foi usado para analisar a expressão de KIAA0101; nível de expressão foi classificada como sem coloração (0), 30% de células coradas (1), 30-50% de células (2) e 50% das células. Dois observadores, que não tinham conhecimento do tipo de tumor, marcou de forma independente cada amostra. As pontuações foram calculados para obter a pontuação expressão KIAA0101 última

coloração Immuunofluoroscence foi feito utilizando anticorpo primário monoclonal anti-KIAA0101mouse em 1:300 noite diluição. (Abcam; ab 56773) e de coelho anti-SF-1 (Millipore ; 07-618, 2 ug /ml) a 4 ° C. Os anticorpos primários foram detectados com conjugados com fluoróforo RedTX anti-IgG de coelho (Invitrogen, Carlsbad, CA) e anticorpos secundários FITC IgG anti-rato (Vector Laboratories). As lâminas foram então lavadas e montadas com DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindol) de montagem solução. As imagens foram analisadas com um microscópio Zeiss Axioskop-2 em 20X e 40X ampliações.

Purificação de DNA

O DNA genômico foi isolado a partir de 1 mg de amostras tumorais e normais utilizando o kit DNA QIAamp Sangue Mini ( Qiagen, Hilden, Alemanha), eluída num volume total de 200 ul e armazenado a -20 ° C. concentrações de DNA foram medidas por absorção de UV usando NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Thermo Fischer).

região codificadora Sequencing KIAA0101

O exons KIAA0101 1, 2, 3 e 4 foram sequenciados. iniciadores de PCR foram concebidos para a codificação de região usando UCSC navegador genoma, Primer 3 software integrado. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela 1. Os iniciadores foram feitos por IDT, Inc. (Coralville, IA). Exons 1, 2, 3 e 4 foram amplificados como três reacções separadas em 50 ul usando PCR Master Mix (Fermentas Inc. EUA). As condições de PCR convencionais foram desnaturação inicial a 95 ° C durante 5 min seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 5 min, emparelhamento a 50 ° C durante 1 min, extensão a 72 ° C durante 1 min e extensão final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose a 2%. Os produtos foram purificados usando o padrão de nuclease Exo I e Fastap (Fermentas Inc.). Os produtos de PCR purificados foram sequenciados utilizando ABI 3730xl sequenciador com o método de corante grande (kit Sequencial de DNA, Big Dye Terminator Cycle sequenciamento; Applied Biosystems). As mutações foram analisados ​​pelo Programa Mutation Surveyor V 3.3 (Soft Genética; www.softgenetics.com). Todos os dados de sequenciação foi depositada no GenBank.

proliferação celular

As células foram semeadas numa placa de 96 poços a uma concentração de 5 × 10

^ 3 células por 100 uL de meio de cultura em seis repetições. Em cada ponto temporal, o meio foi aspirado do poço e as células foram imediatamente congeladas a -80 ° C durante 24 horas. As placas foram descongeladas à temperatura ambiente, e preparado para a quantificação do número de células utilizando o kit de ensaio de CyQUANT ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). O ensaio de CyQUANT foi realizada de acordo com as instruções do fabricante, e analisadas num leitor de microplacas f luorimétrico (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 480 nm /520 nm.

A citometria de fluxo e análise da apoptose

KIAA0101 e siRNA controlo negativo células tratadas foram colhidas, durante a noite a 4 ° C, e ressuspendeu-se em PBS 1x a uma concentração de 1 × 10

^ 6 células /mL fixa-etanol. As células foram tratadas com RNase isento de DNase (100 ug /ml) durante 20 min a 37 ° C. As células foram coradas com iodeto de propídio a uma concentração de 50 ug /ml e as amostras foram armazenadas a 4 ° C. A análise de citometria de fluxo foi realizada num Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Os arquivos de dados foram gerados para 20.000 eventos (células) usando o software CellQuest. A fracção da população total de células presentes em cada um de G1, S e G2 /M fases do ciclo celular foi obtida a partir do software ModFit LT (Verity Software House, Inc.). análise de apoptose foi realizada utilizando a coloração de anexina V (Kit ApoAlert® anexina V apoptose) de acordo com as instruções do fabricante (Clontech, Mountain View, CA).

macio agar ancoragem crescimento independente ensaio

Two- Os ensaios de agar mole camadas foram realizados em placas de seis poços. A camada de fundo de agar (2 ml /poço) continham 0,5% de agar (Difco Noble Agar, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) em meio de manutenção. Cinco dias após o siARN transfecção, as células foram tratadas com tripsina, contadas, e 50.000 células foram misturados com 1,3 ml de solução de ágar de topo suplementado com 10% de soro Nu-(0,3% de agar em meio de cultura). ágar solidificado foi coberto com 1 ml de meio de cultura contendo 10% de soro Nu-. As placas foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2, e o meio foi mudado duas vezes por semana. Após 16 dias de cultura, as colónias de células foram coradas com solução de violeta cristal 0,2% e examinadas por microscopia. As colónias foram contadas em 5 campos diferentes por bem e confirmado pelo software v11 TotalLab Quant (https://www.totallab.com/).

invasão celular ensaio

A extensão da invasão celular foi avaliada utilizando o BD BioCoat Matrigel ™ ™ Invasão Secção (BD Biosciences, Bedford, MA), de acordo com o protocolo do fabricante. Um total de 1 × 10

^ 5 células foram semeadas sobre as inserções (8-poro membrana de policarbonato de tamanho) revestidas com uma fina camada de membrana basal da matriz Matrigel (BD Biosciences). As pastilhas foram colocadas numa placa de 24 cavidades com meio de cultura contendo soro a 10% ou meio sem soro. As placas foram incubadas durante 48 horas a 37 ° C. As células que invadiram a matriz Matrigel à superfície inferior da membrana foram fixadas e coradas com Diff Quik Mancha (Dade Behring, Newark, DE, EUA) e contadas sob um microscópio de luz. Quatro campos em quatro quadrantes separados de cada membrana foram contadas e média.

Análises Estatísticas

A contínua de dados foi representado como média e desvio padrão ± (DP). ANOVA bicaudal multi-comparador

t

-test foi utilizado para avaliar a diferença entre a expressão significativo entre as amostras normais, benignas e malignas. teste de correlação de Pearson foram utilizados para dados contínuos. A

p

-valor 0,05 foi considerado como significativo. A análise foi feita por Stat View 5.0 (Cary, NC) e SPSS v 16.0 (Chicago, IL) softwares estatísticos.

Resultados

mRNA e proteína KIAA0101 são altamente expressos em neoplasias adrenocortical

a expressão de ARNm de KIAA0101 foi significativamente maior em ACC como comparação com o tecido supra-renal normal e tumores adrenocorticais benignas (12-vezes maior do que o normal e nove vezes maior do que nos tumores benignos, p 0,0001) (Figura 1A). Além disso, o nível de expressão de ARNm de KIAA0101 foi menor nos tumores metastáticos e recorrentes, em comparação com ACC primário (P 0,001)

a) Expressão de ARNm KIAA0101 no córtex supra-renal normal (n = 21), tumores adrenocorticais benignas (N = 80), o ACC (N = 10), e metastático ACC recorrente (n = 30) e a linha celular NCI-H295R. nível de expressão de ARNm de KIAA0101 foi determinada por RT-PCR quantitativa e normalizado para a expressão de ARNm de GAPDH. As colunas representam ± desvio padrão de determinações replicadas. diferença estatisticamente significativa é indicado por um asterisco (*) (p 0,05, teste de Kruskal Wallis). ACC primária vs. normal (p 0,0001), ACC contra tumores adrenocorticais benignos primários (p 0,0001) e ACC primária vs. metástases (p 0,0001). B) A análise da curva ROC para a expressão de ARNm de KIAA0101. A curva característica de operação do receptor (ROC) está representado no gráfico de dados utilizando RT PCR expressão de KIAA0101 normalizadas para GAPDH no córtex supra-renal normal (n = 21), tumores benignos adrenocorticais (n = 80), o ACC (n = 10). A área sob a curva (AUC) foi de 0,78. Um marcador de diagnóstico perfeito, sem nenhum falso-negativos ou falsos positivos teria uma AUC de 1. C) a expressão da proteína KIAA0101 no ACC. Os níveis de expressão de proteína KIAA0101 no córtex supra-renal normal (N = 5), (n = 13), e tumores malignos adrenocorticais benignas (n = 3), como mostrado na transferência de Western representativa com anticorpos específicos de controlo e de p-actina KIAA0101. sinal de p-actina foi utilizado como um controlo para a carga de proteína. C = ACC, B = tumor adrenocortical benigna, e N = córtex adrenal normal. D) Gráfico de dispersão de ARNm de KIAA0101 e o nível de expressão de proteínas em amostras de tecidos normais adrenocorticais, benignas e malignas. Eixo Y mostra a expressão de ARNm normalizada por RT-PCR quantitativo e o eixo X mostra o nível de expressão da proteína na mesma amostra com base na medição densitometria banda normalizada para p nível de expressão de actina. Spearmen coeficiente de correlação (r) = 0,61, p 0,001. E) Imuno-histoquímica para a expressão da proteína KIAA0101 no tecido adrenocortical normal, tumores benignos e ACC. Imagens representativas são mostrados para cada categoria com ampliação de 20x. A seta indica a coloração nuclear positiva para KIAA0101. Em amostras de tecidos normais, somente a região subcupsular foi positiva. F) KIAA0101 localização celular foi analisada por immunoflouroscence. Os núcleos foram manchadas por DAPI (azul), cor vermelha indica expressão KIAA0101. Imagens representativas de ACC maligno e amostras normais são mostrados com ampliação de 20x.

Dada a diferença significativa expressão no mRNA entre tumores benignos e malignos, estávamos interessados ​​em avaliar se KIAA0101 foi um preditor de diagnóstico preciso do tumor digitar. expressão KIAA0101 foi de 84% precisos para distinguir entre ACC e amostras de tumor adrenocortical normais e benignos (número de verdadeiros resultados positivos e negativos, dividido pelo número total da amostra usando um nível de corte de 1,5). A área sob a curva característica de operador receptor (ROC) (AUC) foi de 0,78 para a expressão de ARNm de KIAA0101 (Figura 1B), 0,79 para o tamanho do tumor, e 0,85 para a combinação de expressão KIAA0101 e o tamanho do tumor.

Além expressão elevada de ARNm, a expressão da proteína KIAA0101 também foi elevado em ACC como comparado com córtex adrenal normal e amostras de tumores benignos adrenocorticais. Na transferência de Western, verificou-se mais elevada expressão em ACC (n = 3) do que os tumores benignos adrenocorticais (n = 13), e em amostras de córtex supra-renal normais (n = 5) (Figura 1C). Havia uma boa correlação entre o ARNm de KIAA0101 e os níveis de expressão de proteína (Figura 1D, r = 0,61, p 0,001). Para avaliar ainda mais a expressão KIAA0101, foi realizada a análise semi-quantitativa de uma matriz de tecido contendo pequenas secções de tumores benignos e malignos por imuno-histoquímica para a proteína KIAA0101. Esta análise não encontrou nenhuma diferença significativa na expressão da proteína KIAA0101 entre tumores benignos e malignos (p = 0,31). Isto não é surpreendente como imuno-histoquímica é um método semi-quantitativo e não pode detectar diferenças menores na expressão da proteína. No entanto, quando a expressão da proteína KIAA0101 foi avaliada em amostras individuais benignas e malignas na matriz, a sobre-expressão significativa foi observada em comparação com as amostras normais (Figura 1E). KIAA0101 proteína estava presente no citoplasma e núcleo, que também foi confirmada por imunofluorescência (Figura 1F).

observada apenas coloração KIAA0101 escasso em algumas amostras de córtex supra-renal normal, que se confinados à região do córtex subcapsular ( A Figura 2A). Para determinar se esta área focal positivo para KIAA0101 representada células progenitoras supra-renais, que co-coradas as mesmas amostras normais córtex adrenal com o factor esteroidogênica um anticorpo (SF-1), um marcador de células progenitoras renais [23]. Curiosamente, as amostras de córtex supra-renais normais mostraram co-coloração de KIAA0101 e SF-1, em conjunto ou em subcapsular progenitoras região do córtex supra-renal (Figura 2B) a.

A) coloração imuno-histoquímica de córtex supra-renal normal para SF-1 e KIAA0101. No primeiro painel, as zonas do córtex supra-renal são indicados a 10X, 1: zona glomerulosa contendo células progenitoras, 2: zona fasciculada, 3: zona reticular. painel de segundo e terceiro indicar o SF-1 (20X com 40X inserção) e imunocoloração positiva KIAA0101 na Zona glomerular com ampliação de 20x. As setas vermelhas indicam as áreas positivas para SF-1 e KIAA0101 coloração. B) Immunofluoroscence para SF-1 e KIAA0101 no córtex adrenal normal. Os núcleos foram manchadas por DAPI (azul), cor vermelha indica expressão KIAA0101 e cor verde indica SF-1 expressão. Imagens Incorporadas (cor amarela) em 40X show de co-localização das duas proteínas, SF-1 e KIAA0101 em células progenitoras de córtex adrenal normalmente.

Mecanismo de KIAA0101 superexpressão em ACC

Para determinar se a sobre-expressão KIAA0101 foi uma consequência de variações da sequência do gene, foi realizada a análise de mutações na KIAA0101. Encontramos um de

novo

G Uma mutação de transição na posição 186 que cai na região de KIAA0101 não-codificante em uma amostra benigna. Observou-se também um polimorfismo na UTR 5 ‘do exão 1-2 (88T C). Cerca de 6,6% dos benigna eram heterozigotos e 12,5% no normal, mas nenhum em amostras malignas (Tabela 2). Tendo em conta estes resultados, é improvável que a sobre-expressão KIAA0101 é resultado de uma mutação.

O efeito funcional do knockdown do gene KIAA0101 em uma linha de células ACC

Dada a superexpressão significativa de KIAA0101 em ACC (Figura 1) e a observação de que a expressão KIAA0101 se restringe a proliferação de células supra-renais progentitor (Figura 2B), a hipótese de que KIAA0101 desempenha um papel no crescimento celular adrenocortical. Para resolver isso, usamos siRNA para knockdown expressão KIAA0101 na linha de células ACC, NCI-H295R. transfecção transiente de KIAA0101 siRNA específico resultou em um knockdown 10 vezes dentro de 24 horas, e este efeito foi mantido durante até 6 dias no ARNm e 80% de redução nos níveis de proteína, em comparação com um não segmentação de siRNA (controlo negativo siARN) ( A Figura 3). KIAA0101 knockdown resultou no modesto aumento na proliferação celular com um aumento no número de células de até 25% (p = 0,005) (Figura 4A). Além disso, a taxa de tempo e de crescimento de linha celular de duplicação foram diferentes para os siRNA knockdown, em comparação com o controlo negativo (média tempo de duplicação de 4,7 e a taxa de crescimento de 0,14 em comparação com o tempo de duplicação médio de 3,5 e a taxa de crescimento de 0,19 a partir do dia 1 a 5 , respectivamente). Análise do ciclo celular revelou um modesto aumento no número de células em fase G1 (p = 0,013) (Figura 4B). Considerando estes resultados contraditórios, também avaliamos a expressão do mRNA de proteínas reguladoras do ciclo celular G1 na fase G1 após KIAA0101 knockdown. KIAA0101 knockdown não alterou significativamente a expressão do mRNA do p21 e Ciclina D1, proteínas reguladoras do ciclo celular, em uma linha de células de ACC. Além disso, o gene de KIAA0101 knockdown não teve nenhum efeito significativo sobre o número de células em apoptose (dados não apresentados).

A) As células foram transfectadas com H295R KIAA0101 e siRNA controlo negativo e analisados ​​para a expressão do mRNA após 48 horas KIAA0101 de tratamento. As colunas representam a expressão de ARNm KIAA0101 percentagem em relação ao controlo negativo ± desvio padrão de quatro experiências. B) Western Blot demonstrando a expressão de proteínas representativas de KIAA0101 após 6 dias de siRNA e controlo negativo. C) Intensidade relativa de western blot usando Software Imagem J. Colunas indicam proporção de KIAA0101 e intensidade GAPDH medições. NC40 = Controlo negativo a 40 nM; SI40 = siARN a 40 nM; NC80 = Controlo negativo a 80 nM; SI80 = siRNA a 80 nM.

A) O número de células para o KIAA0101 siRNA de controlo tratado e negativos tratados grupos são mostrados nos pontos de tempo indicados (valores significativos são indicadas por um asterisco (*) (p = 0,005;. em relação ao controlo negativo) As barras de erro representam ± erro padrão da média e é representativo de quatro experiências NC80 = controlo negativo a 80 nM;. SI80 = siARN a 80 nM B) silenciamento de genes KIAA0101 e análise do ciclo celular é indicado. em diferentes pontos de tempo. Imagem representativa do perfil do ciclo celular de siRNA e os grupos de tratamento de controlo negativo. C) Cada coluna indica a distribuição da população G0 /G1 de células em cada grupo em vários pontos temporais. As barras de erro representam ± erro padrão da média e é representativo de quatro experiências * Dia 3 e 5, p. 0,05; em relação ao controle negativo.

Devido aos efeitos paradoxais, um modesto aumento na proliferação celular e detenção G1, foram utilizados ensaios funcionais adicionais para entender melhor as mudanças fenotípicas associadas a knockdown KIAA0101. Especificamente, foram avaliados tumorogenicidade e o potencial metastático. KIAA0101 knockdown em células NCI-H295R reduziu o número de colónias que foram capazes de crescer em agar mole em cerca de 80% (p = 0,001) aos 16 dias de cultura (Figuras 5A e 5B) com uma redução de 60% na invasão de células no a linha celular NCI-H295R (p = 0,006) (Figuras 5C e 5D).

a) as células cultivadas durante 15 dias na presença de concentrações indicadas de siRNA e controlo negativo. Imagens representativas são mostrados em 12X e 40X ampliações. B) A distribuição e número de colónias no grupo tratado com KIAA0101 siRNA e grupo controle negativo a 80 nM (p = 0,001; em relação ao controle negativo; NC80 = Controlo negativo a 80 nM; SI80 = siRNA a 80 nM). As barras de erro representam ± erro padrão da média e é representativo de quatro experiências. C) células invasoras foram coradas com 0,2% de violeta de cristal e visualizadas por microscopia. Imagens representativas em 20X seguintes ensaio de invasão. D) A distribuição do número de células em KIAA0101 siRNA e grupo de controlo negativo. As colunas representam a média ± desvio padrão (DP) de três experiências independentes realizadas em triplicado. * P 0,05 vs KIAA0101 siRNA controlo negativo. células H295R foram transfectadas com o controle negativo ou KIAA0101 siRNA a 80 nM para 120 h, seguido de um ensaio de invasão por 48 h.

Discussão

Neste estudo, nós examinamos a expressão KIAA0101 e função em ACC. Os nossos resultados indicam que é sobre-expresso em KIAA0101 ACC, é um bom marcador de diagnóstico para o ACC, e é um marcador de proliferação celular. Suprimindo a expressão KIAA0101 em células de carcinoma adrenocortical resultou na supressão do crescimento e invasão, o que sugere que ela desempenha um crescimento promovendo papel na ACC.

Estudos anteriores demonstraram expressão alterada de KIAA0101 em malignidades humanas e expressão ausente ou baixa em condições normais tecidos [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]. No entanto, os resultados em conflito tenham sido obtidos por expressão de KIAA0101 no carcinoma hepatocelular (HCC). Em um estudo, a expressão KIAA0101 foi encontrado para ser reprimidos no HCC [13]. Por outro lado, em um estudo separado, em uma grande coorte de pacientes com HCC, KIAA0101 foi regulada [18]. Nosso estudo também demonstrou a superexpressão KIAA0101 em ACC primário, mas, curiosamente, a expressão do mRNA KIAA0101 foi menor nos tumores de uma coorte de pacientes com metástases e recorrentes ACCs que responderam à quimioterapia sistêmica e ressecção foram submetidos. Estes resultados sugerem que a expressão de KIAA0101 pode variar como um resultado do tratamento e pode, possivelmente, ser utilizado como um biomarcador para a resposta ao tratamento em ACC e outros cancros.

Apesar de termos observado que a expressão da proteína KIAA0101 foi maior em tumores malignos e benignos , em comparação com amostras normais, fizemos detectar a expressão KIAA0101 num subconjunto de amostras normais. A sua expressão foi confinada à região subcapular do córtex adrenal e células sobrepôs-se à coloração positiva SF-1. Nesta região, SF-1 células positivas são hipoteticamente células progenitoras renais [24]. As células progenitoras possuem elevada capacidade proliferativa. co-expressão de KIAA0101 e SF-1 na região do progenitor do córtex supra-renal normal, sugere que KIAA0101 pode ser um marcador de proliferação em células do córtex adrenal. Consistente com isto, um estudo de Simpson et al., Demonstraram a localização de KIAA0101 na camada de células basais da pele e da zona proliferativa nas criptas do cólon [15].

Pouco se sabe sobre a função do gene KIAA0101 na biologia de células tumorais. Anteriormente, os estudos têm sugerido que KIAA0101 está envolvido na regulação da replicação do ADN, do ciclo celular, a apoptose e a proliferação celular [13], [14], [15], [18], [25], [26].