Abstract

O câncer endometrial, a malignidade ginecológica mais comum, é uma doença hormonal regulado. A resposta à terapia de progestina correlaciona-se positivamente com a expressão do receptor de hormona, em particular receptor de progesterona (PR). No entanto, muitos tumores avançados perder expressão PR. Nós informou recentemente que a eficácia da terapia progestina pode ser significativamente melhorada através da combinação de progestina com moduladores epigenéticos, que nós termo “terapia melhorada progestina molecularmente.” O que ficou claro foi o mecanismo de ação e se α do receptor de estrogênio (ERa), o princípio indutor do PR, é necessário para restaurar a expressão funcional do PR através de terapia de progestina molecularmente reforçada. Portanto, nós modelamos tumores endometriais avançados que perderam tanto ERa e de expressão PR através da geração de linhas celulares de cancro do endométrio ERa nulos. tecnologia CRISPR-Cas9 foi usada para apagar ERa ao nível genómico. Os nossos dados demonstram que o tratamento com um inibidor da histona-desacetilase (HDACi) foi suficiente para restabelecer a expressão PR funcional, mesmo em células desprovidas de ERa. Os nossos estudos também revelaram que o tratamento resulta na regulação negativa HDACi acentuada do oncogene myc. Nós estabelecemos que o PR é um regulador negativo da transcrição de Myc em cancro do endométrio na presença ou ausência de ERa, o que está em contraste com os estudos em células de cancro da mama. Em primeiro lugar, a estimulação de estrogênio aumentada expressão PR e diminuiu Myc em linhas celulares de cancro do endométrio. Em segundo lugar, o aumento da actividade da progesterona PR ainda embotada ARNm e a expressão da proteína Myc. Finalmente, a sobre-expressão de PR por transdução adenoviral em células de câncer endometrial ERa nulos diminuiu significativamente a expressão de genes Myc e Myc-regulamentados. Análise do banco de dados Cancer Genome Atlas (TCGA) de tumores do endométrio identificada uma correlação inversa entre PR e níveis de mRNA Myc, com uma correlação inversa correspondente entre PR e Myc alvos a jusante de transcrição SRD5A1, CDK2 e CCNB1. Juntos, estes dados revelam uma relação inversa anteriormente inesperada entre o PR supressor de tumor e o oncogene Myc no cancro endometrial

Citation:. Kavlashvili T, Jia Y, Dai D, Meng X, Thiel KW, Leslie KK, et ai. (2016) Inverse Relação entre progesterona Receptor e Myc no câncer de endométrio. PLoS ONE 11 (2): e0148912. doi: 10.1371 /journal.pone.0148912

editor: Xu Wei, da Universidade de Wisconsin – Madison, Estados Unidos

Recebido: 05 de janeiro de 2016; Aceito: 24 de janeiro de 2016; Publicação: 09 de fevereiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Kavlashvili et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela American Cancer Society Institutional Research Grant (SY), eo NIH R01CA99908 e R01CA184101 (KKL), o Departamento de Obstetrícia e Fundo de Ginecologia Pesquisa para o Desenvolvimento (KKL). Os financiadores não desempenhar um papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Donghai Dai, e Kristina W. Thiel são co-fundadores da Immortagen, LLC, que não tem qualquer função corporativa nos estudos atuais. Isto não altera a adesão dos autores para PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento. Todos os outros autores declaram que não há interesses concorrentes.

Introdução

uterina cancro do endométrio é o tumor maligno mais comum de ginecologia. Mais de 52.000 casos são diagnosticados a cada ano, e as mulheres americanas têm um risco de vida de 01:11 [1]. O endométrio é extremamente sensível aos hormônios esteróides. Estrogen actuando através do receptor de estrogénio (ER: RctE e RpE), conduz a proliferação, enquanto que a progesterona actua através do receptor de progesterona (PR: PRA e PRB) para contrariar estes efeitos através da indução de diferenciação, promovendo a apoptose e inibir a invasão [2]. Com base no papel da progesterona como um supressor tumoral no endométrio, terapia hormonal com base em progestina tem sido usado para tratar a hiperplasia do endométrio e de cancro do endométrio por mais de 60 anos [3]. No entanto, a terapia hormonal tem tipicamente sido bem sucedido apenas em tumores, onde os receptores hormonais são expressas. O nosso grupo e outros grupos têm relatado que a expressão de PR correlaciona-se positivamente com bom prognóstico e resposta ao tratamento com progesterona [3,4], ao passo que a perda de expressão PR subjacente a falha do tratamento. Isso limita o impacto da terapia hormonal na doença avançada, onde os receptores são perdidas.

Em nosso estudo recentemente publicado, que fornecem evidências convincentes de que é possível converter um câncer PR-negativo em um câncer usando epigenética PR-positivo moduladores [5]. Esta abordagem aumenta a sensibilidade à terapia progestina em tumores com baixos níveis de PR e induz a sensibilidade progesterona em tumores que nunca foram responsivo. Propomos que a eficácia da terapia progestina pode ser significativamente melhorado pela combinação com moduladores epigenéticos, que nós termo “terapia progestina reforçada molecularmente.”

Para investigar se esta terapia progestina reforçada molecularmente pode ser aplicada ao câncer endometrial avançado pacientes com tumores ERa e PR negativo; geramos linhas celulares de cancro do endométrio ERa nulos pela aplicação de tecnologia CRISPR-Cas9 romance excluir ERa no nível genômico (ESR1). Nossos dados demonstram que o tratamento com um HDACi é suficiente para restaurar a expressão PR funcional, mesmo em células desprovidas de ERa.

Nossos estudos também revelaram uma correlação inversa anteriormente inesperada entre o PR eo oncogene Myc no câncer de endométrio, sugerindo que HDACi tratamento proporciona uma vantagem adicional de Myc a regulação negativa. Nós relatamos uma análise em profundidade da correlação entre a hipótese de que a perda de myc está na base das incidências diferenciadoras da terapia de progestina.

Materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes

Estradiol ( # E2257) e progesterona (# P6149) foram obtidos a partir de Sigma Aldrich e ressuspensa em etanol. Panobinostat (LBH589) foi adquirido a partir de produtos químicos Selleck e ressuspensas em DMSO. Os anticorpos contra PRA /B (# 3153), PRB (# 3157), FOXO1 (# 2880) e Myc (# 13987) eram de sinalização celular. anticorpo HSP90 (ADI-SPA-835) era de Enzo. ERa anticorpo (sc-8002) foi de Santa Cruz. β-actina foi obtido anticorpo (# A1978) a partir de Sigma Aldrich.

Linhas Celulares e Cultura de células

ECC-1, células de cancro do endométrio foram adquiridas a partir da ATCC e cultivadas de acordo com as orientações recomendadas. Ishikawa H células de cancro do endométrio [6] (oferta do Dr. Erlio Gurpide, Universidade de Nova Iorque) foram cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS regulares, r-FBS) ou despojado com carvão de FBS (CS-FBS, life Technologies, # 12676-011) e penicilina-estreptomicina (Gibco). Antes da adição de progesterona (P4) para as células, o meio de crescimento celular com 10% de FBS foi substituído com meio de crescimento contendo soro despojado-carvão a 5% para remover os esteróides a partir de FBS.

Geração de Células ERa Knockout

deleções genómicas de ERa (ESR1) foram criadas em células ECC1 utilizando-se três pares de ARN de orientação único quiméricos (sgRNAs) como anteriormente descrito [7]. Resumidamente, os oligos sgRNA (S1 Tabela) foram sintetizados e clonado no plasmídeo de transferência lentiCRISPR para a produção de vírus. Os vectores virais foram produzidos em células HEK293T, seguido por infecção de células ECC1 como descrito [7]. ECC1-ESR1 CRISPR células nocaute (KO) foram seleccionados com 2 ug /ml de puromicina após 48 horas de transdução. células ECC1-ESR1 CRISPR KO foram cultivadas a baixa densidade de 2 semanas para seleccionar os clones. expressão ERa foi determinada por transferência Western para identificar clones sem ou com baixa expressão de proteína ERa. clones ECC1-ESR1 CRISPR KO foram mantidas em meios suplementados com 5 ug /ml de puromicina.

Expression adenoviral de PR

ECC1-ESR1 CRISPR KO clone 1-12 e 2-12 foi infectados com Os vectores adenovirais que codificam para PRA, PRB, ou PRA /B ou um controlo de vector vazio (AdControl) utilizando uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 partículas virais por célula, como descrito anteriormente [8]. Uma MOI de 10 partículas virais por célula foi empregado para se obter níveis de expressão PR aproximadamente equivalente à fase proliferativa tardia do ciclo menstrual.

PCR em Tempo Real

O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas utilizando o kit de isolamento miRvana miRNA (Ambion, Life Technologies). rendimento e a pureza do RNA foi avaliada utilizando um espectrofotómetro NanoDrop Modelo 1000 (Thermo Scientific). O ARN total (500 ng) de oligo-dT foi transcrito de forma inversa com SuperScript III (Invitrogen, Life Technologies). PCR em tempo real foi efectuada em triplicado num Applied Biosystems Modelo 7900 Genetic Analyzer sob condições padrão. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S1. Os resultados foram quantificados usando o método comparativo de ciclo limiar (ΔΔCt) [9]. Os dados foram normalizados para o rRNA 18S.

Western Blotting

Após o tratamento, as células foram solubilizadas em tampão de lise NP-40 de células frio (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris /HCl, pH 7,4, 1 % de NP-40 com um cocktail de protease e fosfatase inibidor de Pierce) e, em seguida sonicada para libertar proteínas nucleares. Os lisados ​​foram analisados ​​por transferência de Western com anticorpos primários e secundários conjugados com HRP específicos. Para a detecção da proteína PR, uma combinação dos anticorpos PRA /B e PRB em uma diluição de 1: 1.000 cada um foi usado

TCGA Análise de Dados

As informações do paciente foi descarregado a partir do Cancer Genome Atlas. Portal de dados (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) mantido pelo National Cancer Institute e Instituto National Human Genome Research. a expressão do gene foi analisada com base no RNA-Seq realizado na plataforma Illumina e foi descarregado a partir do NCI Cancer Genomics Hub (https://cghub.ucsc.edu/). A expressão calculada foi para todas as leituras alinhando a um determinado gene por amostra. Houve um total de 379 doentes com cancro do endométrio elegíveis para análise da expressão do gene. Os pacientes foram divididos em quatro grupos: endometrioid grau endometrial carcinoma 1, grau 2, grau 3 e grau 3 serosa que inclui casos designados como de alta qualidade e tipo histológico misto

Análise Estatística

t de Student. -test foi usado para comparações de dois grupos. Para análise dos dados TCGA, análise estatística e trama de dados foram realizados com R Studio, e análise de correlação foi realizada com o método de Spearman. A significância estatística foi concluído com valor de p 0,05.

Resultados

Modeling Perda de ERa em células de cancro do endométrio

Para simular câncer endometrial mais avançado que está associado com perda de ERa e PR, foi aplicado CRISPR-Cas9 a tecnologia para eliminar ERa ao nível genómico (ESR1) nas células de cancro do endométrio e ERα- ECC1 PR-positivo utilizando três sequências diferentes sgRNA [7]. Estas células são designadas como as células ECC1-ESR1 CRISPR knockout (KO). A seguir, os clones individuais seleccionados a partir de células transfectadas com cada um dos três sgRNAs. Confirmou-se que a maioria dos clones tinham eliminação completa de ERa ao nível da proteína, embora o clone 05/03 tinha um baixo nível residual de ERa, em comparação com células ECC1 parentais (Fig 1). Consistente com ERa como o princípio indutor da expressão de PR, perda de ERa resultou na perda de PR, bem como uma redução no FOXO1 gene alvo de PR (Fig 1).

Usando tecnologia de CRISPR-Cas9, ERa foi silenciada ao nível genómico em células ECC1. Ishikawa, as células ECC1 parentais e clones individuais ESR1 KO ECC1 foram tratadas com 20 nM LBH589 durante 24 h. Expressão de ERa, PR, FOXO1, e Myc foram avaliadas por transferência de Western. β-actina serve como um controle de carga.

HDAC Inibidor Restaura Expressão PR em ECC1-ESR1 CRISPR KO cancro Endometrial Células Linhas

A seguir, perguntou se a expressão ERa é necessário para HDACi- indução mediada do PR, que anteriormente relatado como um mecanismo para restaurar a sensibilidade à terapia com base em progestina [5,10]. Em todos os clones ECC1-ESR1 CRISPR KO, o tratamento com o inibidor da pan-LBH589 HDAC (panobinostat, Novartis) aumentou substancialmente a expressão da proteína PR e actividade conforme determinado pela expressão do gene alvo de PR, FOXO1 (Fig 1). Note-se que as células foram mantidas em soro que contém a progesterona. Como um controlo, foram também examinados os níveis de PR em células parentais ECC1 e células de Ishikawa, que têm expressão basal modesta PR. Consistente com os nossos estudos anteriores [5,10], LBH589 promovido expressão PR robusta nestas linhas celulares. Tomado com os dados publicados anteriormente que a combinação de LBH589 e progesterona diminui a formação de colónias por células de Ishikawa parentais [5], estes dados sugerem que, até mesmo em doentes com perda de ambas as ERa e PR, pode ser possível para atingir a sensibilidade à terapia com progestina com um modulador epigenética.

HDAC Inibidor reprime oncogene Myc expressão em células de câncer endometrial

expressão

Como um controle, que também avaliou o oncogene Myc com base em vários relatórios que ERa e PR promover a transcrição de myc no cancro da mama [11-13]. Inesperadamente, a expressão de Myc era inalterado em células não tratadas ECC1-ESR1 CRISPR KO, apesar da perda de ERa e de expressão PR. No entanto, o tratamento HDACi, além de induzir a PR conforme descrito acima, a expressão da proteína Myc completamente reprimida. Observou-se também uma diminuição no Myc e uma regulação positiva do PR nas células ECC1 parentais, assim como outra linha de células de cancro do endométrio, Ishikawa, após o tratamento com LBH589. Estes dados identificam uma relação inversa entre Myc e PR em células de câncer de endométrio.

Nós também utilizou concentrações mais elevadas de LBH589 para determinar se os níveis de Myc pode ser ainda mais reprimidas. Em ambos os pais e ECC1-

ESR1

células cancerosas endometrial CRISPR KO, os níveis de relações públicas foram progressivamente elevada em resposta a concentrações crescentes de LBH589, com uma diminuição dependente da dose correspondente na expressão de Myc (Fig 2). Estes resultados confirmam a observação da correlação inversa entre a expressão de PR e Myc na figura 1 e indicam que as concentrações mais elevadas de LBH589 pode ser necessário para restaurar os níveis de PR em tumores com perda a longo prazo da expressão do receptor da hormona.

Células foram tratados com as concentrações indicadas de LBH589 durante 24 horas e expressão de proteína analisados ​​por transferência de Western. β-actina serve como um controle de carga.

O estrogênio Estimulação Aumenta PR e diminui Myc expressão em linhas celulares de cancro endometrial

A correlação inversa entre PR e Myc expressão nas Figuras 1 e 2 desafia o paradigma bem aceite no cancro da mama que PR promove Myc expressão [12,14]. Em primeiro lugar, confirmou que a estimulação de estrogénio de células MCF-7, que contêm ERa e PR endógeno, resulta na expressão robusta do PR e Myc, com antecipada mediada pelo ligando de ERa regulação negativa (Fig S1). A adição de progesterona aumentou ainda mais os níveis de Myc, em linha com estudos anteriores [12,14]. Por outro lado, a estimulação de estrogênio das células de cancro do endométrio com expressão ERa endógena induzida expressão PR, com uma diminuição concomitante (células de Ishikawa) ou nenhum aumento adicional (ECC1 células) nos níveis de proteína Myc (Fig 3).

Ishikawa e ECC1 células foram tratadas com 10 nM de estradiol (E2) para os tempos indicados. PR, e a expressão da proteína Myc ERa foi medido por transferência de Western. Hsp90 serve como controle de carga.

PR Negativamente Regula Myc expressão e atividade no câncer de endométrio celular

Para investigar se PR medeia Myc regulação baixa em células de cancro do endométrio, nós tratados células Ishikawa, que têm uma baixa linha de base e os níveis de ERa PR (Fig 3), com LBH589 na ausência ou na presença de progesterona para 0-72 horas. As experiências foram realizadas em soro despojado com carvão para remover hormonas. O tratamento com progesterona produziu uma diminuição dependente do tempo nos níveis de proteína Myc, e a adição de HDACi acentuada este efeito (Fig 4A). Também avaliamos a atividade transcricional Myc examinando os níveis de mRNA de genes alvo Myc. Consistente com os dados de Western blot, os níveis de ARNm de Myc foram reduzidos em mais do que 90% após tratamento com LBH589, e a adição de progesterona resultou numa diminuição adicional (Fig 4B). O Myc genes alvo CDK4, CAD, SRD5A1 e HES1 foram reprimidos em resposta a LBH589 + progesterona (Fig 4B).

células de Ishikawa (A) foram tratadas com 20 nM LBH589, 100 nM de progesterona (P4) ou o combinação durante os tempos indicados. PR e a expressão da proteína Myc foi medido por transferência de Western. β-actina serve como um controlo de carga. (B) A expressão de myc e os seus genes a jusante (CDK4, CAD, SRD5A1 e HES1) foram analisados ​​por qRT-PCR em células Ishikawa foram tratadas com 20 nM LBH589 – /+ 100 nM P4 durante 4 ou 24 horas. Os dados foram normalizados para 18S e calculado como a mudança de dobra em relação ao controlo. * P 0,05 vs. controlo.

Para investigar se PR medeia Myc regulação baixa em células de cancro do endométrio ERa nulos, terapia progestina reforçada molecularmente foi aplicado em ECC1-

ESR1

células CRISPR KO. Consistente com a figura 4, foram obtidos resultados semelhantes em células cancerosas ERa-nula (Figura 5). Especificamente, o tratamento com LBH589 aumento da expressão de PR e diminuição da expressão de Myc e seus alvos de transcrição a jusante, CDK4 e CAD. Este efeito foi amplificado por adição de progesterona (Figura 5A). Esta perda de expressão Myc foi confirmada ao nível da proteína (Fig 5B).

(A) ECC1-

ESR1

CRISPR KO clone 1-12 foi tratada com 100 nM P4 durante 16 horas, 20 nM LBH589, durante 24 h, ou a combinação, seguido por análise de genes alvo de PR, Myc, e PR por qRT-PCR. Os dados foram normalizados para 18S e calculado como a mudança de dobra em relação ao controlo. Os resultados são representativos de 3 expericias independentes; * P 0,05 vs. DMSO; # P 0,05 vs. LBH589. (B) ECC1-

ESR1

clones CRISPR KO foram tratadas como em (A), seguido de análise dos níveis de PR e de proteína Myc por transferência de Western. β-actina serve como um controle de carga.

Para fornecer mais evidências para a ligação entre PR e Myc downregulation, nós overexpressed PRA e PRB na ECC1-

clone ESR1

CRISPR KO 1 -12. Em primeiro lugar, confirmou que a expressão exógena de PRA ou PRB por transdução adenoviral leva a superexpressão robusta do PR e também a indução da PR gene a jusante AREG (Fig 6). A sobre-expressão de PR resultou em Myc regulação negativa, e a adição de progesterona reduziu ainda mais os níveis de ARNm de Myc e o gene alvo Myc, HES1 (Figura 6). Estes dados suportam a hipótese de que o PR regula negativamente Myc expressão no câncer de endométrio.

ECC1-

ESR1

CRISPR KO clone 1-12 foi transduzida com adenovírus de controlo (AdControl) ou adenovírus contendo PRA, PRB , ou PRA + PROBLEMA durante 24 horas, seguido por 100 nM de P4 para uma 24 horas adicionais. Os níveis de ARNm foram quantificados por qRT-PCR, normalizada para a 18S, e os dados expressos como alteração vezes relativamente ao AdControl na ausência de P4. Os resultados são representativos de 3 expericias independentes; * P 0,05 vs. AdControl; # P 0,05 vs.-P4 no mesmo grupo.

correlação inversa entre PR e Myc em tumores de pacientes endometriais

Para investigar se existe uma correlação inversa entre PR e Myc expressão em endometrial cancerosas amostras de pacientes, foram analisados ​​dados de RNA-Seq de 379 tumores do endométrio no conjunto de dados TCGA. Observou-se uma diminuição progressiva da PGR e expressão de mRNA ESR1 de câncer de endométrio endometrióides a tumores serosos mais agressivas, como definido por nível (Fig 7A). Pelo contrário, a expressão de ARNm Myc foi significativamente aumentada nos tumores de grau elevado em relação aos graus mais baixos. O método de correlação de Spearman confirmou que as correlações de PGR com Myc e ESR1 com Myc são significativas (Figura 7B e 7C).

(A) Boxplot da expressão de ARNm de PGR (painel da esquerda), ESR1 (painel do meio) e Myc (painel direito) foi analisada de acordo com o grau de cancro do endométrio em 379 tumores do endométrio de pacientes de câncer de base de dados TCGA. Os pacientes foram divididos em quatro grupos: tipo endometrióide grau I 1 (G1, n = 86), grau 2 (G2, n = 103), de grau 3 (G3, n = 123) e o tipo seroso II grau 3 (G3, n = 67). (B) Análise de correlação pareada dos níveis PGR, ESR1 e mRNA Myc utilizando o método de Spearman. Os coeficientes de correlação e os valores de p são mostrados. (C) Dispersão para mostrar a correlação negativa da expressão de dois genes. Os pacientes foram representados graficamente no eixo dos X, a fim de aumentar a expressão de um gene específico. Duas linhas de regressão foram produzidos por análise de regressão linear simples com base na expressão dos respectivos genes. Esquerda: A expressão de Myc (vermelho) contra PGR (preto); direita:. expressão de Myc (vermelho) contra ESR1 (preto)

Para validar ainda mais a correlação inversa entre PR e Myc em amostras de doentes, examinamos como PR correlacionada com Myc genes a jusante SRD5A1, CCNB1 e CDK2. O método de correlação de Spearman demonstrou uma forte correlação negativa do PGR com SRD5A1, CCNB1 e expressão CDK2 (Fig 8).

(A) análise de correlação Pairwise da PGR e genes a jusante Myc, SRD5A1, CCNB1 e CDK2 utilizando o método de Spearman . Os coeficientes de correlação e os valores de p são mostrados. (B-D) Scatterplots para mostrar a correlação positiva ou negativa da expressão de dois genes, como na Figura 6C. (B) A expressão de SRD5A1 (vermelho) contra PGR (preto); (C) expressão de CCNB1 (vermelho) contra PGR (preto); e (D) expressão de CDK2 (vermelho) contra PGR (preto).

Discussão

O câncer endometrial é uma hormona regulada cancro, em que o crescimento unidades de estrogênio e progesterona suprime a proliferação e leva a diferenciação. A resposta à terapia com base em progestina correlaciona-se positivamente com a expressão do receptor de hormona, em particular receptor de progesterona (PR), no entanto, muitos tumores avançados são destituídos de expressão de PR, bem como ERa, o indutor de transcrição primária do PR. Recentemente, descobriu que a expressão PR pode ser restaurado por HDACi. Aqui nós estendemos estes resultados, informando que a expressão PR pode ser restaurado em células de cancro do endométrio, mesmo aqueles sem ERa. Estes dados são essenciais porque sugerem que, até mesmo em doentes com perda de ambas as ERa e PR, pode ser possível para restaurar a sensibilidade à progestina através de tratamento combinado com um modulador epigenética. Surpreendentemente, também encontramos que o oncogene myc, que se sabe ser induzida por ERa e PR em células de cancro da mama, foi acentuadamente reprimida por tratamento HDACi, incluindo em células que carecem de ERa. Além disso, a expressão exógena de PR por adenovírus promovido Myc downregulation, fornecendo mais evidências de que PR regula negativamente Myc expressão. Consistente com as observações em células cancerígenas, descobrimos que PR e Myc são inversamente correlacionados em tumores endometriais em TCGA conjunto de dados. Nossa hipótese é que a perda de Myc está na base das incidências diferenciadoras da terapia de progesterona no câncer de endométrio.

Myc é um oncogene bem caracterizado que desempenha um papel importante na patogênese de muitos cânceres [15,16]. Como outros tipos de câncer, Myc é altamente expresso em tumores do endométrio [17]. Estudos em modelos de camundongos transgênicos revelam que os resultados Myc de inactivação em regressão tumoral rápida e é frequentemente associada a características de diferenciação celular e apoptose [18,19]. Apesar da clara evidência para o papel altamente oncogênico de Myc em muitos tipos de tumores, incluindo o câncer endometrial, uma pequena molécula inibidora específica de Myc permaneceu uma incógnita [20]. estratégias de desenvolvimento de drogas atuais incluem segmentação percursos montante ou a jusante de Myc, como o bromodomain e motivo extra-terminal de inibidor (BET). Com efeito, a inibição de BET em vários resultados de mieloma em notável regulação negativa da expressão de myc e morte celular associada [16]. Aqui nós identificamos outro mecanismo potencial para amenizar os efeitos oncogénicos da Myc: supressão PR-mediada de Myc transcrição. Portanto, a terapia progestina reforçada molecularmente não só melhora a sensibilidade à progestina, restaurando a expressão PR funcional [5,10], mas também oferece uma vantagem adicional de downregulating Myc.

Outros mostraram que a expressão Myc é regulada através de mecanismos epigenéticos . Por exemplo, a repressão mediada HDACi-Myc de expressão também tem sido relatada em linhas de cabeça e pescoço de carcinoma de células escamosas de células [21]. O mecanismo potencial é up-regulação da

MXI1

e

SSB2

, que inibem a atividade transcricional de Myc [21]. No entanto, os nossos dados sugerem que o mecanismo de Myc repressão é por meio de RP. Em primeiro lugar, o tratamento com progesterona em combinação com HDACi produziu uma diminuição adicional na Myc, em comparação com HDACi sozinho. Em segundo lugar, a sobre-expressão de PRA /B por adenovírus na ECC1-

ESR1

células CRISPR KO diminuiu substancialmente Myc expressão na ausência de um HDACi, indicativo de um efeito mediado pelo PR, em vez de um efeito geral epigenética.

Vários relatórios em cancro da mama demonstram que ERa e PR promover a transcrição de Myc através da ligação ao elemento de resposta de estrogénio (ERE) e elemento de resposta a progesterona (PRE) na região promotora do Myc [11,13,22,23]. A mais antiga relatório de um pré na região do promotor de Myc em células de cancro da mama T47D foi publicado em 1997 [14]. A observação de que ERa e PR induzir a expressão de Myc é consistente com o fenômeno que progestágenos utilizados em medicamentos de contracepção promover o crescimento do cancro da mama

in vitro

e

in vivo

[24-26]. Aqui nós relatamos o efeito inverso no câncer de endométrio, onde a expressão de Myc inversamente correlacionada com ERa e PR, tanto em linhas celulares de cancro do endométrio e em tumores da base de dados TCGA. As experiências de controlo em células de cancro da mama MCF7 confirmou a correlação positiva de Myc com ERa e PR neste tipo de célula. Assim, a regulação negativa de Myc pelo PR no câncer de endométrio pode fornecer uma explicação para os efeitos opostos de progesterona na proliferação na mama vs. cancro do endométrio.

Em resumo, descobrimos que o tratamento HDACi de células de cancro do endométrio fornece a dupla vantagem de hiperregular o PR supressora de tumor e a regulação negativa do oncogene myc. Infelizmente, único agente HDACi tem limitado a eficácia clínica em tumores sólidos, e os estudos emergentes estão explorando o uso de HDACi a tumores “prime” a outros tratamentos [27, 28]. Com base em nossos extensos estudos de mecanismos de silenciamento PR no câncer de endométrio, sugerimos que HDACi pode ser usado para tumores do endométrio principais para a capacidade de resposta à terapia à base de progesterona, o que nos referimos à terapia progestina reforçada como molecularmente, através da modulação epigenética. Futuros estudos são necessários para entender se combinando uma HDACi com progestina irá restaurar PR, regular negativamente Myc, e levar a gestão da doença. Um primeiro passo pode ser para explorar esta estratégia combinatória na configuração neoadjuvante, o que proporcionaria a oportunidade para examinar os níveis de PR e Myc em biópsias pré-tratamento e pós-tratamento em espécimes cirúrgicos obtidos no momento da citorredução do tumor. Outra oportunidade terapêutica é no contexto de cancro do endométrio avançado ou recorrente, em que a maioria dos tumores do endométrio perderam expressão de PR. Ao integrar as terapias epigenéticas em regimes hormonais, pode ser possível melhorar os resultados para o cancro endometrial, doença que está em ascensão.

Informações de Apoio

S1 Fig. estimulação E2 induzir PR e expressão Myc em MCF7 células cancerosas da mama.

MCF7 células foram cultivadas em soro de carvão despojado e tratadas com 10 nM Estroadiol (E2) como ponto de tempo indicado. PR e a expressão da proteína ERa foi medido por transferência de Western. β-actina serve como controle de carga

doi:. 10.1371 /journal.pone.0148912.s001

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S1 Table. ESR1 sequência sgRNA e primers para PCR em tempo real

doi:. 10.1371 /journal.pone.0148912.s002

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