Abstract

mesothelin, um antigénio de diferenciação presente em uma série de doenças malignas como o mesotelioma, ovário, pulmão e cancro do pâncreas, tem sido estudada como um marcador de diagnóstico e um alvo para a imunoterapia. Nós, no entanto, foram interessados ​​em avaliar os efeitos da segmentação direta de mesothelin sobre a viabilidade das células cancerosas como o primeiro passo para o desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica. Relatamos aqui que silenciamento específico de genes para mesothelin por métodos distintos (siRNA e microRNA) diminuiu a viabilidade das células cancerosas de diferentes origens, tais como mesotelioma (H2373), câncer de ovário (SKOV3 e Ovcar-5) e cancro do pâncreas (MiaPaCa2 e Panc-1 ). Além disso, a capacidade de invasão das células cancerosas foi também diminuiu significativamente após esse tratamento. Em seguida, investigou características de sinalização pró-oncogênicos de células sobre mesothelin-silenciamento que revelaram uma diminuição significativa na fosfo-ERK1 e PI3K /AKT atividade. O mecanismo molecular da invasividade reduzida foi ligado à redução da expressão de β-catenina, um importante marcador de EMT (transição epitelial-mesenquimal). Ero1, uma proteína envolvida na remoção de proteínas desdobradas e um membro da ER-Stress (retículo endoplasmático-stress) via também foi acentuadamente reduzida. Além disso, mesotelina silenciamento causou um aumento significativo na fracção de células cancerosas em fase S. No próximo passo, o tratamento de células de cancro do ovário (OVca429) com um lentivírus expressando microARN anti-mesotelina resultaram em perda significativa de viabilidade, capacidade de invasão, e alterações morfológicas. Assim, propomos a inibição da mesothelin como uma potencial nova estratégia para alvejar tumores malignos humanos

Citation:. Wang K, Bodempudi V, Liu Z, Borrego-Diaz E, Yamoutpoor F, Meyer A, et al. (2012) Inibição da mesothelin como uma nova estratégia para a segmentação células cancerosas. PLoS ONE 7 (4): e33214. doi: 10.1371 /journal.pone.0033214

editor: Lin Zhang, da Universidade da Pennsylvania School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de setembro de 2011; Aceito: 05 de fevereiro de 2012; Publicação: 02 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Pesquisa da o laboratório de F. Farassati é apoiada por “all in de cura”, “o mesotelioma Fundação de Pesquisa Aplicada (MARF)”, “Marsha Instituto Rivkin para o cancro do ovário (MRC)” e “Instituto de vôo atendente de Investigação médica (FAMRI)”. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

mesothelin (MSLN), um antigénio de diferenciação membrana plasmática, é expresso em níveis significativamente elevados em vários cancros humanos, incluindo quase todos os mesoteliomas [1] e adenocarcinomas pancreáticos [2], [3] como poços como cerca de 70 % de cancros do ovário [4], [5] e 50% de adenocarcinomas do pulmão [6], [7]. MSLN é detectada em mais de 70% da punção aspirativa por agulha fina (PAAF) de adenocarcinomas pancreáticos [2]. Outro estudo recente mostrou MSLN derrame pleural como um marcador útil para a detecção de mesotelioma maligno da pleura [8]. MSLN também se expressa em quantidades vestigiais em células mesoteliais normais.

gene MSLN

codifica um polipéptido de 69 kDa contendo a sequência hidrofóbica na extremidade carboxilo, o qual é removido e substituído por fosfatidilinositol. gene MSLN contém 17 exões em 16p13.3 cromossoma humano e o ADNc é MSLN 2138-pb de comprimento, com uma grelha de leitura aberta de 1884 pares de bases.

ratinhos mutantes com inactivação de ambas as cópias do gene foram gerados com MSLN a finalidade de estudar a função dessa proteína, embora sem anormalidades detectáveis ​​foram relatados por este fenótipo [9] https://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/10/12/3937 – B8 # B8. Um outro conjunto de estudos introduziram MSLN para ser envolvido na adesão vez que as células NIH-3T3 transfectadas com um vector de expressão MSLN foram mais difíceis de remover de pratos de cultura de células não transf ectadas [1]. A possibilidade de um papel para MSLN na adesão é suportado por um estudo que mostra que se liga a MSLN CA125 (MUC16), um membro da família das glicoproteínas da mucina, e que tal interacção medeia a adesão celular [4]. Com base nestes resultados, os autores sugerem que pode haver um papel importante para CA125 e MSLN na difusão metastática do cancro [4]. Além disso, foi sugerido a interação mesothelin com MUC16 para facilitar a metástase peritoneal [10].

Em modelos, como o cancro do ovário, análises de correlação entre a expressão MSLN, a variabilidade patológica e os resultados clínicos indicam que a alta expressão MSLN foi positivamente associado com quimio-resistência em pacientes com carcinoma epitelial do ovário e tempo de sobrevida do paciente curta [12]. MSLN e outro marcador HE4 têm sido recentemente estudados quanto ao seu valor como marcadores para a detecção de carcinoma do ovário [5], [11]. De outras doenças malignas do homólogo ao MSLN gene, ou seja,

Erc

foi encontrado para ser sobre-expresso em carcinoma renal de ratos [12], [13]. Em doentes com cancro gástrico, o grupo positivo MSLN tinha envolvimento nodal e significativamente mais significativamente mais profunda invasão do tumor do que o grupo negativo MSLN [14]. Curiosamente, a taxa de sobrevida em 5 anos foi encontrado para ser maior no grupo positivo MSLN neste estudo.

Vários estudos têm indicado interações importantes entre as vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento do fenótipo maligno e MSLN. Por exemplo, MSLN foi encontrada para induzir a expressão das metaloproteinases da matriz (MMP-7) 7 [15] ou para aumentar os níveis de expressão de interleucina 6 (IL-6) [16]. Expressão de mesotelina, também é reivindicada a conferir resistência a apoptose em resposta ao factor de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) [17]. O gene MSLN é diferencialmente regulados por membros da via de transdução de sinal de Wnt [18]. Além disso, em células epiteliais mamarias C57MG rato, MSLN foi regulada por Wnt-1. Curiosamente, os tumores com activação constitutiva da via de sinalização Wnt, tais como cancros do ovário e do pâncreas, ter expressão elevada MSLN. Estudos adicionais são necessários para definir completamente a função MSLN, bem como o papel de MSLN na carcinogênese. A distribuição muito limitado de tecidos normais em MSLN MSLN retrata um candidato adequado para a terapia específica de tumores. Embora as estratégias, tais como a utilização de anticorpos monoclonais direcionados contra MSLN foram tentadas antes de [19], [20], [21], [22], [23], [24], o efeito de inibição directa de MSLN sobre a viabilidade de cancro células continua a ser investigado. Para além das ramificações de translação de tais investigações, a informação obtida é útil para avaliar o papel de MSLN na biologia do cancro. Neste trabalho, foram estudados os efeitos do silenciamento MSLN sobre a viabilidade, capacidade de invasão e celular vias de sinalização em células cancerígenas derivadas de mesotelioma, pâncreas e ovário. Além disso, o silenciamento MSLN por um lentivírus expressando microARN anti-mesotelina (miARN) também foi encontrada para reduzir significativamente a viabilidade e a capacidade de invasão de células de cancro do ovário. Nós também investigaram o resultado de silenciamento MSLN na sinalização celular características das células cancerosas e a progressão do ciclo celular, a fim de melhor compreender as vias envolvidas na função biológica desse antigénio.

Materiais e Métodos

linhas celulares e produtos químicos

BxPC3, células H2373, OVCAR5, e SKOV3 (todos obtidos a partir da colecção americana de cultura de tecidos, com excepção www.atcc.gov H2373 que foi obtida a partir de National Cancer Institute, NCI) foram cultivadas em meio RPMI-1640 que foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Sigma, St Louis, MO). OVCAR3 é cultivada em meio RPMI-1640 com FBS a 10% com adição de 2 mM de L-glutamina e 10 ug /ml de insulina. NIH3T3, Panc1, Maipaca2 (a partir de ATCC), e OVca429 células [25] foram cultivadas na modificação de Meio de Eagle (DMEM) (Sigma) suplementado com FBS a 10% por Dulbecco. As células HUVEC foram cultivadas em F-12K suplementado com 0,1 mg /ml de heparina, 0,05 mg /de suplemento de crescimento de células endoteliais ml, e 10% de FBS. As células HT1080 foram cultivadas em MEME suplementado com FBS a 10%. Os meios acima foram suplementadas com penicilina (100 UI /ml) e estreptomicina (100 mg /mL) (Sigma). 293FT células foram cultivadas em DMEM (alto teor de glucose) suplementado com 10% de ácido de FBS, 0,1 mM MEM não essenciais amino, 1 mM de L-glutamina, e 1 mM de piruvato de sódio MEM. HT1080, NIH3T3 e células HUVEC foram adquiridas de ATCC (Manassas, VA). 297FT células foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA).

siRNA anti-mesotelina foi ordenada da Qiagen (Valencia, CA). Foi sintetizado no formato de cadeia dupla com Alexa Fluor 488 (AF488) conjugado com a extremidade 3 ‘da sua cadeia de sentido directo. O oligo siARN foi re-suspensa no tampão fornecido a uma concentração de estoque de 20? M definitiva.

SiRNA electroporação

10

7 a 5 x 10 7

células foram re suspenso em 270 uL de Opti-MEM e misturados com 30 ul de solução de estoque de 20? M e siRNA electroporado (~240 V, um pulso de 20 milissegundos), de modo que a concentração final de siRNA anti-mesotelina foi de 2 uM. As células brilhantes, ou seja, as células com a maior quantidade de siRNA, foram seleccionados com base na presença de Alexa Fluor 488 marcação na extremidade 3 ‘da molécula de siRNA usando FACS.

ensaio de proliferação celular

ensaio de proliferação celular foi realizado usando WST-1 kit da Millipore (Billerica, MA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células (2.000 classificadas por FACS) foram semeadas em cada poço de uma microplaca de 96 poços num volume final de 100 ul. Em seguida, 10 ul /poço de reagente WST-1 foi adicionada e a placa foi incubada durante 1 hora em condições de cultura padrão. Durante a incubação, as células viáveis ​​converter reagente WST-1 em corante formazano pela desidrogenase mitocondrial celular. Após esta incubação, a absorvância foi medida a 440/600 nm.

invasão celular ensaio

A placa de câmaras de matrigel invasão e de cultura de tecidos Falcon companheiro foram obtidos da BD Biosciences (San José, CA) . Para experimentos de siRNA de controlo e células tratadas com siRNA anti-mesothelin (30.000 células /poço) foram plaqueadas em placas de 24 poços e incubou-se a 37 ° C com 5% de CO

2. Quarenta e oito horas mais tarde, as células foram fixadas em metanol a 100% e coraram-se em 0,05% de violeta de cristal e fotografada visualmente para contar o número de células invadidas. Para as células experiências relacionadas lentivírus foram pré-tratados com lentivírus durante 3 dias e, em seguida, introduzido no ensaio de câmara de Boyden para ~21 horas.

análise Western blot

As células foram lisadas em 5, 24, e 48 horas pós-electroporação com 1 × tampão de lise celular. Trinta microgramas de proteína para cada amostra foi carregada sobre gel de poliacrilamida de 4-20% de SDS (Bio-Rad, CA). As proteínas foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi bloqueada, lavadas, e incubadas com os diferentes anticorpos primários, tais como mesotelina (Abcam, MA e LS Bio, WA) e β-actina (Cell Signaling Technology, MA), seguido pelo anticorpo secundário conjugado com HRP. Depois de uma lavagem exaustiva, a membrana foi exposta a ECL (GE Healthcare, NJ) e autorradiografia.

ciclo celular ensaio

ensaio de ciclo celular foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, cerca de 10

6 as células foram lavadas duas vezes com solução CycleTEST mais tampão (BD Biosciences, Cat. 340242). As células foram re-suspensas em 1 ml do mesmo tampão. Para corar as células, foram adicionados 250 ul de solução A e 200 ul de solução B e incubou-se durante 10 minutos à TA. Foi adicionada solução fria C (200 ul) e incubou-se a 4 ° C durante 10 minutos. As células foram filtrados através de um filtro de 35 um da célula e analisadas por citometria de fluxo FACSort.

construção de vector que expressa miARN

concebidos e sintetizados três miARN alvo imita o comprimento completo do gene humano mesotelina ( gene número de acesso: NM_005823.4). Cada concebido miARN mímico foi de 64 nucleótidos de comprimento, incluindo a sequência de flanqueamento parcial, o hairpin miARN, e amadurecer miARN (itálico /sublinhado) derivada a partir do gene alvo como se segue: 1-TGCTG

ATAGCAGCAGGTCCAATGGGA

GTTTTGGCCACTGACTGACTCCCATT GCCTGCTGCTAT; 2-TGCTG

TTCATGTTCTGGAAAGCAAGG

GTTTTGGCCACTGACTGACCCTTGCT TCAGAACATGAA; e 3-TGCTG

TTTACTGAGCGCGAGTTCTCT

GTTTTGGCCACTGACTGACAGAGA ACTCGCTCAGTAAA.

Usando o kit de vector de expressão de BLOCK-iT Pol II miR RNAi (Invitrogen, CA), que recozido e clonado os oligos que codifica a engenharia de pré-miRNA no sítio de clonagem (ACGA e CAGG) de vectores pcDNA 6.2-GW /EmGFP-RIM que é flanqueada em ambos os lados para permitir a clonagem direccional ou processo adequado de pré-miARN. O pré-miARN foi inserido na 3’UTR do gene EmGFP-impulsionado por promotores de pol II. EmGFP permite rastrear expressão da miARN, proporcionando uma forte correlação entre a expressão e EmGFP miARN. Cada plasmídeo foi sequenciado para confirmar os oligos de cadeia dupla de miARN inseridos. Os plasmídeos que expressam foram electroporadas em células OVCAR5 ou células SKOV3, e analisadas por FACS para assegurar a expressão apropriada de miARN em células de cancro do ovário.

A geração de partículas lentivirais que expressam miARN

O clone de entrada estava gerado por combinação com pMSLNmiR3 pDONR 221 construto com a enzima BP clonase II. A cassete miRNA foi transferido para o pLenti6.3 /TO /vetor V5-DEST contendo locais attr1-attr2 usando LR clonase II para criar o vector lentiviral última MSLNmiR3. Além disso, criamos um vector de codificação lentiviral mexidos miRNA (controle negativo) (TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACCTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCAC GCGCAGTACATTT) (Invitrogen), que não tem como alvo qualquer gene humano conhecido. A expressão de miARN é conduzido pelo promotor de CMV. As sequências inseridas de miARN mir3 e mexidos foram confirmadas por análise de sequência.

Produção, titulação e infecção de partículas lentivirais

O lentivírus MSLNmiR3 ou controlo negativo foi transfectado com ViraPower mistura embalagem (Invitrogen, CA ) em 293FT células humanas utilizando Lipofectamina 2000 em Opti-MEM I médio (Invitrogen, CA) e cultivadas durante a noite. As células foram colocadas sob blasticidina (10 ug /ml) de selecção durante 72 horas. O sobrenadante foi recolhido e as partículas lentivirais foram concentradas utilizando Lenti-X Concentrador (Clontech, CA). Lentivirus estoque foi diluído em série de dez vezes para infectar as células HT1080. Quarenta e oito horas após a infecção, as células foram avaliadas por FACS e a titulação foi calculada usando a fórmula [/V FXC] xD, em que “F” é a frequência de células positivas para GFP; “C” é o número total de células no poço no momento da transdução; “V” é o volume de inóculos em ml; e “D” é a diluição lentivírus. Ovca429 células foram infectadas com lentivírus em partículas MOI~30 na presença de polibreno (10 ug /ml) durante a noite. O ensaio de proliferação celular foi realizado de pós-infecção nos pontos de tempo indicados.

A citometria de fluxo

As células cultivadas foram dissociadas com tampão de dissociação de células (Sigma-Aldrich, MO) e lavadas duas vezes em tampão de MACS (PBS mais de EDTA e 0,5% de albumina de soro de bovino) (Miltenyi Biotec, CA). Um total de 2 x 10

5 células (100 ul) foram incubadas com anticorpo monoclonal mesotelina (concentração final, 1 ug /ml) (Cat # ab3362, Abcam, MA) em gelo durante 1 hora no escuro. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de MACS, re-suspenso em 100 ul de um anticorpo secundário (diluição 1:200, IgG conjugado APC; BD Biosciences, NJ), e incubadas em gelo durante 1 hora no escuro. As células foram lavadas duas vezes e analisadas no analisador LSRII (BD Biosciences, NJ) utilizando o software de FACS diva versão 6.1. Células marcadas com anticorpo secundário sozinho foram incluídos para provar a especificidade do anticorpo.

Resultados e Discussão

Nós decidimos avaliar os efeitos do silenciamento MSLN usando short-interferência RNA (siRNA). Mecanicamente, estes 19-21 oligômeros podem ligar-se a uma sequência de correspondência específica em seus RNAs mensageiros-alvo (mRNAs) e sinalize-os para a destruição por um complexo conhecido como induzida pelo RNA silenciamento complexos (RISC). Para alcançar isto, a sequência de ARNm MSLN foi analisada com o software especializado (Qiagen, CA) e as sequências de oligómeros de siRNA foram detectados. Uma dessas sequências (5′-CTGGACGTCCTAAAGCATAAA-3 ‘) foi seleccionado por causa da sua maior grau de especificidade contra MSLN. O oligómero anti-MSLN siARN foi sintetizado (no formato de cadeia dupla) e conjugado com Alexa Fluor 488 no extremo 3 ‘da sua cadeia de sentido directo (Qiagen, CA). A Figura 1A mostra a sequência de ARNm humano para MSLN e o sítio de ligação para anticorpos anti-MSLN siARN.

(A) siRNA anti-mesotelina foi concebido para uma posição na sequência meio ARNm mesotelina. (B) Uma vez que a electroporação com o siARN anti-mesotelina, os níveis de expressão mesotelina foi significativamente reduzida em células H2373. siRNA controle negativo não causar tal redução. painel inferior mostra os resultados de banda-densitometria comparando a intensidade de expressão mesotelina sobre electroporação de células H2373 com siARN. siRNA (C) anti-mesotelina não afectou os níveis de β-actina, uma proteína de manutenção da casa de expressão, como evidência da especificidade da presente siARN anti-mesotelina para o seu alvo. (D) taxa de proliferação das células H2373 é significativamente (p 0,05) reduzidos a 48 horas pós-electroporação de 40% dos valores para as células de controlo tratadas negativos. A recuperação na taxa de proliferação é observada devido à liberação de siRNA a partir de células em momentos posteriores em harmonia com nossos estudos anteriores. painéis de texto destacado mostram a densidade de células em cada grupo do estudo às 48 horas pós-electroporação. células (E) NIH3T3 são nulas de mesotelina e a sua taxa de proliferação não é afectada por exposição ao siRNA anti-mesotelina (rato). painéis de texto explicativo mostrar a densidade de células em 48 horas pós-eletroporação.

A fim de investigar os efeitos de anti-MSLN siRNA na expressão de MSLN, foi utilizada a linha de células de mesotelioma humano H2373. Como mostrado na figura 1B, uma vez que a electroporação com o anti-MSLN siRNA, a expressão de MSLN foi notavelmente reduzida tão cedo quanto 24-48 horas pós-electroporação, em comparação com as células tratadas de controlo negativo. Não foram observadas alterações na expressão de β-actina (um produto de gene de manutenção da casa) após a exposição das células ao anti-MSLN siRNA (Figura 1C).

Em seguida, decidiu testar a taxa de proliferação de câncer células em tais condições. Como se vê na figura 1D, uma redução significativa (p 0,005) na proliferação de células de mesotelioma foi observado tão cedo quanto 48 horas após a electroporação. É importante observar que a taxa de proliferação de células tratadas com ARNsi de controlo em cada ponto de tempo foi medido e, em seguida, dimensionados como 100%. A taxa de proliferação de células tratadas com siRNA anti-MSLN foi calculada e dimensionada como uma fracção dos valores de controlo. Os painéis de chamada representa a densidade celular das populações de teste e de controlo tratados nos tempos indicados pós-electroporação. Curiosamente a taxa de proliferação de células tratadas com siRNA começou a aumentar em 72-96 horas após a electroporação. Isto é devido à natureza transiente da transfecção por electroporação, que é o método utilizado nestas experiências para introduzir anti-MSLN siRNA para as células. Em outras palavras, com o passar do tempo, a concentração de siRNA em células tratadas diminuiria permitindo uma recuperação de proliferação. Temos observado tal fenômeno em nossos outros estudos envolvendo gene silenciamento específico [26], [27]. Uma vez que o mesmo procedimento foi aplicado a células NIH3T3 (vazia de MSLN), observou-se alterações estatisticamente significativas na viabilidade (o siRNA utilizado neste experimento pode ligar para rato MSLN mRNA) (Figura 1E).

próximo passo, decidimos testar os efeitos de silenciamento MSLN em outras células que expressam MSLN incluindo linhas celulares de cancro do ovário e pâncreas e comparar tais efeitos com os nossos dados sobre células de mesotelioma. Os níveis de expressão de MSLN em um painel de células de cancro do pâncreas e do ovário foram testados utilizando transferência de Western, como mostrado na figura 2A. MiaPaCa2, BxPC3 e Panc1 (linhas celulares de cancro pancreático) e SKOV3 e OVCAR3 (linhas celulares de cancro do ovário) apresentaram níveis aumentados de expressão MSLN enquanto HUVEC (células endoteliais da veia umbilical humana) e NIH3T3 células permaneceram negativos para MSLN como esperado. A electroporação de todas as linhas de células de cancro acima mencionados resultou numa redução significativa da sua viabilidade (Figura 2B-2D, os resultados apresentados para SKOV3, BxPC3 e MiaPaCa2). Mais uma vez, foi observada uma recuperação da proliferação devido ao apuramento de siRNA a partir de células de cancro do pâncreas e ovário. O prazo para essa recuperação foi variável entre essas linhas celulares, devido à sua taxa de depuração relativa de siRNA.

proteínas (A) mesothelin foi detectado em linhas celulares de cancro do pâncreas, Panc1, MiaPaCa2 e BxPC3 e células de cancro do ovário SKOV3 e OVCAR3. NIH3T3 e células HUVEC que são nulas de mesotelina foram utilizados para provar a especificidade do anticorpo mesotelina. células (B) SKOV3 tinha reduziu a proliferação no dia 3 pós-electroporação com siRNA anti-mesotelina a cerca de 50% do controlo negativo. painéis de texto destacado mostram a densidade de células em cada ponto de tempo. (C-D) Duas linhas de células de cancro do pâncreas, BxPC3 e MiaPaCa, foram testados para o resultado do silenciamento mesotelina sobre a sua proliferação. Em ambos os casos observou-se uma perda significativa de proliferação, no entanto, para o declínio BxPC3 inicia a pontos de tempo posteriores, em comparação com células MiaPaCa. Para ambas as células, uma vez, um ressalto na taxa de proliferação é observada a mais longos intervalos de tempo, devido à folga de ARNip a partir de células. painéis de texto destacado mostram a densidade de células em cada ponto de tempo.

Enquanto todas as células cancerosas mostrou perda significativa de viabilidade após a electroporação com anti-MSLN siRNA, as células sem expressão de MSLN tais como células NIH3T3 não fez apresentam mudanças significativas em suas taxas de proliferação, uma vez electroporated com anti-MSLN siRNA (visando MSLN mouse). Portanto, as células normais, com muito baixa ou nenhuma expressão de MSLN não seria afectada por esta estratégia implica a especificidade dos resultados biológicos de MSLN silenciamento de células malignas. Por conseguinte, a inibição da MSLN pode ser considerado como uma estratégia potencial para o direccionamento de tumores, tais como mesotelioma, do ovário e cancro do pâncreas de uma forma específica de célula. Ensaios clínicos recentes que utilizam anticorpos monoclonais contra MSLN também têm sido relatados para ser bem tolerada em pacientes confirmando mínima in vivo para efeitos colaterais MSLN segmentação estratégias [28], [29]. Isto é de especial importância devido aos níveis limitados de expressão mesothelin no pleural, pericárdio e membranas peritoneal [30], [31].

Nós também tiveram interesse em investigar o corolário de silenciar MSLN sobre a invasão de células cancerosas. Metástase como o resultado mais devastadora de malignidades desempenha um papel importante na patogénese de cancro. Portanto, é um passo lógico para estudar o resultado do silenciamento mesotelina sobre as capacidades de células de cancro para invadir. Esta é também uma preocupação importante, considerando a natureza invasiva de doenças malignas estudadas neste trabalho. Para esse fim utilizou-se um modelo in vitro baseado no estudo das capacidades de células para invadir através de uma camada de matrigel como um modelo para a metástase (ensaio de câmara de Boyden modificado). Foi avaliada a capacidade de invasão de células H2373, SKOV3 e BxPC3 uma vez tratados com anti-MSLN e ARNsi de controlo (Figura 3A-3C). Nos três casos, foi observada uma redução significativa na capacidade de invasão. A invasividade diminuição de todas as células cancerígenas testadas é de relevância clínica especial devido à natureza metastática elevada destas doenças.

(A) Uma vez testado num ensaio de câmara de Boyden modificado, a capacidade de invasão de células H2373 mesotelioma é reduzida significativamente (p 0,05) de silenciamento mesotelina. As células electroporadas foram introduzidos nas câmaras de invasão para esta experiência e células invadidas foram contadas e fotografadas após 48 horas. painéis de texto destacado representar a densidade de células invadidas coradas com violeta de cristal. células (B-C) e SKOV3 BxPC3 ambas exibem um aumento significativo (p 0,05) em diminuir a sua capacidade de invasão em cima do silenciamento mesotelina a valores inferiores a 20% do controlo negativo. painéis de texto destacado representar a densidade de células invadidas coradas com violeta de cristal. (D) Silenciamento mesotelina induz um decréscimo significativo na activação (fosforilação) de ERK1 (mas não de ERK2) e fosfo-AKT. Além disso, a expressão de β-catenina, um marcador conhecido EMT, foi reduzida. Slug, outro fator de transcrição envolvidos na EMT mostrou um ligeiro aumento sob esta condição. A partir de marcadores ER-stress, Ero-1 foi diminuída enquanto Bip foi ligeiramente elevada. (E) A progressão do ciclo de célula é alterada por mesotelina silenciamento principalmente por um aumento na percentagem de células em fase S. A percentagem de células em cada fase é mostrada no painel superior e o fluxo de dados representativa citometria é oferecido no painel inferior. G1, S e G2 picaretas são marcadas em cada gráfico que mostra um aumento na população de fase S de células.

Para este fim, tínhamos observado a perda de viabilidade e capacidade de invasão em uma gama de células cancerosas em cima silenciamento de MSLN. A fim de elucidar de algum modo o mecanismo molecular subjacente a tais alterações fenotípicas que avaliou o nível /activação de expressão algumas das proteínas de sinalização mais importantes envolvidos na transformação neoplásica em células H2373 (Figura 3D). vias efectoras a jusante do proto-oncogene Ras [32], [33], [34], tais como a activação de ERK1 /2 (quinase relacionado com o sinal extracelular), fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K /AKT) e p38 (p38- quinase) foram estudados para esta finalidade. Observou-se que em cima MSLN silenciamento, fosfo-ERK1 e níveis de activação fosfo-AKT foram profundamente diminuída, enquanto os níveis de fosfo-p38 permaneceu inalterado (Figura 3D). Com o envolvimento de ERK em proliferação e metástase [35], [36] e também o envolvimento da via PI3K /AKT na protecção contra a apoptose [37], uma diminuição na activação destas vias de sinalização pode explicar os efeitos anti-proliferativos de silenciamento MSLN . No entanto, p38 da via [38] (envolvida no esforço de sinalização, de apoptose e senescência) parecia permanecer inalterado após inibição da MSLN. Uma vez que os actos de p38-quinase como uma via inibidora do crescimento, é concebível que a capacidade das células de se submeter a inibição do crescimento e /ou apoptose (ditada pela via da p38-cinase) não é afectada pelo silenciamento MSLN.

O resultado de knockdown mediado por siRNA de MSLN em epitelial-mesenquimal de transição (EMT) [39], [40], um programa biológico para reforço das capacidades metastáticos, também foi investigado por nossa equipe. EMT é um passo biológico importante na realização de um fenótipo metastático por células cancerosas [41]. Beta-catenina, uma das Wnt a jusante moléculas de sinalização e também um actor importante na EMT, foi encontrado para ser significativamente reduzido mediante silenciar MSLN (figura 3D, o painel do meio). Slug, outro repressor da transcrição envolvidos na EMT foi encontrado para ser um pouco aumentada após a MSLN silenciar [42]. Com considerações ao papel do Slug na repressão da caderina-E [43] seria o próximo passo lógico para avaliar os níveis de expressão da caderina-E em cima silenciamento mesothelin. No entanto, nenhuma alteração significativa foi observada nos níveis de E-caderina (dados não mostrados). Portanto, o aumento gradual dos níveis desta proteína pode não afetar positivamente as capacidades EMT de células cancerosas, uma vez mesothelin é silenciado.

Nós também estávamos interessados ​​em investigar os níveis de expressão de marcadores envolvidos na regulação da ER- estresse. situações de estresse que interrompem ER função de levar ao acúmulo de proteínas desdobradas no ER, que é referido como ER-Stress [44], [45]. Mediante tais condições, um painel integrado de vias de sinalização resultante torna-se activado em resposta a proteínas desdobradas (UPR) [46], [47]. Após continuação da resposta RPU e se as proteínas desdobradas não são apagadas mecanismo será activada para induzir a morte celular. Existência de condições ER-estresse crônico está se tornando cada vez mais evidente em células de câncer [47]. Por isso, seria novo e interessante ver se as alterações na via ER-Stress contribui para o resultado do MSLN silenciamento em células cancerosas.

ER-residente proteína endoplasmático oxidoreductin-1 (Ero1), uma das moléculas envolve na via do ER-stress, oxida dissulfureto de proteína isomerase (PDI), que, por sua vez, apresenta bandas dissulfureto às proteínas ER [48]. A diminuição significativa observada em Ero1 sobre silenciamento MSLN pode resultar em uma diminuição da capacidade das células cancerosas para dobrar e proteínas claras que conduzam à sua eventual morte (Figura 3D, painel inferior). Além disso, uma expressão aumentada foi observada em Bip (ligação luminal precursor da proteína), uma proteína molecular adventícia envolvido na prevenção da agregação de proteínas [49]. Tal observação pode ser um indicativo de níveis elevados de proteína se desdobrar em cima MSLN silenciamento como os níveis de Bip são geralmente levantadas na célula para combater a agregação de proteínas desdobradas [50].

A última característica fenotípica estudado em células MSLN-silenciados foi a progressão do ciclo celular. A principal alteração observada nestas células foi um aumento significativo (-50%) na fracção de células em fase S que retrata um bloqueio na progressão de S a fase G2 (Figura 3E).

A abordagem actual para o avanço da terapia inibidora de ARN para estudos pré-clínicos e clínicos baseia-se principalmente na utilização lentivírus, de modo a expressar moléculas de siRNA e entregar de uma forma contínua [51], [52], [53]. Para o efeito, e para produzir uma ferramenta de translação para alvejar as células cancerosas com base na inibição da MSLN, decidimos desenvolver um lentivírus expressando anti-MSLN miRNA. Tal ferramenta podem ser utilizados no futuro para avaliar ainda mais o valor pré-clínica de silenciamento do gene específico MSLN como uma abordagem terapêutica.

O mais curto do ácido ribonucleico (RNA) moléculas de (± 22 nucleótidos) encontrado em todas as células eucariotas, miRNAs são reguladores pós-transcricional que se ligam a sequências complementares de transcritos de mRNA alvo. Isto resulta na repressão de translação e o silenciamento de genes específicos [54], [55]. Uma vez que uma série de três sequências de miARN (miR1, miR2 e mir3, posições relativas são mostradas na Figura 4A, painel superior) foram seleccionados, cada um deles foi clonado num plasmídeo de expressão (pcDNA6.2-GW /EmGFP, Invitrogen) e electroporado em células OVCAR5. Todos os plasmídeos foram eficazmente electroporadas para dentro das células (com base na expressão da GFP) (Figura 4A, painel do meio). Dois dos miRNAs projetados (miR1 e mir3) dos três silenciados MSLN eficiente como foi revelado por western blot (Figura 4A, painel inferior).