Abstract

Fundo

Compreender os motoristas para a metástase no câncer humano é importante para potencial desenvolvimento de terapias para o tratamento de metástases. O papel da perda de TGFp atividades supressores de tumor no processo metastático é essencialmente desconhecido.

Metodologia /Principais Achados

Utilizando

in vitro

e

in vivo

técnicas, que têm demonstrado que a perda de sinalização de TGF-p supressor de tumores é necessária para permitir que a última etapa do processo metastático – colonização do local metastático. Este trabalho demonstra, pela primeira vez que a reconstituição do receptor de TGFp leva à diminuição da colonização metastático. Além disso, nós identificada uma nova TGFp /PKA supressor de tumor que actua directamente sobre um mecanismo de sobrevivência celular que se sabe que responde ao estresse com a survivina inibição dependente /XIAP de caspases que efeito apoptose. A ligação entre a sinalização de TGF-p transduceome /PKA e de controlo de metástases através da indução da morte de células foi mostrado por restauração do receptor de TGFp com reactivação da via de TGFp /PKA em receptores de células metastáticas de cancro do cólon deficientes conducentes a um controlo de sobrevivência celular aberrante.

Conclusão /Significado

Esta impactos de trabalho a nossa compreensão dos possíveis mecanismos que são fundamentais para o crescimento e manutenção de metástases, bem como a compreensão de um romance função TGF como um supressor metastático. Estes resultados levantam a possibilidade de que a regeneração de sinalização de TGF-p atenuada seria um alvo eficaz no tratamento de metástases. O nosso trabalho indica que o potencial clínico para o desenvolvimento de terapia anti-metástases baseada na inibição de este mecanismo muito importante aberrante sobrevivência celular induzida pelo transduceome via TGFp /PKA multifacetada. Desenvolvimento de tratamentos eficazes para a doença metastática é uma necessidade premente desde metástases são a principal causa de morte em tumores sólidos

Citation:. Chowdhury S, Howell GM, Rajput A, Teggart CA, Brattain LE, Weber HR, et ai. (2011) Identificação de um Novel TGF /PKA Sinalização Transduceome no controle mediador da célula de sobrevivência e metástase no câncer de cólon. PLoS ONE 6 (5): e19335. doi: 10.1371 /journal.pone.0019335

editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de fevereiro de 2011; Aceito: 27 de março de 2011; Publicado em: 03 de maio de 2011

Direitos de autor: © 2011 Chowdhury et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede CA72001 e CA38173 para MGB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das neoplasias mais comuns com altas taxas de incidência a nível mundial [1] e é a segunda maior causa de morte relacionada com câncer entre adultos nos Estados Unidos [2]. CRC pode ser curada por cirurgia e tratamento multimodal em cerca de metade dos indivíduos com esta doença (estágios I-III). No entanto, as metástases para órgãos distantes (estágio IV) é a causa mais freqüente de falha do tratamento [2]. Trabalhos recentes sublinhou a importância do desenvolvimento de sobrevivência celular inapropriada de sinalização para vários passos no processo metastático. Particularmente digno de nota, no contexto de sobrevivência de sinalização para o processo metastático é a importância da sobrevivência celular aberrante a colonização em locais bem sucedida metastáticas em órgãos distais [3]. Importantemente, os mecanismos moleculares envolvidos na fase precoce de metástases crítica para o diagnóstico e terapia não são bem compreendidos [1]. Vários jogadores chave, incluindo a Bcl-2, inibidor-de-apoptose (IAP) proteínas XIAP e de survivina, e a fosfoinositida 3-quinase (PI3K) – AKT /PKB que transmitem sinais anti-apoptóticas na promoção do crescimento de células de cancro têm sido implicados em metástase [4], [5].

genes supressores de tumor (TSG) contribuir para a indução de apoptose em resposta ao stress. A falha em induzir apoptose em resposta a vários tipos de danos celulares tem sido reconhecidas como contribuindo para a oncogénese. Um exemplo de perda TSG contribuindo para a formação e progressão do cancro é TGFp sinalização [2]. A via de sinalização de TGF-p tem sido contribuir tanto negativa como positiva na regulação da inibição do crescimento, proliferação, a replicação, invasão, metástase, apoptose, vigilância imune e angiogénese de um modo dependente do contexto [6]. TGFp respostas supressores inibitória /tumorais são diminuiu com o aumento da progressão e em doenças malignas de fase tardia são muitas vezes danificados de forma que suporta invasão e metástase [6]. Embora a corrupção de respostas de TGF-p para apoiar metástase implica a presença de receptores funcionais nestas células, é igualmente claro de que há números substanciais de modelos que variam a partir de ratinhos transgénicos para xenoenxertos de cancro humano, indicando que a perda de, ou a atenuação, de expressão do receptor em uma ampla variedade de tipos de tumor conduz a uma maior malignidade [7], [8], [9], [10]. Estes resultados sugerem que alguns subgrupos de cânceres têm buscado um caminho em direção a progressão maligna envolvendo a perda de expressão do receptor de TGF enquanto outros têm, de uma forma ainda indeterminado, usurpado TGF sinalização para conduzir progressão maligna. Existem vários exemplos de silenciamento do receptor de TGF-p em amostras clínicas indicam que o receptor de TGFp RI e /ou RII (designado TGFβRI e TGFβRII respectivamente) downregulation são eventos precoces na oncogénese e que a perda de expressão do receptor por silenciamento epigenético se correlaciona com a progressão maligna em subgrupos de várias tipos de cancro [11], [12].

Demonstrámos que TGFp sinalização num modelo de carcinoma de cólon fase inicial não metastático leva à morte celular em células do cancro do cólon, em resposta ao stress em associação com a inactivação de pakt e a inibição da expressão da proteína IAP survivina [13]. A formação do complexo entre a survivina e outra proteína IAP XIAP no citoplasma na resposta ao stress que permite a estabilização de XIAP e de inibição dos seus alvos efectoras e caspase verdugo para inibir a morte de células [14]. Portanto, dado o papel dominante da PI3K sinalização /AKT em mecanismos de sobrevivência celular ea associação de XIAP e survivin na progressão do cancro [5], que postulava que a perda da sinalização TGF podem contribuir para melhorar a expressão de XIAP /survivin e, consequentemente, perda de sinalização TGF pode ser a chave para um mecanismo de sobrevivência aberrante permitindo o crescimento metastático em sites de órgãos distais em contraste com a visão atual que TGF TSG é principalmente um gatekeeper para evitar oncogênese.

sinalização TGF foi mostrado para ativar cAMP proteína dependente quinase A (PKA) [15]. PKA desempenha um papel dominante na integração de várias redes de transdução de sinal [16], incluindo a capacidade de perturbar o complexo /survivin XIAP através da fosforilação da survivina em Ser

20 [17].

Os mecanismos moleculares envolvidos na infra-regulação mediada por TGF-p de IAP foram analisadas a fim de determinar os efeitos da sinalização do receptor de TGFp no metástases num modelo ortotópico metastático de carcinoma do cólon. Nós agora relatam a identificação de um romance TGF /PKA /AKAP transduceome mediada que converge na função XIAP em controlar a sobrevivência da célula aberrante. Além disso, mostrámos que o receptor de resgate TGFp nas células altamente metastáticas com silenciamento epigenético dos receptores de TGF-p leva à diminuição de metástases em um TGFp /PKA sinalização mecanismo dependente via de uma maneira altamente metastáticas modelos ortotópicos de cancro do cólon in vivo. Resgate de aspectos específicos supressores de tumores da via de sinalização de TGF-p podem proporcionar benefícios terapêuticos sem promover a sobrevivência de células metastáticas e efeitos de TGFp. Se estes efeitos supressores de tumor de TGF-p pode ser imitada em tumores fase tardia, valor terapêutico contra o câncer colorretal metastático pode vir a ser obtido.

Resultados

TGF ativa PKA em células de cancro do cólon

Um relatório crítico do laboratório Simeone notar que a sinalização de TGF-p em células activa PKA Mv1Lu e medeia o controlo de respostas inibitórias de crescimento TGF-p [15]. TGFp activação de PKA foi mediada por um mecanismo independente de Smad-dependente, o AMP cíclico (AMPc). Isto levantou a possibilidade de que o TGFp sinalização mediada controlo de sobrevivência celular aberrante observada na fase inicial TGFp-sensível FET cólon carcinoma modelo pode envolver a activação de PKA. Nossa hipótese é que TGF ativa PKA em células FET em um mecanismo de cAMP independente, Smad dependente. Para este fim, as células foram tratadas com FET TGFp (5 ng /mL) durante tempos especificados, e um ensaio de proteína-quinase foi realizado para medir a actividade de PKA (Figura 1A). Após um tratamento de TGF-p, a actividade de PKA aumentou aproximadamente 2 vezes dentro de 15 min e 4 vezes em 1 h. Observou-se que a activação de PKA TGFp mediada foi completamente abolida após pré-tratamento de células com H89 (15 pM), um inibidor de PKA farmacológica [15]. TGFp activação mediada por PKA também era dependente (Figura 1B), com uma actividade máxima em células FET observada a 5 ng /ml de TGF-p de concentração. Para confirmar que a activação de PKA foi a jusante da activação de TGF-p por Smad, observou-se que o pré-tratamento com H89 não teve efeito sobre a fosforilação de Smad2 por TGFp utilizando análise de imunotransferência (Figura S1). Nós desenvolvemos estável PKA subunidade α catalítica shRNA knockdown em células FET (FET designado PKACatα KD) para validar a resposta H89 geneticamente (Figura S2). TGFp tratamento para os tempos especificados não foi capaz de activar a PKA nas células knockdown em oposição à activação robusto nas células parentais FET (Figura 1C). A activação de PKA por TGF-p tem sido mostrado para ser independente de AMPc em células Mv1Lu [15]. activação de PKA clássica envolve AMPc ligação às subunidades reguladoras da PKA para provocar a dissociação das subunidades catalíticas. Um mecanismo alternativo de activação de PKA envolve a associação de IkB com subunidades catalíticas de PKA, mantendo assim um estado inactivo de PKA. Após a degradação de IkB, há a activação de PKA independente da activação de cAMP [18]. Determinou-se se a activação de PKA por TGF-p é dependente da activação de AMPc em células FET por tratamento de células com o TGF-p e medindo os níveis de cAMP utilizando um não radioactivo da enzima cAMP imunoensaio (Figura 1D). Observou-se que o TGF-p era capaz de aumentar a produção de AMPc em contraste com o tratamento Forskolin que proporcionou um aumento significativo nos níveis de AMPc como esperado. Em seguida, examinámos a proteína IkB a seguir ao tratamento para TGFp tempos especificados para determinar se a activação de PKA por TGFp era devido a degradação de IkB (Figura S3). Os níveis de IkB permaneceram inalterados após tratamento com TGFp. Portanto, PKA é ativado por TGF em um acampamento e forma independente IkB em células FET de acordo com o relatório de Zhang et al (2004). Para confirmar ainda mais o significado funcional da activação de PKA mediada TGFp, factor de transcrição CREB foi testada, que foi identificada como um alvo directo do AMPc-PKA [15] sinalização. Observou-se que o TGF-p era capaz de estimular a fosforilação de CREB (Figura 1E), sem qualquer alteração nos níveis totais de CREB (dados não mostrados). O pré-tratamento das células com H89, seguido por exposição TGFp reduziu significativamente a fosforilação de CREB. Zhang et al (2004) enfatizou o papel da Smad3 activado na activação de PKA TGF mediada. Nós desenvolvemos estável knockdown shRNA Smad3 em células FET (FET designado Smad3KD) (Figura S4). tratamento TGF-p nestas células Smad3 knockdown foi incapaz de activar a PKA (Figura 1F) para indicar a dependência de TGFp mediada por activação de PKA em Smad3 como relatado anteriormente [15].

FET células tratadas com TGFp (5 ng /mL ) activado PKA em vez (a) e a concentração de (B) forma dependente. H89 inibidor de PKA (15 uM) foi utilizado para inibir a activação de PKA. Forscolina (10 ^ M) foi usada como um controlo positivo. Comparação de FET parental e células FET PKACatα KD para a activação de PKA TGFp mediada (C). Knockdown de α-subunidade catalítica revogada activação de PKA por TGFp. activação de PKA por TGFp é independente de geração de AMPc como determinado pelo ensaio de cAMP (D). TGFp conduz à activação da CREB em células FET (E). Actina foi utilizado como controlo de carga para Western blots. activação de PKA por TGF-p é dependente Smad3 como determinado por knockdown de Smad3 em células FET (F). Os resultados são expressos como média ± S.E.M (n = 3). Todos os experimentos foram repetidos três vezes de forma independente.

TGF /PKA sinalização mediada XIAP downregulation

XIAP e survivin estão bem caracterizados membros da família IAP recentemente documentados como genes metastáticos [5]. O seu papel concertado na promoção da sobrevivência celular e metástase fornece uma forte razão para alvejar a expressão e /ou actividade destes IAPs em estágios avançados de câncer. Um acontecimento precoce associada com a activação de PKA é fosforilação de survivina em Sor

20 no citosol, mas não na mitocôndria [17]. Esta fosforilação de survivina foi mostrado para perturbar a interface de ligação para XIAP, levando à degradação de XIAP. Nossos dados, bem como relatórios anteriores indicam que a resposta de ativação PKA é um evento precoce após o tratamento TGF e alcança níveis máximos dentro de 1 h de tratamento TGF. Nossa hipótese é que TGF faz com que um desligamento da sobrevivência celular aberrante, estimulando PKA perturbação mediada do complexo XIAP /survivin. células FET foram tratados com TGF para os tempos especificados, seguido por determinação do XIAP e survivin (Figura 2A e S5). tratamento TGF reprimidos tanto XIAP e survivin nos horários especificados. Como fosforilação survivin já foi mostrado para ser ligado a activação de PKA, focamos a nossa atenção sobre a regulação do XIAP. Degradação de XIAP foi bloqueada por pré-tratamento de H89 antes da exposição TGFp para os tempos indicados (Figura 2B). Para examinar a especificidade da resposta, comparou-se o efeito de TGF-p em células FET PKACatα kD e células parentais FET (Figura 2C). TGFp tratamento não teve efeito sobre níveis de proteína XIAP em células FET PKACatα KD, indicando a dependência da subunidade catalítica de PKA em TGFp mediada perda de proteína XIAP. Para confirmar a especificidade de TGFp /PKA nesta resposta, as células FET Smad3 KD foram tratadas com TGFp para os tempos indicados e a expressão da proteína XIAP foi determinada (Figura 2D). Consistente com a dependência Smad3 da ativação PKA TGF mediada, estável knockdown shRNA de Smad3 revogada XIAP downregulation. Um inibidor de proteossoma (MG132) foi usada para determinar se a perda de XIAP era dependente de degradação proteossómica (Figura 2E). Observou-se que o tratamento prévio de células com MG132 FET (15 uM) durante 1 h antes do tratamento TGF-p aboliu completamente a degradação de XIAP, indicando que XIAP é degradada durante o proteassoma. PKA é um regulador importante da actividade de PKA proteossómica e tem sido demonstrado que a co-purificar com o proteassoma [19], [20]. Nossa hipótese é que o TGF-p /PKA regulação mediada da atividade proteossómica pode fornecer outra camada de controle da expressão IAP (além da PKA fosforilação induzida da survivina em Ser

20). Relatórios anteriores indicam que a PKA fosforila o Rpt6 ATPase, que se desdobra e transporta substratos para o proteassoma e esta fosforilação aumenta as actividades proteossomo quimotripsina do proteassoma [21]. Para este fim, verificou-se se a activação de PKA TGFp mediada é capaz de aumentar a actividade do tipo quimotripsina proteossómica utilizando um ensaio de actividade da proteossoma. TGFp tratamento de células estimuladas FET selectivamente a actividade de tipo quimotripsina do proteassoma dentro de 1 h (Figura 2F). H89 pré-tratamento antes da exposição TGFp revogada completamente o nível basal da actividade do tipo quimotripsina proteossómica e completamente eliminados os efeitos estimuladores de TGFp no proteassoma.

TGFp (5 ng /ml) de tratamento para os tempos indicados na regula negativamente XIAP células FET (a) e este efeito é mediado pela PKA como pré-tratamento com o inibidor de PKA H89 antes da exposição TGFp ab-roga a perda de XIAP (B). Estável shRNA knockdown da subunidade catalítica de PKA em células FET leva a ab-rogação da perda de XIAP (C). Estável knockdown shRNA de Smad3 leva a revogação da perda de XIAP em células FET (D). TGFp (5 ng /ml) mediada XIAP regulação negativa é um evento de proteossoma. O pré-tratamento com inibidor de proteossoma MG132 (15 | iM) a perda de XIAP revogada por TGF-p (E). TGFp activação mediada por PKA conduz à activação da actividade de quimotripsina dentro do proteassoma e este efeito é anulada pela H89 (F). Os resultados são expressos como média ± S.E.M (n = 3). Actina foi utilizado como controlo de carga para Western blots. Todas as experiências foram repetidas três vezes, independentemente.

Colectivamente, estes dados levam a hipótese de que a sinalização de TGF-p /PKA regula a expressão de XIAP em vários níveis com a activação de PKA conduz a fosforilação de componentes principais que proteossomo promover a degradação proteossómica de XIAP.

AKAP regula TGF /PKA mediada downregulation XIAP

Há uma abundância de a-quinase ancorar proteínas (AKAPs) que compartimentalizar a PKA e outras enzimas para a vizinhança da organelas celulares específicas para a realização função da enzima. Nossa hipótese é que AKAPs são um componente crítico no TGF /PKA XIAP mediada downregulation. Está bem documentado que a localização subcelular de subunidades reguladoras da PKA (PKARI e /ou PKARII) é mediada através de interacções com AKAPs [22]. AKAP inibidor Ht31, um péptido sintético de ancoragem da tiróide tem sido mostrado como sendo um inibidor competitivo da interacção muito potente PKARII /AKAP, impedindo assim a ancoragem de PKA [23]. Para assegurar que o Ht31 foi especificamente dirigidas interacções AKAP-PKA, foram realizados ensaios de actividade de PKA em células FET para determinar a extensão de activação de PKA na sequência de pré-tratamento com Ht31 (25 uM) antes da exposição TGFp (Figura 3A). De acordo com estudos anteriores [15], Ht31 foi capaz de bloquear a activação de PKA TGFp mediada. Desde AKAP-PKA interacção parece ser um requisito para a activação de PKA TGFp mediada, nós concluímos que estas interacções também pode ser necessária para os eventos de sinalização a jusante que conduzem a perda de XIAP, (Figura 3B). A adição de Ht31inhibitor durante 1 h antes do tratamento para TGFp vezes especificado revogada completamente a perda de XIAP.

AKAP inibidor Ht31 (25 uM) de tratamento para a exposição de 1 h antes de TGFp ab-roga a actividade TGFp mediada PKA (A) e TGFp perda de XIAP mediada (B). AKAP149 siRNA knockdown foi feita em células de FET (C). Knockdown de AKAP149 leva a revogação da atividade TGF mediada PKA (D) e XIAP downregulation (E). Os resultados são expressos como média ± S.E.M (n = 3). Actina foi utilizado como controlo de carga para Western blots. Todos os experimentos foram repetidos três vezes de forma independente.

Uma vez que a família AKAP inclui mais de 50 membros [24], o desafio era identificar um AKAP individual que estava respondendo aos efeitos TGF /PKA em XIAP . Após o rastreio inicial quanto à presença de diferentes membros da família AKAP em células FET, encontramos a expressão da proteína AKAP149 nestas células de cancro do cólon. AKAP149 (também denominado D-AKAP1 e AKAP121 no rato) tem sido identificada como uma proteína de membrana da mitocôndria [25]. Tem sido relatado que AKAP121 mitocondrial está envolvida no direccionamento de cAMP activada PKA para a membrana mitocondrial externa (OMM) e desempenha um papel na biogénese mitocondrial e sobrevivência [26]. Trabalhamos com a hipótese com base no entendimento de que o mitocondrial XIAP e survivin mudança para o citoplasma na sequência de uma resposta ao estresse que AKAP149 pode estar regulando a degradação XIAP TGF /PKA mediada. Expressão de uma AKAP149 pequeno ARN interferente (siRNA) impediu a activação de PKA TGFp mediada (Figura 3C-D). Além disso, observou-se que o TGF-p não foi capaz de regular negativamente a proteína XIAP em células knockdown AKAP149 siRNA em comparação com células de controlo FET parentais (Figura 3E). Esta função pró-apoptótica de AKAP149 está em contraste com a função conhecida de AKAP121 mitocondrial (ou o seu homólogo humano AKAP149) na promoção da sobrevivência.

próxima questionado se o efeito de AKAP149 era selectiva neste efeito de TGFp /PKA . Enquanto AKAP-PKA interação é um fenômeno global, validação de AKAP149 como seletivamente regulação da sinalização TGF /PKA seria um romance extensão da nossa compreensão da regulação baixa XIAP TGF /PKA mediada. AKAP220 foi mostrado para regular a actividade da proteína fosfatase 1 (PP1), através da coordenação da localização da PKA e subunidade catalítica PP1 [27]. Nós silenciados a expressão de AKAP220 em células FET com AKAP220 siRNA. Estas células transfectadas quando tratadas com TGFp não teve qualquer efeito em qualquer indução da actividade de PKA ou XIAP regulação negativa (dados não mostrados). Tomados em conjunto, AKAP andaimes desempenha um papel essencial na via de TGFp /PKA mediada XIAP downregulation com mitocondrial AKAP149 localizada ser necessário para a resposta mediada por TGF /PKA.

Envolvimento de PP2A em TGFp /PKA mediada XIAP downregulation

tem sido observado que a activação de PKA conduz à inactivação de AKT através desfosforilação pela proteína fosfatase 2A (PP2A) [28]. Isto levou à hipótese de que o TGFp activação mediada por PKA é responsável pela repressão da activação AKT que anteriormente relatado como uma consequência de sinalização TGF [13]. Consequentemente, determinou-se a actividade de PP2A em células FET (Figura 4A). tratamento TGF para horários específicos aumentou significativamente a atividade PP2A. PP2A inibidor selectivo ácido ocadaico (OA, 50 nM) era capaz de suprimir completamente a activação de PP2A quando tratada isoladamente ou pré-tratadas antes da exposição TGFp. Em seguida, testou-se o papel de TGFp na mediação AKT inactivação e perda de XIAP, (Figura 4B). Observou-se que o TGF-p mediada desfosforilação de AKT é dependente PP2A como reflectido pela capacidade de OA para bloquear a desfosforilação mediada por TGF-p de AKT. XIAP downregulation também foi abolida por tratamento OA. Embora a PP2A é um supressor de tumor envolvido no controlo de vários percursos de sobrevivência celular [29], documentação de um papel em subverter a sobrevivência das células de sinalização dentro da via de TGFp é uma extensão nova de função PP2A.

FET células foram tratadas com TGFp (5 ng /ml) para a actividade de PP2A e tempo indicado foi determinada usando o protocolo de ensaio de actividade de PP2A, tal como descrito em materiais e métodos (a). inibidor PP2A ácido ocadaico (OA, 50 nM) foi utilizado para inibir a PP2A. O pré-tratamento com OA antes de o TGF-p (5 ng /ml) Tratamento revogada TGFp perda de XIAP e mediada por desfosforilação de AKT (B). Estável knockdown shRNA de α-subunidade catalítica de PP2A foram feitas em células FET (C). Knockdown de α-subunidade catalítica de PP2A levou a revogação de TGF-p (5 ng /ml) mediada downregulation XIAP, sem afectar a actividade de PKA (D-E). estudos de imunoprecipitação XIAP em células FET tratados com TGF-p (5 ng /ml) ou pré-tratados com H89 ou Ht31 durante 1 h antes da exposição ao TGFp. XIAP dissocia pAKT após o tratamento TGF para o tempo indicado (F). A inibição da atividade PKA por H89 ou AKAP-PKA interação com Ht31 anula a dissociação XIAP-pAKT TGF mediada.

Para validar ainda mais o papel da PP2A na sinalização TGF /PKA, geramos estável catalítica shRNA PP2A subunidade knockdown em células FET designado FET PP2A gato KD (Figura 4C). tratamento de células de TGFp FET PP2A gato KD mostrou activação de PKA indicando que a activação de PKA é a montante da activação de PP2A (Figura 4D). No entanto, estável shRNA knockdown da subunidade catalítica de PP2A completamente abolida TGFp mediada inibição de XIAP e mostrou a fosforilação sustentada de AKT, bem como (Figura 4E). células FET PKACatα KD tratadas com TGFp mostraram também uma fosforilação sustentada de AKT (dados não mostrados).

enquanto que a inibição da activação AKT teriam potencial para muitos efeitos sobre a sobrevivência celular, um efeito que é de particular interesse como relacionada a função de TGF /PKA está no contexto que ele atinge estabilidade XIAP. Um estudo anterior relatou que XIAP é fosforilada por AKT em Sor

87 o que leva a um aumento da estabilização de XIAP e diminuiu a apoptose de células de cancro do ovário, em resposta à cisplatina [30]. Nós fundamentado que a inibição da actividade de PP2A AKT pode representar um mecanismo adicional para o rompimento da estabilização do XIAP que é direcionado pela via TGF /PKA através do aumento da atividade PP2A. Para este fim, as células foram tratadas com FET TGFp ou pré-tratados com inibidores da via de diferentes TGF-p /PKA antes da exposição para TGFp tempos especificados e imunoprecipitadas para XIAP e imunotransferidas para possíveis proteínas ligadas para XIAP. Encontramos uma associação de XIAP com pAKT (Figura 4F). A seguir ao tratamento TGFp, houve uma dissociação significativa do complexo de XIAP-pAKT. No entanto, o pré-tratamento com H89 ou exposição Ht31 antes de TGFp completamente revogada dissociação XIAP-pAKT das duas proteínas que indicam que o TGF-p /PKA sinalização inactivação mediada por AKT desestabiliza XIAP, levando a sua degradação proteossoma. Portanto, usando estudos de inibidor e knockdown estáveis, destacamos a constatação de romance que a sinalização TGF /PKA medeia a perda de proteína XIAP por uma repressão dependente PKA-PP2A de activação AKT levando à perda de XIAP.

reconstituição receptor TGF leva a diminuiu a colonização metastática: Impacto sobre TGF /PKA sinalização

Temos desenvolvido tecnologia para a implantação do cólon ortotópico de linhas cancerígenas do cólon humano em ratinhos atímicos que permite a análise quantitativa reprodutível de metástase para o fígado e os pulmões [31], [ ,,,0],32], [33]. O padrão metastático exibido neste sistema modelo reflete a natureza da propagação metastática em pacientes humanos. Altamente células cancerosas GEO cólon metastático foram usadas para entender melhor o impacto do TGF /PKA sinalização em metástase. As células GEO foram atenuados TGFβRI expressão e, assim, atenuado supressor de tumor TGFp sinalizando assim [8]. Temos utilizado o implante ortotópico colônica de via subcutânea crescido xenotransplantes para caracterizar fatores que influenciam a extensão da metástase para o fígado e os pulmões sem afetar invasão no local do tumor primário [31], [33]. As células GEO foram encontrados para ser altamente metastático neste modelo ortotópico como reflectido pela colonização metastático em 53% dos animais implantados (Tabela 1). Resgate de atenuação do receptor em células GEO por transfecção de um vector de expressão TGFβRI (designado GEORI) resultou na redução da incidência metastática a cerca de 20% dos animais implantados sem afectar a invasão no local primário como ambos os animais GEO e GEORI transfectadas deu origem a um tumor primário invasivo em 100% dos animais implantados. GEO animais transplantados desenvolveram metástases do fígado em comparação com robusta GEORI (Figura 5A). Hematoxilina e Eosina (H E) de coloração que mostra metástases do fígado em células GEO é mostrado na Figura 5B. A caracterização de tumores GEO mostraram um aumento da sobrevivência de células de sinalização tal como reflectido pelas taxas de TUNEL inferior relativamente tumores GEORI indicando uma repressão de colonização metastático por TGFp sinalização supressor de tumores está associado com a repressão da sobrevivência de sinalização celular in vivo (Figura 5C-D). Além disso, não se observou nenhuma mudança na coloração de Ki67 IHC entre GEO altamente metastático e tumores primários GEORI fracamente metastáticas indicando que não houve diferença na taxa de proliferação in vivo entre GEO e tumores GEORI (Figura 5E-F). As in vivo resultados indicam que a restauração do receptor TGF suprime a competência metastático em células GEO ao nível da colonização metastática em oposição a prevenção de invasão.

Comparação das imagens GFP de progressão metastática no fígado em camundongos GEO e GEORI ( UMA). GEO Colon cancro do fígado H E coloração mostrando metástase hepática (B). Comparação de secções de tumor primário e de GEO GEORI ratos por ensaio de TUNEL como mencionado em Materiais e Métodos para determinar as suas taxas de apoptose (C). As taxas apoptóticos foram quantificados (D). Comparação de secções de tumor primário e de GEO ratinhos GEORI por Ki-67 de coloração tal como mencionado em Materiais e Métodos para determinar as suas taxas de proliferação (E). As taxas de proliferação foram quantificados (F). reconstituição do receptor de TGFp conduz a uma alteração na actividade de PKA. Comparação da actividade de PKA, em células altamente metastáticas GEO versus células metastáticas GEORI mal (G) e células altamente metastáticas CBS em células vs. CBSRII fracamente metastáticas (H). Comparação de TGF-p (5 ng /mL) entre a exposição e células GEO GEORI (I) e CBS e células CBSRII (J). PKA inibidor H89 revogada perda de XIAP TGF mediada em células GEORI e CBSRII (K).

A chave para capitalizar sobre a repressão de metástase pela sinalização TGF é o esclarecimento do mecanismo molecular pelo qual metástase é inibida. Com base na diminuição da incidência metastática com a reconstituição receptor TGF levando a resgate de sinalização TGF, a hipótese de que o TGF-p /PKA mediada XIAP downregulation requer um mecanismo de TGF sinalização intacta que se perde nas células GEO altamente metastáticas. No entanto, salvamento de TGFp por reconstituição de sinalização do receptor em células GEORI levando a uma diminuição da incidência metastática deve aumentar TGFp /PKA sinalização e os seus efeitos a jusante sobre XIAP. As células GEO sinalização com TGFp atenuada não tinha a activação de PKA com exposição TGFp (Figura 5G). No entanto, as células GEORI com TGFp sinalização funcional devido a reconstituição do receptor tinha um robusto aumento na activação de PKA por TGF-p, que foi cerca de 4 vezes mais elevada do que o controlo. Uma segunda linha de células do carcinoma do cólon (células CBS) com TGFβRII atenuada sinalização [34] também mostrou metástase reduzida depois de deficiência do receptor de salvamento (dados não mostrados). Uma resposta similar em actividade de PKA foi observada em células altamente metastáticas CBS em comparação com as células metastáticas CBSRII mal após o tratamento TGF-p in vitro (Figura 5H).

Seguindo esta observação, a hipótese de que o GEO altamente metastática e as células CBS seria resistente à sinalização de TGF-p /PKA mediada perda de proteína XIAP. Nós fundamentado que a incapacidade de TGF sinalização para induzir a ativação de PKA nestas células devido à inactivação do receptor também prevenir os seus efeitos a jusante sobre XIAP tornando assim estas células mais metastático através do aumento da sinalização pró-sobrevivência. Enquanto GEO e CBS ambos não apresentaram resposta ao tratamento TGF em momentos determinados (Figura 5I-J), as células GEORI e CBSRII mostrou XIAP downregulation para tratamentos semelhantes (Figura 5I-J).