Abstract
177Lu-DOTA-HH1 (
177Lu-HH1) é um romance radioimunoconjugado anti-CD37 desenvolvido para tratar linfoma não-Hodgkin. Camundongos com xenoenxertos Ramos subcutâneos foram tratados com diferentes atividades de
177Lu-HH1,
177Lu-DOTA-rituximab (
177Lu-rituximab) e não específica
177Lu-DOTA-IgG
1 (
177Lu-IgG
1) e do efeito terapêutico e toxicidade do tratamento foram monitorizados. retardamento do crescimento tumoral e ao aumento da sobrevivência de ratinhos foram observados em ratinhos tratados com 530 MBq /kg
177Lu-HH1, em comparação com ratinhos tratados com actividades similares de
177Lu-rituximab ou não-específica
177Lu-IgG1 , 0,9% de NaCl ou não marcado HH1. Todos os camundongos injetados com 530 MBq /kg de
177Lu-HH1 tolerado bem o tratamento. Em contraste, 6 dos 10 ratinhos tratados com 530 MBq /kg
177Lu-rituximab experiente grave toxicidade de radiação. A retenção de
177Lu-rituximab em órgãos do sistema mononuclear fagocitário foi mais longo do que para
177Lu-HH1, o que explica a maior toxicidade observada nos ratos tratados com
177Lu-rituximab.
In vitro
estudos de internalização mostrou que
177Lu-HH1 internaliza mais rápido e numa extensão maior do que
177Lu-rituximab, que pode ser a razão para o melhor efeito terapêutico de
177Lu-HH1.
Citation: Repetto-Llamazares AHV, Larsen RH, Patzke S, Fleten KG, Didierlaurent D, Pichard A, et al. (2015) Targeted Cancer Therapy com um Novel Anti-CD37 Beta-Particle Emitting radioimunoconjugado para Tratamento de Linfoma não-Hodgkin. PLoS ONE 10 (6): e0128816. doi: 10.1371 /journal.pone.0128816
Editor do Academic: Ken Mills, University Belfast da rainha, REINO UNIDO
Recebido: 09 de fevereiro de 2015; Aceito: 30 de abril de 2015; Publicação: 11 de junho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Repetto-Llamazares et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pelo Conselho de Investigação da Noruega (https://www.forskningsradet.no) números de subvenção 213633 e 219454 e pelo Nordic Nanovector ASA ( https://www.nordicnanovector.com). Os co-autores Ada H. V. Repetto-Llamazares e Jostein Dahle são empregados por Nordic Nanovector ASA. Nordic Nanovector ASA forneceu apoio sob a forma de salários para os autores AHVR-L e JD, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Co-autor Roy H. Larsen é filiado ao Sciencons AS. Sciencons AS é acionista da Nordic Nanovector ASA. Sciencons AS não fornecer apoio sob a forma de salário por autor RHL, e não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘
Conflito de interesses:. Este estudo foi financiado em parte pela Nordic Nanovector ASA (https://www.nordicnanovector.com/). Os autores Jostein Dahle e Ada H. V. Repetto-Llamazares são empregados por Nordic Nanovector ASA, e Roy H. Larsen é um membro do Conselho de Nordic Nanovector ASA e Sciencons AS e três deles são acionistas da Nordic Nanovector ASA. 177Lu-HH1 é o principal produto da Nordic Nanovector ASA. Não há patentes, novos produtos em desenvolvimento ou produtos mais comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais
Introdução
Apesar da promessa da terapia utilizando o anticorpo monoclonal nua (mAb) rituximab, um número substancial dos pacientes tratados com doses convencionais de rituximab sozinho ou em combinação com a quimioterapia não obter uma resposta completa e eventualmente pode recaída [1]. Os tratamentos alternativos têm sido mAbs anti-CD20 conjugado com
131I (tositumomab) ou
90Y (ibritumomab tiuxetan-). O tratamento com atividades convencionais dos mAbs radiomarcados produziu maior resposta global e taxas de remissão completa em comparação com mAbs nuas [2-5]. Considerando-se que a radioimunoterapia (RIT) é usado principalmente depois que os pacientes foram tratados com várias rodadas de rituximab e que os dois radioimunoconjugados aprovados (RICS) para uso clínico,
90Y-ibritumomab-tiuxetan (Zevalin) e
131I-tositumomab (Bexxar), o alvo do mesmo antigénio CD20 como rituximab, é desejável conceber um novo RIC que terá como alvo um antigénio diferente do que o CD20. O antigénio CD37 é expresso abundantemente em células B, mas está ausente nas células de plasma e células estaminais normais [6-8]. Portanto, CD37 parece ser um alvo terapêutico apropriado em pacientes com malignidades derivadas de células B recidivado, tais como LLC das células-B, leucemia de células pilosas (HCL) e NHL de células B.
RIT com CD37 como alvo foi previamente explorado usando um
anticorpo monoclonal murino 131I-marcado (MB-1) ambos em um modelo de rato e em pacientes [9-14]. Um maior grau de internalização e degradação de
131I marcado RIC foi encontrado para CD37 do que para CD20 [14]. Apesar de as respostas promissoras clínicos observados nestes estudos clínicos para o anticorpo anti-CD37, o desenvolvimento da RIT focado no CD20 como o antigénio alvo e não há esforços subsequentes foram feitos para desenvolver RIT com RIC baseados em anti-CD37. Um número limitado de outras imunoterapias base de anticorpos dirigidos-CD37 têm, no entanto, foi avaliada em doentes. A pequena proteína immunopharmaceutical modular Otlertuzumab tem avançado em ensaios clínicos [15] e, recentemente, relatou em fase II dados em combinação com bendamustine [16]. Além disso, o anticorpo manipulado CD37.1-Fc (BI836826) [17], recentemente entrou fase I [18]. Além disso, dois conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) foram desenvolvidos para ligar covalentemente agentes citotóxicos aos anticorpos de direccionamento CD37 para melhorar a sua potência antitumoral: IMGN529 [19] e AGS-67E [20]. ADCs são concebidos para dar a entrega específica de compostos citotóxicos em células que expressam o antigénio alvo, através do ADC de ligação, internalização, e a libertação da carga útil intracelular. Os dados clínicos têm demonstrado o potencial de ADCs para a terapia do cancro de tumores positivos para CD30 e HER2 [21,22]. Todas estas drogas CD37 visando tinha mostrado resultados promissores, o que confirma ainda mais CD37 como um alvo para o tratamento de LNH e na LLC. Uma vantagem com o RIT em comparação com os mAbs nus e ADCs é a gama da radiação emitida, que dá um efeito de fogo cruzado de modo que as células tumorais com menos antigénios ou células tumorais não acessíveis também ser atingido pela radiação citotóxica. Ele continua a ser visto se o mecanismo de ação da RIT é melhor do que a de ADCs.
A potência da RIT contra o CD37 antigénio internalização pode ter sido subestimado pelo uso do radionuclídeo
131I, que tende a ser clivado a partir do anticorpo e excretada das células após a internalização e catabolismo quando utilizado como “não-residualizing” marcador radioactivo incorporado-tirosina, tal como foi feito no início dos estudos com
131I-MB-1 [23]. “Residualizing” radiomarcadores, por outro lado, estão presos nas células após o metabolismo do RIC. Em um esforço para re-avaliar e melhorar RIT contra CD37, temos desenvolvido um novo RIC (Betalutin) com base na “residualizing” radiomarcador
177Lu ligado ao anti-CD37 anticorpo HH1 [24]. O tratamento com 100 MBq /kg
177Lu-HH1 resultou num aumento de três vezes na sobrevivência de ratinhos IDCG que foram injectados por via intravenosa com células de linfoma de Daudi em comparação com ratos de controlo não tratados [7]. ratinhos SCID não é capaz de reparar ADN quebras de cadeia dupla [25], o que limita a quantidade de radioactividade que pode ser administrada, enquanto que os ratinhos nus pode tolerar doses mais elevadas de radiação. Um xenoenxerto de tumor subcutâneo em ratinhos nus é um modelo mais relevante para o tipo de doença volumosos que é frequentemente encontrada em pacientes com LNH que o modelo intravenosa em ratinhos SCID. Portanto, o efeito terapêutico e toxicidade de
177Lu-HH1 foi avaliada em ratinhos nu com subcutânea Ramos xenoenxertos no presente trabalho.
Materiais e Métodos
As células tumorais
células de linfoma de Ramos (LGC Standards, Borås, Suécia) que expressa os receptores de CD20 e CD37 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com Glutamax (Gibco, Paisley, Reino Unido), 10%, FCS inactivado pelo calor (Gibco) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco) numa atmosfera húmida com 95% de ar /5% de CO
2.
a marcação radioactiva de anticorpos
Os anticorpos HH1 (anti-CD37, Nordic Nanovector ASA, Oslo, Noruega ), Rituximab (anti-CD20, Roche, Pharma Schweiz, Basileia, Suíça) e o anticorpo de controlo de isotipo não específico de murino (IgG
1) (MAB002, R D Systems Inc., Minneapolis, EUA) foram marcadas com o quelante de p-SCN-DOTA-Bn (DOTA, Macrocyclics, TX, EUA) e, subsequentemente, rotulados com
177Lu (ITG, Garching, Alemanha), como descrito anteriormente [26]. Marcando com
125I (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemanha) foi realizada usando tubos de Iodogen (Pierce, Rockford, IL, EUA) como descrito anteriormente [23].
A imunorreactividade (IRF) de todos os tumores RIC específicos foi verificada utilizando um método de Lindmo modificado [27] com uma concentração celular de 75 milhões de células /ml. O IRF de todos os RIC específicos foi entre 57% e 76%.
Número de receptores de superfície celular
análises Scatchard foram realizadas utilizando
177Lu-HH1 ou
125I-rituximab. Uma concentração de 10 milhões de células /ml de células de linfoma de Ramos foram incubadas durante 1 hora com quantidades de radioimunoconjugados crescente (entre 0 e 6,25 nM). As células previamente bloqueados com anticorpo não marcado foram usadas para explicar a ligação não específica. Cada amostra foi medida em duplicado e os resultados foram ponderados. Após a incubação com o RIC, a actividade em cada amostra foi medida usando um contador gama (Cobra gama; Packard Instrument Co, Meriden, CT, EUA) e as células foram lavadas duas vezes com DPBS (Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementada com 0,5% em peso Albumina de soro bovino (BDH Prolabo, VWR, Lutterworth, Leicestershire, Reino Unido), após o que a actividade ligada às células foi contada num contador gama. A dissociação constante de equilíbrio (K
d) e densidade média máxima de antigénios (B
max) foi calculada a partir do ajuste dos dados experimentais. Três experimentos foram realizados utilizando
177Lu-HH1 e 2 experimentos usando
125I-rituximab. Os resultados de todos os experimentos para cada RIC foram média para obter um valor médio de K
d e B
max para cada RIC.
experimentos Internalização
HH1-DOTA foi rotulado com Alexa Fluor 488 e rituximab com Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, Invitrogen, Paisley, Reino Unido). Um milhão de Ramos células por ml em meio de crescimento foram incubadas com 10 ug /ml de HH1 ou 20 ug /mL de rituximab, tanto para 19 horas a 37 ° C ou 1 hora a cerca de 4 ° C. Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionado às células a uma concentração de 2 ug /mL uma hora antes de imagem. As células foram fotografadas com um sistema de microscópio AxioImager Z1 ApoTome (Carl Zeiss, Jena, DE) usando um PlanApo 63 × lente /N.A.1.4 DIC, filtros ópticos adequados, uma câmera AxioCam MRM e Axiovision 4.8.2 (Carl Zeiss). Z-secções foram obtidos para cada 1 uM em todo o volume da célula inteira. As imagens são apresentadas como sobreposições de imagens de fluorescência de imagem DIC z-secção central e. 20 a 40 células foram digitalizadas para cada tratamento.
Animais e xenotransplantes
Institucionalmente criados fêmea atímicos fox1 nu
nu foram utilizados ratos. Idade e peso dos ratinhos estão apresentados na Tabela 1. Os animais foram mantidos sob condições isentas de agentes patogénicos, com um ciclo de iluminação de 12 horas a uma temperatura ambiente de 23 ° C e humidade relativa do ar de 55% em gaiolas de plástico. Alimentos e água foram fornecidos
ad libitum
e roupa de cama foi alterado regularmente. Os ratinhos foram anestesiados com injecções subcutâneas de 70-100 ul Tiletamin-zolazepam mistura (Virbac, Carros Cedex, França) diluída 1: 5 com água estéril antes da implantação de pedaços de tecido de xenoenxerto Ramos linfoma de ratinhos transportadora, (diâmetro 1,5-2 mm) nos flancos. Todos os procedimentos e experimentos envolvendo animais neste estudo foram aprovados pela autoridade de Pesquisa Animal norueguês (NARA). O Departamento de Medicina Comparativa veterinário institucional estabeleceu as regras para a alimentação, acompanhamento, manuseio e sacrifício de animais em conformidade com as normas estabelecidas pelo Ministério da Agricultura da Noruega e “A Convenção Europeia para a Protecção dos Animais Vertebrados utilizados para fins experimentais e outros fins científicos “. O veterinário institucional delegou autoridade da Autoridade de Pesquisa Animal norueguês (NARA). As instalações de animais de laboratório estão sujeitos a um programa de rotina de monitoramento de saúde e testado para organismos infecciosos de acordo com uma modificação da Federação das Associações de Ciência Animal Laboratório Europeu (FELASA) recomendações.
Terapia e experimentos de toxicidade
Os animais portadores de tumores de crescimento com diâmetros entre 4 e 12 mm foram randomizados em gaiolas de acordo com grupo de tratamento e foram administrados por via intravenosa com 100 ul de soluções de injeção ajustados para peso individual mouse. Dois experimentos preliminares foram realizados com injeção de atividades entre 50 e 1000 MBq /kg
177Lu-HH1 (S1 Arquivo). Estas experiências foram usadas para decidir os parâmetros experimentais escolhidas para os dois experimentos apresentados neste trabalho (Tabela 1) que incluiu injetados atividades de 410 e 530 MBq /kg
177Lu-HH1, 300 e 530 MBq /kg
177Lu -rituximab, 530 MBq /kg
177Lu-IgG
1 e 15 ug /kg HH1 e 0,9% de NaCl como grupos de controlo.
Os ratinhos foram pesados e observados clinicamente duas a três vezes por semana por até 109 dias. Além disso, os ratinhos foram monitorizados diariamente para qualquer sinal de doença ou desconforto. O nível de actividade, a condição da pele (eczema, hemorragias, etc.) e a saúde geral dos ratinhos foram observados diariamente. Os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical, sob anestesia de gás sevoflurano se qualquer um dos seguintes pontos finais humanas foram alcançados: diâmetro do tumor excedeu 20 mm, peso corporal, diminuiu em 20% a partir de mais alto peso corporal ou animais em contrário apresentaram sintomas de doença grave e desconforto
o crescimento do tumor foi monitorado até a primeira medição do volume tumoral superior a 2000 mm
3 em cada rato (tumores maiores geralmente se desenvolvem feridas necróticas). A remissão completa foi definida como ausência de tumor observável. Ratos chegar a esta fase foram considerados como respondedores a longo prazo.
Hematologia.
As amostras de sangue foram tomadas antes da injeção, a morte e a cada 4 a 7 semanas após a administração do tratamento. A amostragem de sangue foi realizada como descrito anteriormente [26]. radiação toxicidade foi definida como contagem de células brancas do sangue abaixo de 1 × 10
9 1 /L, contagem de plaquetas abaixo de 400 × 10
9 1 /L, súbita perda de peso em torno de 5% no lapso de 2 a 3 dias – acompanhado de um nível de atividade baixa, e um estado geral de doença. As comparações entre os valores médios dos diferentes grupos de tratamento foram feitas usando t-testes com um nível de significância de 0,05.
Um rato tratado com 530 MBq /kg
177Lu-HH1 foi sacrificado 11 dias após a injeção de tratamento, a fim para obter dados de hematologia e histologia neste momento em particular. Além disso, para obter mais dados hematológicos 3 ratos com diâmetros de tumor entre 12 e 15 mm (800 e 1300 mm3) foram também incluídos no experimento 2.
Histopatologia.
Os camundongos foram necropsiados e coração, pulmões, fígado, estômago, baço, intestino delgado e grosso, rins, femur, músculo, crânio, cérebro, tumor, pele, ovários e nódulos linfáticos foram fixados e enviados para Accelera, Milano, Itália para fundição, corte, coloração e exame patológico .
experimentos de biodistribuição
Os conjugados foram administrados por injecção na veia da cauda de 100 solução ul (0,2 e 0,9 MBq) para cada animal. Entre 4 e 7 os ratinhos foram sacrificados por deslocamento do pescoço sob anestesia de gás do sevoflurano em cada ponto de tempo após a punção cardíaca para amostragem de sangue. Os tamanhos dos tumores em injeção de conjugados variaram entre 120 e 1800 milímetros
3. Os estudos foram conduzidos tal como descrito na referência [28]. As comparações entre os valores médios foram feitas usando t-testes com um nível de significância de 0,05.
Um piloto
In vivo
SPECT /CT foi realizada em 2 de camundongos com Ramos xenoenxertos subcutâneos com diâmetros de cerca de 12 mm no seu flanco direito em uma NanoSPECT /CT (Bioscan Inc., Washington, DC, EUA). aquisições SPECT /CT foram realizadas aos 3, 24 e 48 horas após a injeção de tratamento no rato 1 e após 24 horas de rato 2. Actividades medidos pelo SPECT /CT foram comparados com medições ex-vivo feito em 48 horas após a administração do tratamento. Os ratinhos foram injectados i.v. com 150 mL de 10 MBq de
177Lu-HH1 e foram anestesiados com 2% de isoflurano para aquisição de imagem.
Dosimetria
A taxa de dose e as doses absorvidas de
177Lu-HH1 e
177Lu-rituximab em ratinhos foram calculados tal como descrito na referência [28] para uma injecção de 1 MBq /rato (40 MBq /kg) e assumindo que a energia das partículas beta-significa, Auger- e de conversão de electrões ser 0.1473 MeV [29]. A fracção de auto-radiação para tumor foi estimado em 0,944 (200 mg tumoral [30]).
A análise estatística
A sobrevivência dos diferentes grupos de tratamento foi comparada por análise de sobrevivência de Kaplan-Meyer usando SigmaPlot para Windows versão 12.0 (Systat Software Inc., Califórnia, EUA), utilizando o tempo para chegar a um volume de tumor maior do que 4 vezes o volume do tumor inicial ou eutanásia devido a sintomas de toxicidade de radiação como os pontos finais. dados de hematologia e de biodistribuição foram comparados usando ANOVA one-way. As comparações múltiplas foram realizadas utilizando o método de Holm Sidak. Um nível de significância de p 0,05 foi utilizado em todos os testes.
Resultados
experimentos Terapia e toxicidade
O crescimento do tumor e sobrevivência.
Houve um atraso do crescimento tumoral marcado em camundongos tratou-se com 530 MBq /kg
177Lu-HH1, quando comparado com os ratinhos tratados com ambos os
177Lu-IgG de NaCl
1 ou 0,9% (Figura 1A). O crescimento do tumor também foi retardada em alguns dos ratinhos tratados com 530 MBq /kg
177Lu-rituximab, mas este tratamento provou ser tóxico: 60% dos ratos tiveram de ser sacrificados devido a sintomas de toxicidade de radiação grave entre 11 e 18 dias após a injecção de tratamento (Tabela 2). Nenhum dos ratinhos foram sacrificados devido a sintomas de toxicidade de radiação em qualquer um dos outros grupos de tratamento. O crescimento dos tumores nos ratinhos de controlo foram tratados com NaCl a 0,9% ou 15 ug /kg nu HH1 era não-homogénea, com 30% e 10% de remissão completa, respectivamente. Por outro lado, os tumores nos ratos tratados com 530 MBq /kg
177Lu-IgG
1 cresceu de forma homogénea e não mostrou quaisquer regressões naturais. O número de respondedores a longo prazo foi mais elevada em ratinhos tratados com 530 MBq /kg
177Lu-HH1 (Fig 1B). Além disso, o tratamento com 530 MBq /kg
177Lu-HH1 alargado significativamente a sobrevivência dos ratos quando comparada com
177Lu-IgG
1, 0,9% de NaCl e HH1 (p 0,05) (Fig 1C, Tabela 2 ). A sobrevivência de ratinhos tratados com
177Lu-IgG
1 foi significativamente menor do que para os tratados com NaCl a 0,9% (p 0,05), o que era devido à homogeneidade do crescimento e a falta de regressão do tumor observado em ratinhos tratados com
177Lu-IgG
1, o que pode estar relacionado à radiação induzida imunossupressão. Foi previamente mostrado que o crescimento de xenoenxertos em ratinhos pode ser aumentado por irradiação de corpo inteiro (WBI) [31-34] ou outros agentes imunomoduladores [32,35-38]. regressões naturais de xenoenxertos em ratinhos nus em grupos de controlo foram observados anteriormente [33,35], especialmente em ratinhos nus com xenotransplantes Ramos subcutâneos [39,40]. RIT pode ser considerada como um tipo de tratamento WBI, a qual pode, portanto, resultar em melhor aceitação e crescimento de xenoenxertos em murganhos tratados do que nos murganhos de controlo. Assim, a eficácia terapêutica da RIT pode ser subestimada em modelos de rato em que a irradiação total do corpo aumenta o crescimento do tumor, especialmente quando se compara o efeito terapêutico de RIC com agentes que têm baixa toxicidade sistémica, tal como NaCl ou mAbs não marcados. Pode ser mais conveniente, por conseguinte, para comparar o efeito de RIC para dosagens de RIC não-específica, em vez de controlo correspondentes.
(A), o crescimento do tumor individual (n = número de tumores em remissão no final do estudo /número total de tumores iniciais); (B) Percentagem de respondedores de longo prazo (ratos sacrificados devido a sintomas de toxicidade de radiação ou para medições de hematologia antes que um dos seus tumores atingiram um volume de 2000 mm
3 não foram considerados na análise); curva de sobrevivência (C) de Kaplan-Meier. Ponto final: tumor volume de ≥ 4 vezes o volume do tumor inicial. Cruzes representam animais que foram sacrificados antes de chegar a 4 vezes o volume do tumor inicial censurado. N = 9-10. As comparações múltiplas foram realizadas utilizando o método de Holm Sidak. O nível de significância: p 0,05.
Dada a elevada toxicidade observada durante as primeiras duas semanas em alguns dos camundongos tratados com
177Lu-rituximab, mais um experimento foi realizado utilizando atividades mais baixas. Os tratamentos com 410 MBq /kg
177Lu-HH1 e 300 MBq /kg
177Lu-rituximab (aproximadamente 50% da LD50 de cada RIC) resultou num ligeiro atraso no crescimento do tumor (Fig 2A). Ratos tratados com 410 MBq /kg
177Lu-HH1 teve o maior número de respostas de longo prazo, enquanto não houve respondedores a longo prazo em ratos tratados com 300 MBq /kg
177Lu-rituximab devido à falta de inibição do crescimento do tumor ( Fig 2B). A sobrevivência média foi maior nos ratos tratados com 410 MBq /kg
177Lu-HH1 (mais de 15 vezes em comparação com o grupo de controlo), mas a diferença não foi estatisticamente significativa em comparação com os outros grupos de tratamento (p 0,05) (Fig 2C, Tabela 2). A sobrevida média dos ratos tratados com 300 MBq /kg
177Lu-rituximab foi de cerca de 3 vezes mais tempo do que para os ratos no grupo controle, enquanto a média de sobrevivência de ratinhos tratados com 530 MBq /kg
177Lu-rituximab foi semelhante aos ratinhos do grupo de controlo. Mesmo quando a quantidade de respostas de longo prazo foi maior para a actividade injectada mais elevada de
177Lu-rituximab a toxicidade do tratamento teve um forte impacto sobre a média de sobrevivência. A actividade injectada óptima para
177Lu-rituximab pode estar entre 300 e 530 MBq /kg, em que uma quantidade óptima de respondedores a longo prazo poderia ser encontrado sem toxicidade com risco de vida.
(A) tumor individual crescimento (n = número de tumores em remissão no final do estudo /número total de tumores iniciais) (B) Percentagem de respondedores a longo prazo; curva de sobrevivência (C) de Kaplan-Meier. Ponto final: tumor volume de ≥ 4 vezes o volume do tumor inicial. Cruzes representam animais que foram sacrificados antes de chegar a 4 vezes o volume do tumor inicial censurado. N = 5-6. As comparações múltiplas foram realizadas utilizando o método de Holm Sidak. O nível de significância: p 0,05.
O peso corporal.
O peso corporal médio de ratinhos tratados com RIC diminuiu acentuadamente após a injeção. A perda média de peso corporal durou cerca de 7 dias para o tratamento com 530 MBq /kg e cerca de 4 dias para tratamento com 410 e 300 atividades MBq /kg (Fig 3). Depois, o peso corporal médio dos ratinhos tratados começou a aumentar, tendendo para o peso corporal médio dos grupos de controle.
peso corporal médio de ratinhos nus com xenotransplantes Ramos tratada com 530 MBq /kg
177Lu -HH1, 530 MBq /kg
177Lu-rituximab, 530 MBq /kg
177Lu-IgG
1 não-específico de controlo de isotipo, 15 mg /kg HH1, NaCl 0,9%, 410 MBq /kg
177Lu-HH1 e 300 MBq /kg
177Lu-rituximab.
Hematologia.
Os números médios de glóbulos brancos (WBC) e glóbulos vermelhos (RBC) para ratinhos tratados com 530 MBq /kg dos diferentes RIC eram inferiores aos valores para o grupo de controlo de NaCl para 4 e 8 semanas, mas normalizado no final do estudo (Figura 4A). O número médio de plaquetas (PLT) não variou significativamente entre os grupos de tratamento e controle. No entanto, entre 11 e 25 dias após o tratamento com RIC, WBC, RBC e números de PLT foram consideravelmente mais baixos nos ratos tratados com 530 MBq /kg, indicando um nadir cerca de 2 semanas após a administração do tratamento. Não houve animais de controlo sacrificados neste intervalo de tempo, mas os valores de controlo pode ser assumida para ser semelhantes aos medidos na linha de base e cerca de 4 semanas após a injecção do tratamento no grupo de NaCl.
Número de glóbulos brancos (WBC ), células vermelhas do sangue (RBC) e plaquetas (PLT) em ratos com Ramos xenoenxertos tratados com 530 MBq /kg
177Lu-HH1, 530 MBq /kg
177Lu-rituximab, 530 MBq /kg
177Lu -IgG
1 não-específico de controlo de isotipo, 15 mg /kg HH1, NaCl a 0,9% (A) e 410 MBq /kg
177Lu-HH1 e 300 MBq /kg
177Lu-rituximab (B). A área de cada círculo representa o número de ratos utilizados para calcular os valores médios. Círculos com aro escuro e conectado com linhas representam amostras colhidas em pontos fixos de tempo durante o estudo em que todos os ratos vivos foram amostrados. Círculos sem borda escura e não ligados por linhas representam amostras de sangue tomadas antes da eutanásia, onde normalmente um ou dois ratos foram sacrificados. N = 1-10. As barras de erro = erro padrão. *: Significativamente diferente do NaCl (controle) valor de grupo correspondente a 0,9% (One-way ANOVA com o método de Holm Sidak para comparações múltiplas, p 0,05)
O número médio de WBC em camundongos. tratou-se com 410 MBq /kg
177Lu-HH1 e 300 MBq /kg
177Lu-rituximab foi significativamente menor do que para o grupo de controlo 4 semanas após a administração de tratamento, mas os valores normalizados para o fim da experiência (Fig 4B ). O número médio de RBC e PLT foram semelhantes para todos os grupos de tratamento (p 0,05). Não houve mortes associadas a sintomas graves de radiação toxicidade neste experimento. No entanto, contagens de leucócitos em camundongos tratados com
177Lu-rituximab que foram sacrificados aos 13 e 17 dias devido ao diâmetro do tumor maior que 20 mm teve WBC, RBC e os valores PLT consideravelmente mais baixos do que os valores medidos para NaCl em momentos semelhantes.
Histopatologia.
os principais órgãos afetados pelo tratamento com RIC com atividades igual ou superior a 530 MBq /kg eram a medula óssea, gânglios linfáticos, baço e ovários. Os animais tratados com 530 MBq /kg
177Lu-rituximab mostrou alterações graves nos tecidos hemato-linfopoiética, incluindo a diminuição da hematopoiese extra-medular, depleção linfóide no baço e atrofia da medula óssea (Fig 5A), indicando os danos da radiação (Tabela 3). Estas observações foram mais severas quanto mais cedo os ratos tiveram que ser sacrificados após injeção de tratamento. Observações semelhantes foram feitas para os tratamentos com 800 e 1000 MBq /kg de
177Lu-HH1 [26]. A maioria dos camundongos mostram graves sintomas de toxicidade de radiação também apresentaram hemorragias cutâneas (Fig 5B) que começou como uma erupção cutânea, alguns dias antes da eutanásia. As observações histopatológicas estavam de acordo com as medições de hematologia. Para as atividades de 530 MBq /kg e superiores ovários foram afetados [26]. Os ratinhos sacrificados entre 11 a 25 dias após a administração de tratamento, no entanto, não mostraram anormalidades nos ovários, indicando que estas lesões têm mais de 3 semanas a desenvolver
(A) Imagens representativas de:. Uma medula óssea normal de um rato no grupo de NaCl (sacrificados 109 dias após o tratamento), marcada celularidade reduzida em um rato tratado com 530 MBq /kg
177Lu-HH1 sacrificados 11 dias após o tratamento, moderada celularidade reduzida em um rato tratado com 530 MBq /kg
177Lu-IgG
1 sacrificados 25 dias após o tratamento e celularidade reduzida grave em um rato tratado com 530 MBq /kg
177Lu-rituximab sacrificados 15 dias após o tratamento. (B) Exemplo de um rato com a pele grave hemorragia 11 dias após a administração com 530 MBq /kg
177Lu-rituximab. O rato foi sacrificado no dia as fotos foram tiradas.
Biodistribuição e dosimetria
depuração do sangue foi ligeiramente mais rápido para
177Lu-rituximab do que para
177Lu -HH1 (Fig 6A), que deu uma dose absorvida para o sangue em ratinhos tratados com
177Lu-rituximab cerca de metade do que para a
177Lu-HH1 (Tabela 4, Fig 6B). A retenção de
177Lu-rituximab no fígado, baço e do fêmur foi significativamente maior do que a de
177Lu-HH1 ou
177Lu-IgG
1 (Fig 6A e 6B) e, consequentemente, as doses absorvidas a estes órgãos foram 2-3 vezes mais elevados para o tratamento com
177Lu-rituximab do que para
177Lu-HH1. Quanto maior for a absorção de
177Lu-rituximab no fémur (Tabela 4) provavelmente resultou numa dose absorvida superior a medula vermelha, o que é consistente com a toxicidade mais elevada e reduzida a celularidade da medula óssea observada em murganhos tratados com
177Lu-rituximab . A captação no tumor foi mais rápido para
177Lu-rituximab, mas a manutenção foi menor (sem significância estatística, p 0,05) do que para
177Lu-HH1 (Fig 6A). As doses absorvidas tumor estavam perto de 2 Gy para ambos
177Lu-HH1 e
177Lu-rituximab (Tabela 4). A captação e retenção de
177Lu-HH1 e
177Lu-IgG
1 controle foram semelhantes para todos os órgãos /tecidos, exceto para os rins e tumores (Fig 6A).
(A) Absorção de
177Lu-HH1 (N = 6-8),
177Lu-rituximab (N = 4-5),
controle 177Lu-IgG1 (N = 5) em órgãos selecionados /tecidos de camundongos nu com Ramos de xenoenxertos em percentagem de actividade injectada por grama de tecido (% IA /g). As barras de erro = erro padrão. *: Significativamente diferente do
177Lu-HH1 (One-way ANOVA com o método de Holm Sidak para comparações múltiplas, p 0,05). (B) Dose taxa por MBq de actividade injectada nos órgãos selecionados de ratos nu com Ramos xenoenxertos tratados com
177Lu-HH1 (N = 6-8) e
177Lu-rituximab (N = 4-5). (C)
In vivo
SPECT /CT multiplanar vista renderizada de um rato nu com um xenoenxerto Ramos em seu flanco direito injetados com 10 MBq de
177Lu-HH1.
imagens SPECT /CT mostrou uma elevada absorção e heterogeneidade do tumor em comparação com outros tecidos de 48 horas após a injecção de
177Lu-HH1 (Figura 6C). A absorção nos pulmões, coração e aorta foi elevada 3 horas após a injecção e diminuíram com o aumento do tempo, sendo consideravelmente reduzido após 48 horas. Captação no tumor foi baixa 3 horas após
administração 177Lu-HH1 mas aumentou com o tempo e foi maior do que em outros tecidos após 48 horas. A diferença de captação tumoral medida por SPECT e contador gama foi inferior a 10%, o que mostra uma boa concordância entre as medições realizadas
in vivo
com SPECT e
ex vivo
por contagem gama.
experiências internalização
HH1 foi quase completamente internalizado após 19 horas de incubação a 37 ° C, enquanto que não houve internalização significativa depois de 1 hora de incubação a 4 ° C.