Abstract

Fundo e Propósito

Para entender os mecanismos envolvidos na forte matando efeito da irradiação do feixe de carbono-ion em células cancerosas com

TP53

deficiências gene supressor de tumor.

Materiais e Métodos

respostas de danos ao DNA após feixe de carbono-ion ou X- irradiação com raios em linhas celulares de cancro colo-rectal HCT116 isogênicas, com e sem

TP53

(p53

+ /+ e p53

– /-, respectivamente) foram analisados ​​como se segue: a sobrevivência de células por ensaio clonogênica, celular modos de morte por observação morfológica de núcleos DAPI-manchados, DNA double-strand breaks (LAP) por imunocoloração de H2AX fosforilada (γH2AX), e do ciclo celular por citometria de fluxo e imuno da histona H3 Ser10-fosforilada.

resultados

o p53

– /- células foram mais resistentes do que a p53

+ /+ células à radiação de raios-X, enquanto as sensibilidades do p53

+ /+ e p53

– /- células a irradiação de carbono-ion eram comparáveis. raios-X e irradiações feixe de carbono-íon predominantemente apoptose induzida do p53

+ /+ células, mas não o p53

– /- células. No p53

– /-. As células, irradiação de carbono de iões de feixe, mas não de irradiação de raios X, induziu marcadamente catástrofe mitótica que foi associada com a entrada mitótico prematura com abrigando LAP longo retidos às 24 h pós-irradiação

Conclusões

indução eficiente de catástrofe mitótico em células deficientes em p53 resistentes à apoptose implica um efeito de matar células de câncer forte da irradiação de carbono-ion que é independente do status p53, sugerindo a sua vantagem biológica sobre o tratamento de raios-X

Citation:. Amornwichet N, Oike T, Shibata A, Ogiwara H, Tsuchiya N, Yamauchi M, et al. Células cancerosas (2014) Carbon-Ion Beam Irradiação Kills X-Ray-Resistant p53 induzindo mitótico catástrofe. PLoS ONE 9 (12): e115121. doi: 10.1371 /journal.pone.0115121

editor: Peiwen Fei, Universidade do Havaí Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de julho de 2014; Aceito: 18 de novembro de 2014; Publicação: 22 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Amornwichet et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão para os programas principais escolas de graduação, Cultivando líderes globais em Heavy Ion Therapeutics e Engenharia, e para Jovem Pesquisador Estratégico programa de visitas no exterior para Acelerar a circulação de cérebros, e da Investigação Científica em áreas inovadoras (22131006). Este trabalho também foi apoiado por bolsas-in-Aid da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência para Jovens Cientistas (B) KAKENHI [10643471]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

radioterapia Carbon-ion tem provocado interesse no campo da terapia do cancro. feixes de carbono-íon têm propriedades vantajosas mais de raios-X; uma distribuição de dose superior, relacionado com a penumbra afiado e o pico de Bragg, e o efeito de matar células forte [1], [2]. O principal resultado clínico promissor de radioterapia carbono-ião é o de ultrapassar a resistência das células cancerosas terapêutico para radioterapia de raios-X. Por exemplo, um estudo recente em que a radioterapia de carbono-ion foi usado para tratar pacientes com câncer retal relatou um controle de 5 anos local e taxas de sobrevida global de 97% e 51% para os casos pós-operatórios recorrentes [3]. Esta taxa é superior às taxas de 5 anos de sobrevivência global (0-40%), que são tipicamente obtidos por radioterapia de raios-X convencional ou ressecção cirúrgica [3], [4]. No entanto, a base biológica para o efeito de matar células de forte irradiação com feixe de iões de carbono em tumores com raios-X-resistente não foi elucidado totalmente.

aberrações genéticos contribuem para a resistência de raios-X de células cancerosas [ ,,,0],5], [6]. Inactivação de mutações no gene supressor de tumores

TP53 são representativas de resistência do tumor, e estas aberrações estão associados a um mau prognóstico após a radioterapia de raios-X [7], [8]. A proteína p53 desempenha vários papéis na resposta a danos no ADN (DDR) para a irradiação de raios X, incluindo a regulação das vias de morte celular e pontos de verificação do ciclo celular [9]. A indução de apoptose pelo p53 é um factor chave que afecta a sensibilidade das células cancerosas a radiação de raios-X. Vários pré-clínicos e clínicos demonstraram que estudos in

TP53

mutações estão associadas com a resistência das células cancerosas a terapia de irradiação de raios-X [7], [10], [11].

estudos anteriores mostraram que a irradiação do feixe de carbono-ion efetivamente mata as células cancerosas p53 mutante X-ray-resistentes [12-15]. Embora os mecanismos envolvidos neste processo foram examinados nestes estudos, os resultados foram inconsistentes. As inconsistências são, provavelmente, ao fato de que cada estudo se concentrou em apenas alguns aspectos da DDR (tais como apoptose ou a resposta do ciclo celular) [12] – [15] e cada um usou linhas celulares de cancro com diferentes origens genéticas; portanto, os efeitos de aberrações que não sejam

TP53 genes

pode ter mascarado os resultados [12], [13]. Aqui, para esclarecer os mecanismos subjacentes ao efeito letal forte da irradiação de carbono-ion de raios-X de irradiação resistentes células cancerosas com

TP53

aberrações, foi realizado um estudo abrangente de múltiplos aspectos da DDR usando um conjunto de células cancerosas humanas isogénicas que diferem apenas em seu estado p53.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

células HCT116 câncer colorretal humanos abrigam-tipo selvagem p53 (p53

+ /+) e seu derivado p53 nulo isogênico (p53

– /-) foram fornecidos pelo Dr. B. Vogelstein, da Johns Hopkins University. HCT116 p53

+ /+ células têm intactas postos de controle de danos ao DNA [16]. a expressão de p53, e os efeitos da irradiação do feixe de raios X e de carbono-ião na expressão da p53 em p53

+ /+ e p53

– /- células, foi analisada por imunotransf erência com anticorpos contra p53 (Santa Cruz) e β-actina (controlo de carga, Cell Signaling Technology) (S1a Fig.). Não houve diferença significativa na população duplicando o tempo entre as duas linhas celulares (Fig. S1b).

o cancro do cólon humano (RKO, LS123, e WiDr) células, cancro do pulmão humano de células (H1299), e humano (Saos-2) células de osteossarcoma foram adquiridas a partir da ATCC. células RKO abrigar p53 de tipo selvagem. células LS123 e WiDr abrigar uma mutação missense no p53 em R175H e R273H, respectivamente. células H1299 e Saos-2 são p53 nulo. células H1299 que expressam de forma estável uma mutação p53 missense (R175H, R273H, R249S ou R280K) foram estabelecidas como descrito previamente [17]. Todas as células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino.

diplóide humano normal imortalizada-hTERT fibroblastos de prepúcio (BJ-hTERT) ancorando-p53 do tipo selvagem foram adquiridos em Clontech. células BJ-hTERT que expressam shRNA contra EGFP (BJ-hTERT-WT; controle). ou p53 (BJ-hTERT-shp53) foram estabelecidas como descrito anteriormente [18], e cultivadas em Meio Essencial Mínimo de Eagle

Irradiação

irradiação de raios-X foi realizada utilizando um RX-650 de fonte de radiações Faxitron (100 kVp, 1,14 Gy /min; Faxitron biótica). irradiação de carbono-ion foi realizado na Universidade de Gunma de Íons Pesados ​​Medical Center usando as mesmas especificações do feixe que são usados ​​em ambientes clínicos (290 MeV /nucleon e uma transferência de energia linear média (LET) no centro de uma Bragg espalhado seis centímetros de pico de aproximadamente 50 keV /iM). feixes de carbono-iões foram entregues numa direcção vertical, de modo que as células em placas de cultura pode receber a dose uniformemente.

sobrevivência clonogénica ensaio

As células foram semeadas em placas de 6 poços e expostas (ou não ) para raios-X ou irradiação de carbono-ion. Após incubação durante mais 10 dias, as células foram fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal. As colónias de pelo menos 50 células foram contadas. A fracção sobrevivente foi normalizada para os controlos correspondentes. A dose que resultou numa fracção sobrevivente de 10% (D

10) foi calculada utilizando o modelo linear-quadrática, tal como descrito anteriormente [19].

avaliações morte celular

Células foram cultivadas em lamelas de vidro, expostas (ou não) para raios-X ou irradiação com feixe de iões de carbono, e, em seguida, coradas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole dicloridrato (DAPI), como descrito anteriormente [20]. imagens confocais foram coletados por meio de um microscópio BX51 (Olympus) equipado com uma câmera CCD (VB-7000; Keyence). A apoptose foi determinada com base na morfologia dos núcleos, incluindo a presença de corpos apoptóticos, a condensação nuclear e a fragmentação [21]. As células que contêm núcleos com duas ou mais lóbulos distintos foram pontuadas como positivas para a catástrofe mitótica [20], [22]. As células que contêm núcleos mostram focos heterocromáticas associada com a senescência foram pontuadas como positivas para a senescência [23]. As percentagens de células em apoptose, catástrofe mitótico ou senescência foram quantificados por contagem de células pelo menos 300 para cada condição experimental.

ciclo celular análise

Células expostas (ou não) para raios-X ou irradiação do feixe de iões de carbono foram colhidas nos pontos de tempo indicados, fixadas com etanol, coradas com iodeto de propidio na presença de RNase, e em seguida analisadas utilizando citometria de fluxo, como descrito anteriormente [19].

a imunocoloração

células expostas (ou não) para a irradiação de feixe de raios X ou de carbono-ião foram coradas com anticorpos contra a Ser139 fosforilada H2AX histona (γH2AX; Millipore) ou histona H3 Ser10 fosforilada (pH 3; Millipore), como descrito anteriormente [24]. γH2AX focos por núcleo foram marcados em imagens 2D sequenciais capturados a partir de múltiplos planos focais. Pelo menos 500 células foram avaliadas para cada condição experimental.

A análise estatística

As experiências foram realizadas em triplicado, pelo menos, a menos que indicado de outra forma. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas por Student não pareado

t

-Testes usando StatMateIII ver. 3.17 software (ATMS).

P

. 0,05 foi considerado significativo

Resultados

vigas Carbon-íon têm a atividade das células para matar o câncer mais potentes do que os raios X independentemente do estatuto p53

As sensibilidades de p53

+ /+ e p53

– /- células HCT116 para raios-X e irradiação de carbono-ion foram avaliadas por ensaios de sobrevivência clonog�icas (Fig. 1). Como esperado com base nos resultados de estudos anteriores [14], [15], p53

– /- células foram mais resistentes à irradiação com raios X do que p53

+ /+ células; os

10 valores D para estas duas linhas celulares foram de 6,8 Gy e 3,8 Gy, respectivamente. Por outro lado, as sensibilidades de p53

+ /+ e p53

– /- células a irradiação de carbono-ion foram comparáveis; os sub

10 D valores para estas linhas de células foram de 1,7 e 1,9 Gy Gy, respectivamente. Assim, a eficácia biológica relativa de irradiação de carbono-íon para irradiação de raios-X em D

10 foi de 2,2 em p53

+ células /+ e 3,6 em p53

– /- células. Estes dados indicam que a irradiação do feixe de iões de carbono eficazmente mata Raio-X-resistente

p53

células cancerosas -null.

As células foram semeadas em placas de 6 poços, incubadas durante a noite, e, em seguida, expostos a raio-X ou irradiação de carbono-ion. Após incubação durante mais 10 dias, as células foram fixadas, coradas e contadas. A fracção sobrevivente foi normalizada para o valor dos controlos correspondentes. Os dados são expressos como a média ± DP. C-ion, o carbono-ion.

Aberrações no p53 mudar o modo de morte celular induzida por câncer de irradiação da apoptose para mitótica catástrofe

Para explorar os mecanismos subjacentes à Estado- p53 actividade que matam as células independentes da irradiação do feixe de iões de carbono, os modos de morte celular induzida por raios X ou irradiação com feixe de iões de carbono foram avaliados (fig. 2, 3). p53

+ /+ e p53

– /- células foram irradiadas com doses de feixes de raios-X ou carbono-íon que eram semelhantes à D

10 para p53

+ células /+ (X -ray, 4 Gy; vigas de carbono-íon, 1,5 Gy). A apoptose, catástrofe mitótica e senescência foram determinados por análise das características morfológicas específicas de núcleos corados com DAPI (Figura 2A-C.) [20] – [23]. Em p53

células + /+, a apoptose foi o modo dominante de morte celular induzida por raios-X e feixe de irradiação de carbono-ion (Fig. 2d, f, 3a). Em contrapartida, p53

– /- células foram menos susceptíveis a apoptose causada por ambos os tipos de irradiação (Figuras 2e, G, 3-B.). Curiosamente, em p53

– /- (. Fig 2g, 3b) células, carbono-ião da irradiação do feixe de mitose induzida catástrofe mais evidente do que a irradiação de raios-X. Uma dose mais elevada de raios X de irradiação equivalente ao D

10 (6,8 Gy) para p53

– /- células induzidas um nível semelhante de catástrofe mitótica à induzida por irradiação com feixe de carbono-ião a 1,5 Gy (S2 FIG.). A indução da senescência não foi evidente em todas as condições experimentais (Fig. 2). Este resultado foi confirmado por ensaios de coloração β-galactosidase associada com a senescência, em que a fracção de células coradas-positivas foi menos do que 2% para ambas as linhas celulares expostas a raios X ou irradiação com feixe de iões de carbono (dados não apresentados). Estes dados indicaram que a apoptose e catástrofe mitótica é o principal modo de morte celular em p53

+ /+ células e p53

– /- células, respectivamente, tanto após a exposição a raios-X e a irradiação de feixe de carbono-ião, e que a irradiação do feixe de carbono-ion induz catástrofe mitótico mais eficaz do que a irradiação de raios-X em p53 apoptose-resistentes

– /- células

As células semeadas em lamelas de vidro foram incubadas durante a noite, expostos (ou não.; 0 h) para raios-X (4 Gy) ou feixe de carbono-ion (1,5 Gy) irradiação, e depois coradas com DAPI. Apoptose, catástrofe mitótico, e senescência foram determinados de acordo com as morfologias nucleares característica (ver “Materiais e métodos” para as definições). (A-C) mostram imagens representativos a morfologia nuclear de células em apoptose (a), catástrofe mitótica (b), ou senescência (c). As imagens de p53

– /- células foram retiradas 72 h após a irradiação com feixe de carbono-ion. (D, e) Modo de morte celular em p53

+ /+ (d) e p53

– /- (E) células em 0, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h após a X- irradiação com raios. (F, g) Meio de morte celular em p53

+ /+ (f) e p53

– /- (g), as células em 0, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h após a carbono- irradiação de feixe de íons. IR, irradiação; C-ion, o carbono-ion.

As células foram semeadas em lamelas de vidro, incubadas durante a noite, expostos a feixes de carbono-lítio (1,5 Gy), e em seguida coradas com DAPI 72 h mais tarde. Apoptose, catástrofe mitótico, e senescência foram determinados de acordo com as morfologias nucleares característica (ver “Materiais e métodos” para as definições). (A) p53

+ /+ células: 12,5%, 0% e 0% das células mostraram apoptose, catástrofe mitótica, e senescência, respectivamente. (B) p53

– /- células: 0%, 12,8% e 0% de células mostraram apoptose, catástrofe mitótico, e senescência, respectivamente. As setas em (a) e (b) indicam células que sofrem apoptose e catástrofe mitótica, respectivamente. Barras de escala, 10 ^ m.

Para aprofundar o assunto, examinamos o modo de morte celular em várias linhas de células humanas com diferentes status de p53 depois de raios-X ou irradiação de carbono-ion (Fig. 4 ). células RKO albergando p53 do tipo selvagem mostrou um fenótipo dominante apoptose após quer de raios-X ou irradiação com feixe de iões de carbono, ao passo que p53 nulo H1299 e Saos-2 de células mostraram um fenótipo dominante catástrofe mitótica. Assim, a supressão da expressão de p53 em fibroblastos BJ-hTERT promoveu a indução de catástrofe mitótica mediante raios-X ou irradiação com feixe de iões de carbono (S3 Fig.). Curiosamente, LS123 e células WiDr (que expressam p53 abrigando um missense em R175H e R273H, respectivamente), mostrou também um fenótipo dominante catástrofe mitótica (Fig. 4). Estes locais de mutação está localizada no interior do domínio de ligação ao ADN da proteína p53, que desempenha um papel chave na activação da transcrição de vários genes-alvo, incluindo as envolvidas na indução de apoptose [25]. Portanto, o próximo examinou o modo de morte celular induzida por irradiação usando uma série de células H1299 isogénicas que expressam de forma estável proteínas p53 com mutações missense no domínio de ligação de ADN que são frequentemente observadas em cancros humanos (ou seja, R175H, R273H, R249S e R280K ) [25]. Todas estas linhas de células mostraram um fenótipo dominante catástrofe mitótica após irradiação (Fig. 5). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a disfunção do domínio de ligação ao ADN de p53, muda o modo de morte celular induzida por irradiação do cancro da apoptose para mitótica catástrofe. Estes resultados também confirmaram que a irradiação do feixe de carbono-ion era melhor do que a irradiação de raios-X na indução de catástrofe mitótico em células cancerosas que albergam p53 aberrante.

As células foram semeadas em lamelas de vidro, incubadas durante a noite, irradiadas com raios-X ( D

10 dose) ou feixes de carbono-íon (D

10 dose), e em seguida coradas com DAPI 72 h mais tarde. Apoptose, catástrofe mitótico, e senescência foram determinados de acordo com as morfologias nucleares característica (ver “Materiais e métodos” para as definições). Os dados são expressos como a média ± DP. Ap, a apoptose; MC, catástrofe mitótico; Sns, senescência; IR, irradiação; C-ion, o carbono-ion

As células foram semeadas em lamelas de vidro, incubadas durante a noite, irradiadas com raios-X (10,9 Gy, D

10 para raios-X;. Ou 3,8 Gy, D

10 para feixes de carbono-ion) ou feixes de carbono-lítio (3,8 Gy, D

10 para as vigas de carbono-ion), e em seguida coradas com DAPI 72 h mais tarde. Apoptose, catástrofe mitótico, e senescência foram determinados de acordo com as morfologias nucleares característica (ver “Materiais e métodos” para as definições). Os dados são expressos como a média ± DP. MC, catástrofe mitótico; C-ion, o carbono-ion; IR, irradiação. Note-se que uma parte do painel H1299 p53 nulo é o mesmo que o mostrado na Fig. 4 (mas o contexto agora é diferente).

As células são liberados de G2 induzida por radiação /prisão M 24 h depois de raios-X ou irradiação de carbono-ion

catástrofe mitótico é pensado para ocorrer quando as células prosseguir através da mitose aberrante com danos ao DNA reparado [26]. Portanto, para explorar o mecanismo subjacente à indução de catástrofe mitótica em células sem p53 por irradiação com feixe de carbono-ião, os efeitos da irradiação do feixe de raios X e de carbono-ião nos estados do ciclo celular de p53

+ /+ e p53

– /- células HCT116 foram determinados por citometria de fluxo (Fig. 6a, b). Tais como as análises da morte das células, as células foram irradiadas com doses de raios-X (4 Gy) ou feixes de carbono-lítio (1,5 Gy). A indução de G2 M prisão /que atingiu um pico de 12 h após a irradiação foi observada em ambas as linhas celulares após a irradiação do feixe de raios X ou de carbono-ion, sendo mais evidente no p53

– /- células do que p53

+ /células +. Notavelmente, em ambas as linhas celulares expostas a raios X ou irradiação com feixe de iões de carbono, a G2 /M de prisão foi totalmente libertado 48 horas após a irradiação.

As células foram semeadas em placas de cultura de 35 mm (a, b) ou em lamelas de vidro (C), incubadas durante a noite, e expostas (ou não; 0 h) para raios-X (4 Gy) ou feixe de iões de carbono (1,5 Gy) irradiação. (A, b) células irradiadas com raios-X (A) ou feixes de carbono-lítio (b) foram incubadas durante 0, 12, 24, 48, 72, 96 ou 120 h, fixadas com etanol, coradas com iodeto de propídio, e estado do ciclo celular analisada por citometria de fluxo. (C) As células foram irradiadas com raios X ou feixes de carbono-lítio, incubou-se durante 1 h, e, em seguida, submetida a imunocoloração para pH 3, um marcador específico para células em fase M. Os dados são expressos como a média ± DP. *

P Art 0,05 e †

P Art 0,01 versus os controles correspondentes. IR, irradiação; C-ion, o carbono-ion

Em seguida, as percentagens de p53

+ /+ e p53

-. /- Células na fase M antes e depois de raios-X (4 Gy) ou carbono-íon vigas (1,5 Gy) irradiação foram avaliados por imunocoloração utilizando um anticorpo contra pH3 (Fig. 6c) [24]. Aproximadamente 2% da p53 não irradiado

+ /+ e p53

– /- eram células na fase M. Uma hora depois da irradiação do feixe de iões de carbono, as percentagens dessas células na fase M, foram reduzidas significativamente, apesar de p53

– /- células foram menos susceptíveis do que o p53

+ /+ células de irradiação de raios-X. Notavelmente, 24 h depois de raios-X ou radiação por feixe de carbono-ião, as percentagens de p53

+ /+ e p53

– /- células na fase M recuperado para a linha de base, o que sugere que ambas as linhas celulares reiniciado mitose 24 h após o tratamento.

DNA dupla vertente breaks gerados pela irradiação de carbono-ion, demonstram uma cinética de reparação mais lentas do que as geradas por irradiação de raios-X

Finalmente, a cinética de reparação de DNA double -Strand breaks (LAP), o tipo mais letal de dano ao DNA gerado por irradiação ionizante, foram examinados em p53

+ /+ e p53

– células HCT116 [27] – /. células irradiadas foram submetidos a coloração imunológica utilizando um anticorpo contra γH2AX, e os números de focos γH2AX por célula a 15 min e 24 h pós-irradiação foram contadas (Fig. 7, S1 Tabela) [24], [28]. As células foram irradiadas com uma dose de 2 Gy de raios-X ou uma dose de 1 Gy de feixes de iões de carbono; a estas doses, o número de focos γH2AX por célula no ponto de tempo de controlo (15 min pós-irradiação) foi de aproximadamente 20-30, o que era apropriado para a avaliação de [24], [28]. Vinte e quatro horas após a irradiação com raios-X, os números de γH2AX focos em p53

+ /+ e p53

– /- células foram de 24 ± 4.3% e 23 ± 5.3% daqueles dos controles correspondentes (no 15 min ponto de tempo), respectivamente (Fig. 7a, b), indicando que o grande número de LAP geradas por irradiação de raios-X foram reparados dentro de 24 h. Por outro lado, 24 horas após a irradiação com feixe de carbono-ion, o número de γH2AX focos em p53

+ /+ e p53

– /- células foram de 93 ± 11% e 85 ± 7.3% daqueles dos controles correspondentes , respectivamente (Fig. 7-a, C), indicando que os DSB geradas por irradiação com feixe de iões de carbono não foram corrigidas com eficiência, provavelmente devido à complexidade estrutural de ORL termina [29]. Na verdade, p53

+ /+ e p53

– /- células que coraram duplo positivo para γH2AX e pH 3 foram identificados 24 h após a irradiação com feixe de carbono-ion, demonstrando que células contendo LAP tinha entrado mitose (Fig. 7d). O status de p53 não afetou a cinética da perda de γH2AX focos depois de raios-X ou irradiação de carbono-ion. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que as células sem p53 abrigando LAP não reparados entrar mitose 24 h após a irradiação com feixe de carbono-ion, levando a uma catástrofe mitótico.

As células foram semeadas em lamelas de vidro, incubadas durante a noite, expostos a X- raios (2 Gy) ou vigas de carbono-lítio (1 Gy), incubadas durante mais 15 min ou 24 h, e, em seguida, submetida a imunocoloração para γH2AX e pH3. As células foram então coradas com DAPI. (A) O número de focos γH2AX por célula em 15 min ou 24 h pós-irradiação. Os resultados para cada linha celular foram normalizados para o número de focos γH2AX no ponto de tempo 15 min. Pelo menos 500 células foram contadas por condição experimental. Os dados são expressos como a média ± DP. *

P

0,05 contra as amostras correspondentes aos 15 min. (B, c) que mostram imagens microscópicas núcleos representativos expostos a (b) ou feixe de iões de carbono (c) irradiação de raios X, e imunocoradas para γH2AX. Em cada painel, o contorno do núcleo detectado por coloração com DAPI é indicado por uma linha tracejada. (D) as imagens microscópicas de núcleos representativos expostos a irradiação do feixe de iões de carbono e imunocoradas para γH2AX e pH 3 a 24 h após a irradiação. As setas indicam núcleos double-positivos. C-ion, o carbono-ion.

Discussão

Aqui, nós demonstramos que a irradiação do feixe de carbono-ion induz modos distintos de morte celular de acordo com o estado de mutação do

TP53

. Depois de tanto raios-X e irradiação de carbono-ion, a apoptose foi o modo dominante de morte celular de p53

+ /+ células, mas não p53

– /- células. Notavelmente, a taxa de entrada de mitose e a cinética de reparação de DSB após a irradiação, o que pode ser factores que induzem a catástrofe mitótica, foram semelhantes em p53

+ /+ e p53

– /- células, independentemente do tipo de irradiação utilizado. Estes dados indicam que a apoptose desempenha um papel principal na morte da célula do cancro causado por irradiação, na presença de p53. Na ausência das proteínas p53, as células cancerosas mostrou resistência à indução da apoptose e catástrofe mitótica foi observada após irradiação com feixe tanto de raios-X e de carbono-ião. Este achado é provavelmente explicada pela limitação do G2 /M checkpoint após a irradiação. A activação deste ponto de verificação permite a reparação do ADN danificado antes de ser passado para as células filhas e actua como uma barreira para impedir a entrada prematura em mitose [30]. No entanto, estudos anteriores sugeriram a limitação de G2 /M checkpoint após IR; G2 /M checkpoint é liberada quando o número de LAP torna-se menor do que ~10-20, seguido pela entrada mitótico [24], [31]. Após a libertação G2 /M do ponto de verificação, as células que albergam 10-20 LAP são capazes de completar o acontecimento mitótico e entrar na fase G1 [32], [33]. reparação de DSB é regulada negativamente na fase M; portanto, este dano pode ser reparado no ciclo celular ao lado, embora o processo de reparo em células filhas continua a ser elucidado [34]. Outra razão possível para a indução eficaz da catástrofe mitótica em p53

– /- células é a maior propensão dessas células para parar na fase G2 /M do que após a irradiação p53

células + /+. Esta acumulação de fase G2 /M é o resultado de um defeito na via de sinalização de p53-p21 que atenua a paragem em G1 após irradiação [16]. Esta propriedade de células cancerosas deficientes em p53 pode aumentar a chance de células irradiadas abrigando LAP não reparados entrar mitose, levando ao aumento da catástrofe mitótico.

Os resultados do presente estudo sugerem que tanto a falta de p53 e missense mutações em p53 contribuir para a mudança de apoptose a uma catástrofe mitótico. Em geral, 75% das mutações de p53 identificadas em cancros humanos são mutações missense individuais. A maioria das mutações de sentido trocado, incluindo as que foram examinadas neste estudo, estão localizados no interior do domínio de ligação a ADN de p53, que desempenha um papel chave na activação da transcrição de muitos genes alvo, incluindo aqueles que induzem a apoptose [25]. A maioria das proteínas p53 mutantes têm um efeito dominante negativo, que conduz à disfunção das proteínas p53 normais remanescentes. Portanto, é razoável que, juntamente com a falta de p53, as mutações de sentido trocado no domínio de ligação a ADN de p53 também contribuir para o fenótipo resistente à apoptose por perturbar a capacidade das proteínas p53 normais para activar transcricionalmente genes relacionados com apoptose; isso pode tornar as células irradiadas abrigando LAP não reparados mais suscetíveis à catástrofe mitótico. No entanto, é importante notar uma limitação do estudo neste ponto: não fomos capazes de estabelecer as células H1299 expressando p53 de tipo selvagem (ou transitoriamente ou estavelmente); Assim, uma comparação entre a p53 de fenótipo natural e da p53 mutante era impossível. Estudos futuros devem comparar o modo de morte celular induzida por radiação em linhagens de células isog�nicas portadores do tipo selvagem, mutante, e null-p53.

De nota, os resultados aqui apresentados demonstram a indução eficiente da catástrofe mitótico por carbono irradiação de feixe de iões em células sem p53 e p53 mutante. Na verdade, em todas as linhas de células sem p53 e p53 mutante testado, a dose que é necessária para induzir certo nível de catástrofe mitótica foi evidentemente inferior nos feixes de iões de carbono que em raios-X. Este resultado pode ser explicado pelas dificuldades associadas com a reparação de DSB de geradas por irradiação com feixe de iões de carbono, que retêm as estruturas mais complexas de ADN danificado termina do que as geradas por irradiação de raios-X [35]. ADN ineficiente reparar os estragos provocados pela complexidade das extremidades ORL pode estar subjacente ao efeito de matar células eficiente de irradiação do feixe de iões de carbono em células cancerosas que albergam aberrações p53.

Os resultados aqui descritos são parcialmente contraditórias aos do anterior estudos que examinaram o DDR após a irradiação do feixe de carbono-ion de células cancerosas p53 mutante. Embora alguns estudos observaram apoptose eficiente (S2 Tabela) [12] – [15], deve ser notado que este tipo de morte celular foi apenas induzida eficientemente pelo LET valores superiores a 70 keV /uM. Em contraste, o valor LET média no centro da espalhado pico de Bragg clinicamente utilizados, como usado aqui, é de aproximadamente 50 keV /uM. Além disso, em contraste com os resultados aqui descrito, a indução da senescência e prolongada (mais do que 3 dias) G2 /M detenção também foi observado em estudos anteriores utilizando a irradiação de feixe de carbono-ião com valores DEIXAM elevadas [12], [36] . Estes dados sugerem que o DDR é diferente dependendo do valor LET da irradiação de carbono-ion usado. Adicional

in vitro

e

in vivo são necessários

estudos de uma variedade de linhas celulares para validar os efeitos terapêuticos da irradiação de carbono-ion no LET utilizado em ambientes clínicos.

em resumo, esta análise abrangente da DDR em linhas celulares isog�nicas irradiados demonstra que as células cancerosas sem p53 irradiação resistente de raios-X são suscetíveis a irradiação de carbono-ion, que induz de forma eficiente catástrofe mitótico (Fig. 8). A indução de uma catástrofe mitótica em tumores resistentes à apoptose pode ser uma importante vantagem biológica da radioterapia sobre carbono-ião radioterapia de raios-X. Estudos adicionais utilizando modelos animais ou amostras clínicas são necessários para elucidar esta questão.

C-ion, o carbono-ion.

Informações de Apoio

S1 Fig.

Propriedades da p53

+ /+ e p53

– /- células

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s001

(PDF)

S2 Fig.

Os modos de morte celular induzida por radiação de raios-X para a D

10 em HCT116 p53

– /- células

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s002

( PDF)

S3 Fig.

Os modos de morte celular induzida por raios X ou irradiação de carbono-ion no BJ hTERT-WT ou -shp53 células

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s003

(PDF)

S1 Table. .

O número de focos γH2AX por célula após a irradiação

doi: 10.1371 /journal.pone.0115121.s004

(PDF)

S2 Table.

DEIXE-dependência da eficácia da indução de apoptose pela irradiação de carbono-ion em células cancerosas p53 mutante

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s005

(PDF)

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Tetsushi Sadakata, Dr. Kohta Torikai, e Dr. Mayumi Komachi (Universidade Gunma) para assistência técnica. Agradecemos ao Dr. Volgelstein (Johns Hopkins University) para a prestação de linhas celulares.