Abstract

Fundo

aberração Genomic é uma característica comum dos cancros humanos e é também um dos princípios básicos baseado na matriz mecanismos que levam a sobre-expressão de oncogenes e subexpressão de genes supressores de tumor. Nosso estudo tem como objetivo identificar alterações genômicas frequentes no câncer de pâncreas.

Materiais e Métodos

array

Nós usamos hibridização genômica comparativa (array CGH) para identificar alterações genômicas recorrentes e validado a expressão de proteínas de genes selecionados por imuno-histoquímica.

resultados

Dezesseis ganhos e trinta e duas derrotas ocorreram em mais de 30% e 60% dos tumores, respectivamente. amplificações de alto nível em 7q21.3-q22.1 e 19q13.2 e deleções em 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13. 2, 17q21.31 e 22q13.1 foram identificados. Especialmente, a amplificação de AKT2 foi detectado em dois carcinomas e deleção homozigótica do CDKN2C em outros dois casos. Em 15 amostras de validação independentes, descobrimos que AKT2 (19q13.2) e MCM7 (7q22.1) foram amplificados em 6 e 9 casos e CAMTA2 (17p13.2) e PFN1 (17p13.2) foram homozigoticamente eliminada no 3 e 1 casos. AKT2 e MCM7 foram overexpressed e CAMTA2 e PFN1 foram underexpressed em tecidos de câncer pancreático do que em tecidos de margens operacionais morfologicamente normais. Ambos GISTIC e software 22q13.1 identificados Genomic Workbench contendo APOBEC3A e APOBEC3B como a única região deleção homozigótica. E os níveis de expressão APOBEC3B APOBEC3A e foram significativamente mais baixos nos tecidos tumorais do que em tecidos de margem operatórias morfologicamente normais. Além disso validação mostrou que a superexpressão de PSCA foi significativamente associada com metástase ganglionar, e superexpressão de HMGA2 foi significativamente associada com profundidade invasivo de câncer pancreático.

Conclusão

Estas alterações genômicas recorrentes pode ser útil para revelando o mecanismo de carcinogênese pancreática e fornecendo biomarcadores candidatos

Citation:. Liang JW, Shi ZZ, Shen TY, Che X, Wang Z, Shi SS, et al. (2014) Identificação de Genomic Alterações no cancro do pâncreas Utilizando-Based matriz Hibridização Genômica Comparativa. PLoS ONE 9 (12): e114616. doi: 10.1371 /journal.pone.0114616

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 16 de julho de 2014; Aceito: 12 de novembro de 2014; Publicação: 11 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science and Technology Projeto Principal de China (2012ZX09506001, 2011YQ17006710) e National Natural Science Foundation da China (81.241.086) e o Yunnan Provincial Fundação de Pesquisa de Pesquisa básica, China (Grant No. 2013FD012). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Fundo

o câncer de pâncreas é um dos cancros mais malignent do mundo, com uma taxa de sobrevida em 5 anos inferior a 5% [1]. Até agora, não existe um tratamento convencional com um impacto significativo sobre o curso do cancro do pâncreas, de modo a que o prognóstico para pacientes continua a ser pobre. Portanto, a identificação das alterações moleculares subjacentes a este câncer vai lançar as bases para melhorar a gestão clínica e os resultados.

instabilidade genômica é uma característica dos tumores quase humanos [2]. número de cópias alterações são frequentemente encontrados nos cancros, e se crê contribuir para a iniciação e progressão de tumores por amplificação e activação de oncogenes ou supressão induzida por baixo-expressão de genes supressores de tumores. Vários estudos anteriores identificaram algumas alterações cromossômicas recorrentes no cancro pacreatic, tais como ganhos em 1q, cromossomas 2, 3 e 5, 7P, 8q, 11q, 12p, 14q, 17q, 19q e 20q, as perdas nos cromossomos 1p, 3p, 6 , 8p, 9p, 10q, 13q, 14q, 15q, 17p e 18q, e amplificações de FGFR1, HER2 e DcR3 [3], [4], [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. No entanto, a informação disponível é ainda limitada, especialmente para câncer de pâncreas chinês.

O presente estudo identificou ganhos comuns, perdas, amplificações e deleções em câncer pancreático. Nós ainda avaliados o nível do HMGA2 aumento de número de cópia genes e PSCA expressão da proteína.

Materiais e Métodos

Design Estudo

Em primeiro lugar, as aberrações genéticas em carcinomas de pâncreas foram detectada usando Agilent 44K Genoma Humano CGH microarrays e as alterações genómicas comuns foram identificados. Então, nós validou a expressão da proteína de HMGA2 e PSCA que estavam localizados nas regiões comuns de aberração cromossômica em câncer pancreactic.

Pacientes e amostras

tecidos recentemente ressecados de pacientes com carcinoma 93 pancreáticas foram recolhidos por do Departamento de Patologia, Hospital do Câncer, da Academia chinesa de Ciências Médicas, Beijing, China, de 2006 a 2008. Todos os pacientes com câncer pancreático foram tratados com operação radical, e nenhum deles recebeu qualquer tratamento antes da cirurgia. regiões de tumor representativos foram excisadas por patologistas experientes e imediatamente armazenados a -70 ° C até serem usadas. Todas as amostras utilizadas neste estudo foram as amostras residuais após a amostragem diagnóstico. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento informado separadas para amostragem e análise molecular. As características clínicas dos pacientes utilizados no estudo CGH array são apresentados na Tabela 1. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Cancer Institute e Hospital, Peking Union Medical College, da Academia Chinesa de Ciências Médicas de Ética (No. NCC2013B-30).

ADN genómico Extracção

o ADN genómico foi isolado a partir de tecidos de tumor utilizando o Qiagen DNeasy Blood Kit de tecido, tal como descrito pelo fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). o conteúdo da célula tumoral de todas as amostras foi superior a 50% por coloração HE.

baseada em matriz CGH

array CGH experimentos foram realizados utilizando protocolos padrão da Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) . ADN genómico humana comercial (Promega, Warrington, UK) foi utilizado como referência. Para cada hibridação CGH, 500 ng de ADN genómico de referência e a mesma quantidade de ADN de tumor foram digeridas com Alu I e a enzima de restrição Rsal (Promega, Warrington, UK). Os fragmentos de ADN digeridos foram de referência marcado com cianina 3-dUTP e o ADN do tumor com cianina 5-dUTP (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Após a limpeza, as sondas de referência e de DNA do tumor foram misturados e hibridizados para Agilent 44K genoma humano CGH microarrays (Agilent) por 40 h. procedimentos de lavagem, de digitalização e de extração de dados foram realizadas seguindo protocolos padrão.

Microarray Análise de Dados

dados de microarranjos foram analisados ​​usando Agilent Genomic Workbench (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e BRB-arraytools ( https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html). Agilent Genomic Workbench foi usado para calcular log

2

proporção para cada sonda e identificar aberrações cromossômicas. A média de log

2

rácio de todas as sondas em uma região cromossômica entre 0,25 e 0,75 foi classificada como ganho de genômica, 0,75 como amplificação de DNA de alto nível, -0,25 perda como hemizygous, e -0.75 como deleção homozigótica. Na análise enriquecimento via, p-valor é calculado para cada percurso com base na distribuição nula obtido por um método de amostragem aleatória 1000-tempo.

-PCR em tempo real

As reacções de PCR foram realizadas num volume total de 20 ul, incluindo 10 ul de 2XPower mistura SYBR Green PCR master (Applied Biosystems, Warrington, UK), 2 ul de ADNc /ADN genómico (5 ng /uL), e 1 uL de mistura de iniciadores (10 uM cada ). A amplificação por PCR e a detecção foram levadas a cabo no ABI 7300 (Applied Biosystems, Warrington, UK) como se segue: uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min; 45 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. A expressão do gene relativo ou número de cópia relativa do gene alvo foi calculada usando o método comparativo CT por normalizadas para GAPDH um endógena. A relação ao calibrador foi dada pela fórmula 2

-ΔΔCt. ΔCT foi calculada subtraindo a média GAPDH CT do CT média do gene de interesse. A relação define o nível de expressão relativa ou número de cópia relativa do gene alvo para que de GAPDH. 2

-ΔΔCt 2,0 foi criado para uma amplificação do alvo, e 2

-ΔΔCt. 0,25 foi estabelecido para uma deleção homozigótica alvo

imuno coloração

fixado em formalina, tumores pancreáticos e embebidas em parafina foram colocados no tissue microarray. Para cada caso, os tecidos de cancro foram repetidos por três vezes e tecidos morfologicamente normais adjacentes por duas vezes. As lâminas foram desparafinadas, re-hidratadas, imerso na solução de peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 min, aqueceu-se em tampão citrato (pH 6) durante 25 min a 95 ° C, e arrefeceu-se durante 60 min à temperatura ambiente. As lâminas foram bloqueadas em soro de cabra normal a 10% durante 30 min a 37 ° C e, em seguida, incubadas com anticorpo monoclonal de ratinho contra HMGA2 (Abcam, Cambridge, MA) e anticorpo policlonal de coelho contra PSCA (Abcam, Cambridge, MA) durante a noite a 4 ° C. Depois de ter sido lavada com PBS, as lâminas foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado (diluído 1:100) durante 30 min a 37 ° C, seguido por estreptavidina-peroxidase (diluição 1:100) incubação durante 30 min a 37 ° C. Imunomarcação foi visualizado com uma mistura de uma solução de 3,3′-diaminobenzidina. A contracoloração foi realizada com hematoxilina.

O nível de expressão foi determinada com base na intensidade de coloração e a percentagem de células imunorreactivas. expressão negativa (pontuação = 0) houve ou coloração fraca ou moderada a forte coloração no 25% das células. expressão fraca (pontuação = 1) foi uma coloração moderada ou forte, em 25% a 50% das células. E forte expressão (pontuação = 2) foi . 50% das células com coloração forte

Análise Estatística

O teste t de Student eo teste do qui-quadrado foram realizadas com o software estatístico SPSS 15.0 . As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando a frente e verso

valor P

correspondente foram . .05

Resultados

ganhos e perdas no pâncreas Carcinoma detectadas pela matriz CGH

Quinze amostras de carcinoma de pâncreas foram analisados ​​neste estudo e todos eles tiveram alterações genômicas (Intervalo: 1 a 387). Dezesseis ganhos e trinta e duas perdas foram detectados com frequência (frequência de ganho de 30%, e perda de 60%). Os ganhos mais frequentes foram 8p23.3 (41,7%), 1q44 (40%), 14q32.33 (40%), 19q13.43 (36,7%), 1q21.3 (36%) e 5q31.1-q31.2 (35,6%), ea maioria das perdas comuns foram 11p15.4 (70,7%), 15q15.1-q21.1 (70%), 3p21.31 (68,9%), 17p13.3-p13.2 (66,7%), 19p13.3-p13.2 (66,7%), 5p13.3 (63,3%), 11p11.2 (63,3%) e 19p13.3-p13.11 (63,3%). GISTIC análise mostrou que o número de cópia diminuição APOBEC3A (22q13.1) e APOBEC3B (22q13.1) foi significativa (Fig. 1 e Tabela 2).

. gráfico de frequência de todo o genoma do câncer de pâncreas por análise de CGH array. Linha sobre o direito de 0% -axis, ganho; A linha do lado esquerdo de 0% -axis, perda. B. Números de aberrações em câncer pancreático. X, número de aberrações; Y, o número de casos. C. Os ganhos e perdas (HDS) identificado por GISTIC.

amplificações e Homozigoto Eliminações no pâncreas Carcinoma detectado pela matriz CGH

amplificações de alto nível foram detectados em dois cromossomo regiões, incluindo 7q21.3-q22.1 e 19q13.2. deleções foram identificados em 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13.2, 17q21.31 e 22q13.1 (Tabela 3). Especialmente, AKT2 gene do cancro (19q13.2) foi amplificado em dois carcinomas, e CDKN2C (1p33) foi homozigoticamente eliminada em outros dois casos. (Fig. 2). Ao pesquisar o banco de dados COSMIC, descobrimos que a amplificação de AKT2 foi associado com o aumento da sentitivity à droga Z-LLNIe-CHO. Mais interessante, deleção homozigótica do 22q13.1 contendo APOBEC3A e APOBEC3B foi identificado em ambos GISTIC e análise Agilent Genomic Workbench (Fig. 3).

A. amplificação de AKT2. B. deleção homozigótica do CDKN2C. As setas indicam a posição do AKT2 e CDKN2C.

Ciclos representam as sondas de APOBEC3A e APOBEC3B.

Nós ainda selecionados os genes amplificados AKT2 (19q13.2 ) e MCM7 (7q22.1) e genes suprimidos CAMTA2 homozigoto (17p13.2) e PFN1 (17p13.2) para validação por PCR em tempo real. Em 15 amostras independentes de validação, amplificações de AKT2 e MCM7 foram detectados em 6 e 9 casos, e deleções de CAMTA2 e PFN1d em 3 e 1 casos, respectivamente (Fig. 4A e 4B). AKT2 e MCM7 foram overexpressed e CAMTA2 e PFN1 foram underexpressed em tecidos de câncer pancreático do que em tecidos morfologicamente normais operativas de margem (Fig. 5A e 5B).

A. amplication de AKT2 e MCM7. B. deleção homozigótica do CAMTA2 e PFN1. C. deleção homozigótica do APOBEC3A e APOBEC3B. Ratio = (número de cópias do gene candidato em tecidos tumorais) /(número de cópias do gene candidato no ADN genómico humano comercial).

A. A sobre-expressão de AKT2 e MCM7. B. subexpressão de CAMTA2 e PFN1. C. subexpressão de APOBEC3A e APOBEC3B.

Em amostras de validação independentes, APOBEC3A e APOBEC3B foram homozigotos eliminada em 3 e 4 tumores, respectivamente (Fig. 4C). Os níveis de expressão de mRNA de APOBEC3A e APOBEC3B em tecidos tumorais foram significativamente menores do que em tecidos de margens operacionais morfologicamente normais (Fig. 5C)

Pathways enriquecido para Copy Number Alterações

análise de enriquecimento Pathway usando banco de dados KEGG foi aplicada aos dados CGH. Descobrimos que duas vias enriquecidas em genes com ganho e que seis vias enriquecidas em genes com perda. Os ganhos genômicas em carcinomas de pâncreas mudou as vias de degradação gama-hexaclorociclohexano e fosforilação oxidativa. No entanto, cianoamino metabolismo do ácido, metabolismo da glutationa, a degradação da atrazina, taurina e metabolismo hypotaurine, metabolismo do ácido araquidônico e percursos da doença de Parkinson foram alteradas pelas perdas genômicas (Tabela 4).

Validação de HMGA2 e PSCA em Cancro do pâncreas utilizando imuno-histoquímica

Copiar aumento número de HMGA2 e PSCA foi detectado em um e quatro tumor, respectivamente. Por causa de seu papel significativo na tumorigênese [10], [11], [12], [13], analisou-se a expressão da proteína de HMGA2 e PSCA utilizando imuno-histoquímica (IHQ). Os resultados mostraram que a superexpressão de HMGA2 e PSCA foi detectada em 76,7% e 65,0% dos doentes com cancro pancreático, respectivamente (Fig. 6). Além disso, a sobre-expressão de PSCA foi significativamente associada com metástases linfonodais (Tabela 5), ​​e superexpressão de HMGA2 foi significativamente associada com profundidade invasivo do câncer de pâncreas (Tabela 6).

A. expressão forte e negativa de HMGA2. B. expressão forte e negativa de PSCA.

Discussão

aberrações cromossômicas pode contribuir para a progressão da carcinogênese e tumor. A fim de identificar DNA número de cópias mudanças no câncer de pâncreas, foi realizada a hibridização genômica comparativa baseada em array e descobriu que dezesseis ganhos com frequência acima de 30% e trinta e duas perdas superiores a 60%, com duas amplificações de alto nível em 7q21.3- q22.1 e 19q13.2 e dez deleções em 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13.2, 22q13 e 17q21.31. 1. Ao comparar os nossos resultados com dados de CGH apresentados no web site progenetix [14], [15], descobrimos que a maioria das aberrações cromossômicas foram consistentes. Mas ainda havia algumas diferenças. Por exemplo, a perda de 9p foi mais frequente do que a perda de 9Q nos dados progenetix, mas a freqüência de perda 9Q foi superior 9p perda em nosso estudo. O ganho do cromossomo 7 foi muito comum em dados progenetix, mas a perda deste cromossomo foi mais frequente em nossos dados.

De forma significativa, AKT2 gene do câncer foi amplificado em dois pacientes com câncer pancreático, e CDKN2C gene do câncer foi suprimido homozigoticamente em outros dois casos. Nós validado a amplificação de AKT2 e MCM7 (7q22.1) e deleção homozigótica do CAMTA2 (17p13.2) e PFN1 (17p13.2) em câncer pancreático, e ainda descobriu que AKT2 e MCM7 foram overexpressed e CAMTA2 e PFN1 foram underexpressed no câncer de pâncreas, em comparação com aqueles em tecidos de margens operacionais morfologicamente normais. Estes resultados sugerem que os genes incluindo AKT2, MCM7, CAMTA2 e PFN1 pode desempenhar um papel importante no câncer de pâncreas. deleção homozigótica do CDKN2C foi encontrado no mieloma e diminuição do número de cópias de CDKN2C foi significativamente associada com uma sobrevida global pior [16], [17], [18]. No entanto, ainda havia pouca informação sobre o papel do CDKN2C em câncer pancreático. No que respeita à alteração da AKT2 em malignidades humanas, Miwa et al. relataram a amplificação de AKT2 foi em 3 de 12 linhas de células de cancro do pâncreas e em 3 dos 20 carcinomas pancreáticos primários. A sobre-expressão de AKT2 também foi detectado nas 3 linhas de células com AKT2 amplificado [19]. A sobre-regulação de AKT2 foi correlacionada com o prognóstico [20]. Tanno et ai. encontrado que a AKT activo promoveu a capacidade de invasão de células de cancro do pâncreas através up-regulação da expressão do IGF-IR [21]. ARNi simultaneamente segmentação AKT2 e K-ras podia para a inibição do crescimento do tumor pancreático [22]. Chen et al. demonstraram que a inibição AKT2 pode revogar a activação induzida por gemcitabina de AKT2 e NF-kB, e promover induzida por gemcitabina PUMA regulação positiva, resultando em quimiossensibilização de tumores pancreáticos para gencitabina [23]. Nossos resultados verificou ainda a ampliação da AKT2 em câncer pancreático. Ao pesquisar o banco de dados COSMIC, também descobrimos que a amplificação de AKT2 foi associado com o aumento da sentitivity à droga Z-LLNIe-CHO. Todos estes resultados sugerem que a amplificação de AKT2 talvez evoluir para um biomarcador para dividir os doentes com cancro pancreático em diferentes subgrupos de aplicação estratégia terapêutica diferente. E, no futuro, se a droga Z-LLNIe-CHO podem ser utilizados para tratar os doentes com cancro pancreático com amplificação AKT2 deve ser estudado.

Curiosamente, ambos genómico e GISTIC Workbench Software identificado 22q13.1 (contendo APOBEC3A e APOBEC3B) região eliminação como homozigotos. Real-time PCR mostrou que APOBEC3A e APOBEC3B foram underexpressed em tecidos de câncer pancreático do que em tecidos de margens operacionais morfologicamente normais. enzimas APOBEC funcionar na resposta imune inata, incluindo aqueles que visam retrovírus, sugerindo ligações entre a imunidade, mutagênese e infecção viral no processo de desenvolvimento de câncer. APOBEC3A poderia induzir hipermutação de ADN genómico e ADN rupturas de filamentos duplos, e catalisar a transição de uma saudável para um genoma de câncer [24], [25]. Pham et al. relataram que APOBEC3A foi expresso em queratinócitos, e supra-regulados em cancro da pele [26]. APOBEC3B foi sobre-expresso na maioria das linhas celulares de cancro do ovário e cancro do ovário primários de alto grau. expressão improtantly APOBEC3B foi correlacionada com a carga total mutaion, bem como níveis elevados de mutações transversão [27]. Harris et al. informou que APOBEC3B responsável por até metade da carga mutacional na mama carcinomas que expressam esta enzima [28]. Em outros cancros, incluindo o da bexiga, colo do útero, pulmão e da cabeça e pescoço, APOBEC3B também foi regulada positivamente e a sua sequência alvo preferido foi mutado e frequentemente agrupado [29]. Supressão de APOBEC3B atenuada depuração do VHB, e resultou na infecção por HBV e aumento do risco para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular [30]. Supressão de APOBEC3 também foi associado com risco de câncer de mama entre as mulheres de ascendência europeia [31]. deleção homozigótica do APOBEC3B foi significativamente associada com resultados desfavoráveis ​​para o HIV-1 aquisição e progressão para SIDA [32]. Será interessante para investigar o papel da deleção homozigótica do APOBEC3A e APOBEC3B na carcinogênese pancreática.

HMGA2 e PSCA foram relatados para ser associado com câncer de pâncreas. Piscuoglio et ai. mostrou que a percentagem de células tumorais com HMGA2 e imunorreatividade nuclear HMGA1 correlacionou positivamente com o aumento do grau de malignidade e metástase ganglionar [33], [34]. E HMGA2 mantida transição epitelial-mesenquimal oncogénica induzida por RAS em células de cancro pancreático humano [35]. O nosso estudo revelou que os ganhos de HMGA2 e PSCA foram detectados em um e quatro carcinomas pancreáticos, respectivamente. No ensaio de IHQ, a sobre-expressão de HMGA2 foi detectada em 76,7% e que de PSCA em 65,0% dos tumores. E sobre-expressão de PSCA foi significativamente associada com metástase ganglionar, e superexpressão de HMGA2 foi significativamente associada com profundidade invasivo de câncer pancreático.

No geral, nosso estudo identificou regiões cromossômicas alterou-número múltiplas cópias em câncer pancreático. Estes resultados fornecem importantes insights sobre as alterações moleculares associados com tumorigênese pancreático. Novos estudos devem ser realizados para explorar os possíveis papéis tumorigênicos destes genes número de cópias alteradas.