Abstract

O resveratrol é um agente quimiopreventivo promissora que medeia muitos alvos celulares envolvidos nas vias de câncer de sinalização. p53 tem sido sugerido para desempenhar um papel nas propriedades anticancerígenas de resveratrol. Foi investigada a citotoxicidade induzida pelo resveratrol em células H1299, que são células de cancro do pulmão de não-pequenas que possuem uma deleção parcial do gene que codifica a proteína p53. Os resultados para as células H1299 foram comparados com os de três linhas de células que expressam constitutivamente a p53 selvagem: cancro da mama MCF-7, adenocarcinomic alveolar A549 epitélio basal e cancro do pulmão de não-pequenas H460. ensaios de viabilidade celular revelou que o resveratrol reduziu a viabilidade de todas estas quatro linhas celulares de um modo dose e dependente do tempo. MCF-7, células A549 e H460 foram mais sensíveis do que o resveratrol para as células H1299 foram quando exposta ao fármaco, durante 24 horas a concentrações superiores a 100 uM. Resveratrol também aumentou os níveis de proteína p53 em células MCF-7 sem alterar os níveis de ARNm de p53, o que sugere uma modulação pós-tradução da proteína. A citotoxicidade induzida pelo resveratrol nestas células foi parcialmente mediada por p53 e envolveu a activação de caspases 9 e 7 e a clivagem de PARP. Em células H1299, a citotoxicidade induzida pelo resveratrol foi menos pronunciada e (em contraste com as células MCF-7) morte celular não foi acompanhado por activação da caspase. Estes resultados são consistentes com a observação de que as células MCF-7 foram positivamente marcado pelo método TUNEL após a exposição a 100 jiM enquanto que o resveratrol H1299 células sob condições semelhantes não foram marcadas por TUNEL. A transfecção transiente de um gene p53-GFP de tipo selvagem provocou H1299 células se tornem mais sensíveis às propriedades pró-apoptóticos de resveratrol, de forma semelhante às descobertas nas células p53-positivo MCF-7. Os nossos resultados sugerem um possível estratégia terapêutica baseada na utilização de resveratrol para o tratamento de tumores que são tipicamente não respondem a terapias convencionais devido à perda da função de p53 normal,

citação:. Ferraz da Costa DC, Casanova FA, Quarti J, Malheiros MS, Sanches D, dos Santos PS, et al. (2012) Transient A transfecção de um gene p53 de tipo selvagem disparadores resveratrol Induzida por apoptose em células de cancro. PLoS ONE 7 (11): e48746. doi: 10.1371 /journal.pone.0048746

editor: Waldemar Debinski, Wake Forest University, School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de fevereiro de 2012; Aceite: 1 de outubro de 2012; Publicação: 12 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Costa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Fundação de Amparo à Pesquisa Carlos Chagas Filho do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ); e da Fundação do Câncer do Brasil. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é uma das principais preocupações de saúde pública mundial, eo número de mortes relacionadas ao câncer deve dobrar nos próximos 50 anos [1]. A evidência epidemiológica sugere que os hábitos alimentares são importantes fatores de risco associados ao desenvolvimento de câncer e que os fitoquímicos que são encontrados naturalmente em frutas e vegetais pode mediar uma série de alvos tumorais [2], [3]. Aplicações clínicas têm sido sugeridas para estas moléculas bioactivas alimentares por causa da sua grande capacidade para inibir, recuperar, ou atrasar múltiplos passos carcinogénicas [4], [5], [6].

resveratrol (3,5,4 ‘-trihydroxy-

trans estilbeno), que foi descrita pela primeira vez em 1940, é um polifenol natural que é encontrado em uma grande variedade de plantas, incluindo as uvas, frutas e amendoins. Esta molécula tem sido classificada como uma fitoalexina porque ele é sintetizado por plantas em resposta a uma variedade de condições de stress ambientais, tais como infecções por fungos e radiação UV [7], [8]. Resveratrol é encontrado em ambos

cis

e

trans-

formas estereoisoméricas;

trans

isómero é o formulário que está associado com a maioria das atividades biológicas da molécula. O resveratrol como um composto dietética tem sido descrito como um poderoso agente que é capaz de prevenir doenças cardiovasculares, inflamatórias e neurodegenerativas, incluindo a obesidade e diabetes [7], [9]. A molécula é também capaz de modular uma ampla gama de alvos moleculares, incluindo aqueles que estão envolvidos nas vias de sinalização de cancro [8], [10].

O potencial anti-cancro do resveratrol foi reconhecida em 1997, quando a sua capacidade para inibir todos os três estágios da carcinogênese (ie, iniciação, promoção e progressão) foi demonstrado pela primeira vez [10]. Estudos subsequentes têm mostrado que a molécula exibe actividade anti-cancro quando testados em vários modelos experimentais [11], [12]. Vários estudos têm sugerido que os mecanismos responsáveis ​​para as propriedades quimiopreventivas da molécula estão intimamente associados com o seu antioxidante e propriedades anti-inflamatórias [13].

O resveratrol está associada com a regulação de várias vias celulares, incluindo a inibição do carcinogéneo activação, a estimulação de enzimas desintoxicantes cancerígena, a modulação de proteínas que estão envolvidos em progressão e a apoptose [14] do cancro, [15], [16], e a inibição da angiogénese [17]. Os estudos também sugerem que o resveratrol pode ser utilizado para sensibilizar tumores para fármacos quimioterapêuticos de cancro específicos [18]. Coletivamente, essas descobertas proporcionam provas suficientes para a realização de ensaios clínicos para investigar os quimiopreventivos e quimioterapêuticos propriedades deste composto bioativo [4], [12].

p53 é uma proteína de supressor de tumor que desempenha um papel essencial na prevenção do desenvolvimento de cancro através da indução de paragem do ciclo celular ou a apoptose em resposta ao stress genotóxico. Esta proteína é principalmente regulada pela ubiquitina ligase MDM2, que se liga a p53 e que tem como alvo para a degradação no proteassoma. função de p53 normal é perdido ou inactiva em cerca de 50% dos cancros humanos [19], [20], [21], [22].

O resveratrol é capaz de induzir a morte celular dependente de p53 no ratinho JB6 linha de células epidérmicas [23], eo envolvimento de p53 na função anti-cancerígena do resveratrol foi estabelecida em uma ampla gama de células [7], [16], [23], [24], [25], [ ,,,0],26]. Vários estudos têm indicado que a apoptose ocorre apenas em células que expressam p53 de tipo selvagem, mas não em células deficientes em p53 [23] mutada de p53 ou, [27]. O papel exacto do resveratrol em linhas de células de tumor p53-negativo, que podem ser resistentes a agentes quimioterapêuticos convencionais, como resultado da perda de expressão ou função p53, não tem sido extensivamente estudados [28], [29], [30]. É crucial para determinar se a transfecção de p53 de tipo selvagem é capaz de restaurar os efeitos pró-apoptóticos de resveratrol para a finalidade de avaliar outras técnicas de terapia de genes destinadas a fixar uma molécula de p53 defeituosa. Vários estudos de terapia de gene p53 têm demonstrado a eficiência do presente método não apenas em linhas de células tumorais, mas também em ensaios clínicos [31].

No presente estudo, foram investigados os efeitos do resveratrol numa linha celular que portador de um gene p53 parcialmente eliminado, e testou-se a hipótese de que a transfecção transiente de p53 iria fazer com que estas células se tornem capaz de responder às propriedades pro-apoptóticos de resveratrol. Para investigar directamente este problema, que transfectadas H1299 células, que não expressam o gene de p53, e comparados os resultados com os obtidos em células MCF-7 de cancro da mama humano, uma linha celular que tem sido extensivamente estudada e que expressa constitutivamente o de tipo selvagem gene p53.

Verificou-se que a transfecção transiente de tipo selvagem do gene p53-GFP faz com que as células H1299 para ficar mais sensíveis ao resveratrol e responsivo a suas propriedades pro-apoptóticas, de forma semelhante às descobertas em células MCF-7. Os nossos resultados sugerem que a aplicação de resveratrol, em combinação com outros métodos de promover a actividade de p53 em células, tais como a terapia genética usando gene p53 do tipo selvagem ou produtos químicos que restaurar a função da p53, é uma nova estratégia terapêutica promissora para o tratamento do cancro.

Materiais e Métodos

1. Reagentes

Todos os reagentes utilizados neste estudo foram de grau analítico. Anexina V /iodeto de propídio kit de Ensaio de Apoptose, insulina bovina, MTT (brometo de 3,4,5-dimethiazol-2,5-difeniltetrazólio), óxido de phenylarsine, pifithrin-α, PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo), PRIMA-1, inibidores de protease cocktail (# 8340), e

trans- resveratrol

(3,5,4′-trihidroxi

trans

-estilbeno) foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). ácido ocadaico inibidor de BAX e péptido (V5) foi a partir de Roche Applied Science (Indianapolis, IN, EUA). Z-VAD-FMK [Z-Val-Ala-Asp (OMe) -CH2F] foi de Calbiochem (San Diego, CA, EUA). Z-LEHD-FMK foi de R D Systems (Minneapolis, MN, USA). DMEM (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco), meio RPMI-1640, penicilina e estreptomicina foram de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA).

2. Cultura celular

A linha de células de carcinoma humano da mama MCF-7 (p53 de tipo selvagem), linha celular de carcinoma do pulmão de não-pequenas humano H1299 (p53 negativa), adenocarcinomic alveolar basal A549 A linha celular epitelial humana (p53 de tipo selvagem ), e linha celular de carcinoma do pulmão de não-pequenas humano H460 (a p53 do tipo selvagem) foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA). As células MCF-7 foram cultivadas em DMEM contendo 1,0 g /L de glicose, suplementado com 2,0 g /L de HEPES, 3,7 g /L de bicarbonato de sódio, 10% de soro fetal bovino e 5 ug /ml de insulina bovina. H1299, A549 e células H460 foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 2,0 g /L de glicose, suplementado com 2,0 g /L de HEPES, 1,5 g /L de bicarbonato de sódio, e soro fetal bovino a 10%. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas e cultivadas como descrito anteriormente [32]. Penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /mL) foram adicionados a placas de cultura antes do tratamento com resveratrol. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2.

3. A viabilidade celular MTT redução ensaio

Células a 70-80% de confluência foram subcultivadas em uma placa de 24 poços e tratadas com

trans- resveratrol

diluídos em DMSO, durante 5 min, 24 h ou 48 h . O meio de cultura foi, em seguida, removido, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e foi adicionado 0,5 mg /ml de MTT. Após 3 h a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2, MTT foi cuidadosamente aspirado e o formazan produzido foi dissolvido com 0,4 M de ácido-isopropanol. Os controlos foram realizados por adição de 0,5% de DMSO para placas. A viabilidade celular foi medida como a diferença entre as absorções a comprimentos de onda de 570 nm versus 650 [33].

4. análise de transferência de Western

Para preparar extractos de células inteiras para Western blotting, o meio de cultura foi removido, e as células foram lavadas duas vezes com PBS e lisaram-se com azoto líquido num tampão contendo 5 mM de Tris-HCl pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM de Na

3VO

4, NaF 5 mM, óxido phenylarsine 1 mM, 1 uM de ácido ocadaico, PMSF 1 mM, e um cocktail de inibidor de protease. A concentração de proteína foi determinada como descrito por Lowry

et ai. (1951) [34], utilizando albumina de soro bovino como padrão. Os lisados ​​celulares (100 ug) foram resolvidas por SDS-PAGE (10%), e as proteínas separadas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF). As membranas foram bloqueadas durante a noite a 4 ° C em solução salina tamponada com Tris contendo 1% de Tween 20 (TBS-T) e 5% de leite desnatado e incubadas durante 2 h com o anticorpo primário (1:10000). Foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-p53 (DO-1), anti-MDM2 (D-7), e anti-GAPDH (0411) de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EUA) e anti-caspase 9 (# 9502), anti-caspase 7 (# 9492), anti-PARP (# 9542), anti-fosfo-Chk2 (Thr68) (# 2661), e anti-p21 (# 2946) a partir de Cell Signaling Technology (San Diego, CA, EUA). As membranas foram lavadas com TBS-T e incubadas com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase (1:5000) durante 1 h. bandas imunorreactivas foram visualizadas por um sistema ECL Western Blotting Detection (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) níveis nos lisados ​​de células foram usadas como controlo. A quantificação densitométrica das bandas foi realizada utilizando o software ImageJ, versão 1.43r (NIH, EUA).

5. Reverso reacção em cadeia com transcriptase-polimerase (RT-PCR)

Para a determinação semi-quantitativa da expressão de ARNm de p53, o ARN total foi extraído e purificado a partir de H1299 e células MCF-7 utilizando o kit de mini Illustra RNAspin (GE Healthcare , Buckinghamshire, UK), de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de RNA foram medidos usando um Espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). Em geral, 4 ug ARN total foi usada para a produção de ADNc com os seguintes iniciadores: p53 Fwd: 5′-GCT TCT TGC ATT CTG GGA CAG-3 ‘; Rev p53: 5’-CTT CTT TGG CTG GGG AGA GG-3 ‘(626bp); fwd GAPDH: ATC ACC ATC TTC CAG GAG GCG; rev GAPDH: CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG (574bp). A quantificação densitométrica das bandas foi determinada usando software ImageJ, versão 1.43r.

6. transfecção de células H1299

A de comprimento completo do plasmídeo p53-EGFP foi obtido a partir de Genscript Corp. (Piscataway, NJ, EUA). As experiências de transfecção transientes foram realizadas usando Fugene (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Para a análise de GFP-p53, as células foram plaqueadas em placas com fundo de vidro 48 h antes do início do tratamento. As células foram marcadas com 10 ug /ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) durante 30 min e lavadas três imes com PBS [35]. As imagens foram coletados por meio de um microscópio confocal (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha) e foram analisados ​​usando o programa de software Image Browser Zeiss LSM, versão 4,2,0121.

7. Anexina V /iodeto de propídio ensaio de apoptose

Células a 70-80% de confluência foram plaqueadas em pratos de 24 poços com fundo de vidro e os ensaios foram realizados utilizando a Anexina V /iodeto de propídio Apoptosis Assay Kit de acordo com as instruções do fabricante . As imagens foram coletados por meio de um microscópio confocal (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Para obter as imagens foram usados ​​os seguintes comprimentos de onda: anexina V-FITC (EX /EM ~488 nm /~540 nm) e iodeto de propídio (EX /EM ~495 nm /~635 nm). As imagens foram analisadas usando o programa de software Image Browser Zeiss LSM, versão 4,2,0121.

8. TUNEL ensaio

deoxinucleotidil terminal transferase mediada por marcação terminal dUTP nick (TÚNEL) foi realizada utilizando um kit de clique IT® TUNEL Alexa Fluor® Imagiologia Ensaio (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os controlos positivos foram obtidos pelo tratamento de células com desoxirribonuclease I, de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram analisadas utilizando um microscópio de fluorescência confocal (Carl Zeiss Internacional, Oberkochen, Alemanha). As imagens foram analisadas usando o Zeiss LSM Image Browser, versão 4,2,0121.

9. A análise estatística

Os resultados foram expressos como a média ± erro padrão da média (S.E.M.). A análise de dados e regressões não-lineares foram realizadas utilizando o programa de software SigmaPlot (v. 10,0, Systat Inc., CA, EUA) integrado com o programa SigmaStat (v. 3.2, Systat Inc. CA, EUA). Student

t

-test foi utilizado para comparar as médias, e

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

1.. Resveratrol reduz mama humano e a viabilidade celular do cancro do pulmão de tempo e dose-dependente forma

Porque p53 tem sido sugerido para desempenhar um papel nas propriedades anticancerígenas de resveratrol, que testou os efeitos citotóxicos do composto do presente MCF-7 do cancro da mama, cancro do pulmão A549 e linhas de células H460 do cancro do pulmão (que expressam p53 de tipo selvagem) e na linha de células deficientes em p53 não pequenas do cancro do pulmão H1299. Como esperado, a expressão de ARNm de p53 foi confirmada por RT-PCR nas linhas celulares de p53-positivos, mas não em células H1299 (dados não mostrados). Para testar se o resveratrol teve um efeito citotóxico, cada uma das linhas celulares foi cultivada com várias concentrações de resveratrol que variam de 10 a 500 uM durante 5 min, 24 h e 48 h. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de redução de MTT. Resveratrol reduzida MCF-7, A549, H460 e H1299 viabilidade celular em um tempo e modo dependente da dose (Fig. 1). A sensibilidade de células MCF-7, células A549 e H460 foi maior do que a de H1299, particularmente quando as células foram expostas durante 24 horas a concentrações de resveratrol mais elevados do que 100 uM. A exposição a 500 pM de resveratrol durante 24 ou 48 h reduziu a viabilidade das células MCF-7 para quase zero (Fig. 1A). perfis muito similares foram observados para células A549 e H460 (Fig. 1C e 1D). Em contraste, cerca de 50% e 20% das células H1299 permaneceram viáveis ​​às 24 e 48 h, respectivamente (Fig. 1B). O veículo DMSO (0,5%) não afectou a viabilidade das células de controlo (dados não apresentados). Também foram testados os efeitos do resveratrol em células mononucleares do sangue periférico (PBMC), uma linha celular transformada menos em comparação com as linhas celulares de cancro estudados. Resveratrol exibido um efeito não significativo na viabilidade de PBMC (Fig. S1), sugerindo que o efeito citotóxico deste composto é específico para linhas celulares de cancro

.

MCF-7 (A), H1299 (B), A549 (C), e células H460 (D) foram tratados com várias concentrações de

trans -resveratrol (10-500 uM) diluídos em DMSO, durante 5 min, 24 h e 48 h. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. A concentração final de DMSO no meio de cultura foi de 0,5%. Os resultados (n = 4) são expressos como uma% do valor de controlo, e os dados apresentados são a média ± S.E.M.

2. citotoxicidade em células MCF-7 induzida pelo resveratrol é mediada pela activação de p53

Os níveis celulares de p53 foram investigadas nas células tratadas com resveratrol MCF-7. As células foram expostas a várias concentrações de resveratrol durante 24 h, e os níveis de p53 e MDM2 foram determinados por análise de transferência de Western (Fig. 2A). O resveratrol a concentrações de 100 e 200 ^ M produziu um (

P

0,05) significativo aumento dependente da dose no nível total de p53. Este aumento não foi acompanhado por um aumento no nível celular de MDM2. A proporção de p53 /MDM2, como determinado por quantificação densitométrica revelou que os níveis elevados de p53 após a estimulação pelo resveratrol não foram acompanhadas por um aumento da degradação de proteínas mediada por MDM2. Os níveis de ARNm de p53 não se alterou quando as células MCF-7 foram tratadas com resveratrol nas mesmas condições experimentais (Fig. 2B), o que sugere que o aumento dos níveis celulares da proteína p53 não eram devidas a uma estimulação da expressão do gene p53.

Efeitos de resveratrol em p53 e os níveis de proteína MDM2 (a) e sobre os níveis de mRNA p53 (B) em células MCF-7. As células foram expostas a várias concentrações de resveratrol, ou DMSO (0,5%) durante 24 h. Os níveis de proteína foram determinadas por análise de transferência de Western como descrito em Materiais e Métodos. expressão de GAPDH foi usada como um controlo. Nos painéis A e B representam os dados 3-5 experiências independentes, e as intensidades de banda são representados graficamente com cada grupo de imagens. (C) a viabilidade das células MCF-7 na presença do inibidor pifithrin-α específico da p53. As células foram expostas a pifithrin 30 uM durante 1 h antes do tratamento com várias concentrações>

(50-200 uM). A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Os resultados (n = 3) são expressos como uma% do controlo, e os dados apresentados são a média ± S.E.M. *

p

. 0,05 em comparação com o respectivo controle (

t

-teste de Student)

não foi observado um aumento mediada pelo resveratrol dos níveis de p53 em que a exposição de células a este composto, durante 24 h foi seguida pela remoção de resveratrol a partir do meio de cultura por um período adicional de 24 h (dados não mostrados). A exposição das células MCF-7 a 200 uM resveratrol promoveu a fosforilação da proteína checkpoint-2 (Chk2, uma proteína envolvida em diversos processos celulares, incluindo a activação de p53 em resposta a danos no ADN) em Thr68 (Fig. 3A) e aumentaram a nível celular de p21, que é um dos principais genes p53-sensível (Fig. 3B).

Efeitos de resveratrol na fosfo-Chk2 (a) e nos níveis de proteína p21 (B) em células MCF-7. As células foram expostas a várias concentrações de

trans- resveratrol

ou DMSO (0,5%) durante 24 h. Os níveis de proteína foram determinadas por análise de transferência de Western como descrito em Materiais e Métodos. expressão de GAPDH foi usada como um controlo. Os dados são representativos de 3 expericias independentes, e as intensidades de banda são representados graficamente com cada grupo de imagens.

*,

p Art 0,05 em comparação com o respectivo controle (de Student

t

-teste)

Para determinar se MCF induzida pelo resveratrol. -7 morte celular é mediada pelo p53, o ensaio de redução de MTT foi realizada na presença de pifithrin-α, um inibidor específico da p53 que bloqueia a transcrição de genes p53-sensível e também bloqueia a apoptose mediada por p53 [36] (Fig. 2C ). As células foram expostas a pifithrin-α 30 uM durante 1 h e, em seguida, tratado com várias concentrações de resveratrol durante 24 h. Observou-se um maior número de células viáveis ​​nestas condições (Fig. 2C, barras cinzentas) do que na ausência de pifithrin-α (Fig. 2C, barras pretas), o que sugere o possível envolvimento de p53 na morte celular induzida pelo resveratrol.

investigou-se também os efeitos da PRIMA-1, uma droga p53 activador, nas linhas celulares de cancro de p53-positivos. PRIMA-1 a uma concentração de 100 uM reduziu a viabilidade celular, e a combinação da droga com 100 uM resveratrol potenciou o efeito citotóxico do resveratrol em células MCF-7, células A549 e H460 (Fig. 4).

as células foram expostas durante 24 h a 100? M

trans- resveratrol

, 100 uM PRIMA-1, ou 100? M

trans- resveratrol

mais 100 uM PRIMA-1 100? M. Os dados representam 3 ensaios independentes.

3. Resveratrol não induz a apoptose em células sem p53 H1299

Para testar se a morte das células MCF-7 induziu-resveratrol é mediada por apoptose, foi realizado um ensaio de iodeto de anexina V /propídio. Resveratrol, a 100 uM induzidas externalização fosfatidilserina (um processo que indica apoptose), como mostrado pelas células marcadas com anexina V na Figura 5. Este efeito foi abolida na presença de pifithrin-α, indicando que a apoptose mediada por p53 estava a ocorrer na células. células marcadas com iodeto de propídio não foram detectadas sob as mesmas condições. Um ensaio de TUNEL foi também realizada em células MCF-7 e H1299. morte celular por apoptose induzida pelo resveratrol foi observada em células MCF-7, mas não em células H1299 (Fig. 6). apoptose em células MCF-7 induzida pelo resveratrol foi acompanhada por uma clivagem proteolítica significativa da caspase 9 e caspase 7 (Fig. 7A). Poli (ADP) ribose polimerase foi clivada em dois pequenos fragmentos por exposição a concentrações crescentes de resveratrol. Nenhuma activação de caspases 9 e 7 foi detectada em células H1299 p53-negativa (Fig. 7B). Para testar a possibilidade de que a morte celular induzida pelo resveratrol é mediada por caspase vias de sinalização em células MCF-7, mas não em H1299, foi realizado um ensaio de redução de MTT na presença do inibidor de caspase Pan Z-VAD-FMK (Fig. 4C). As células foram expostas a 50 uM de Z-VAD-FMK durante 1 h e, em seguida, tratado com várias concentrações de resveratrol durante 24 h. O número de células MCF-7 viáveis ​​foi significativamente maior na presença de 100 ou 200 resveratrol uM (Fig. 7C, barras cinzentas) do que na ausência de inibidor (Fig. 7C, barras pretas), sugerindo que as caspases estão envolvidas em resveratrol morte celular induzida. Z-VAD-FMK não afectou a viabilidade das células H1299 sob as mesmas condições. O possível envolvimento de caspases também foi investigado usando a caspase 9 específico do inibidor Z-LEDH-FMK. MCF-7, mas não H1299 apresentaram maior porcentagem de células viáveis ​​em comparação com o controle na presença de Z-LEDH-FMK (Fig. S2).

As células foram tratadas com

trans-

resveratrol (100 uM) ou DMSO (0,5%) e ensaiaram-se utilizando o Anexina V /iodeto de propídio Apoptosis Assay kit (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Numa experiência, as células foram expostas a pifithrin 30 uM durante 1 h antes do tratamento com

trans

-resveratrol. As imagens foram recolhidas por microscopia confocal (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Anexina V-FITC: EX /EM ~488 nm /~540 nm; e iodeto de propídio fluorescência: EX /EM ~495 nm /~635 nm. Cada imagem mostrada é representa dois experimentos independentes.

As células foram tratadas com

trans-

resveratrol (100 M) e rotulados com um clique-it® TUNEL Alexa Fluor® imagem Ensaio kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). TUNEL fluorescência: EX /EM ~495 nm /519 nm. Cada imagem representa duas experiências independentes.

(A) Activação de caspase 9, caspase 7, e PARP pelo resveratrol em células MCF-7. (B) Os níveis de caspase 9 e caspase 7 em H1299 células expostas ao resveratrol. Para a análise de transferência de Western, as células foram expostas a várias concentrações de resveratrol. Os dados representam 3-4 experimentos independentes, e as intensidades das bandas são representados graficamente com cada grupo de imagens. As células MCF-7 e H1299 (C) foram pré-incubadas com 50 uM do inibidor de caspases Z-VAD-FMK durante 1 h antes do tratamento com várias concentrações de

trans

-resveratrol. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Os resultados (n = 3) são expressos como% do controlo, e os dados apresentados são a média ± S.E.M. *

p Art 0,05 em comparação com o respectivo controle (de Student

t

-teste)

Nós examinamos o possível envolvimento de Bax no resveratrol-. apoptose de células MCF-7 induzida através da medição dos níveis celulares de esta proteína e por aplicação de um inibidor específico da Bax péptido (V5) após o tratamento de células com resveratrol. Observou-se níveis mais elevados Bax em células tratadas com 100 uM resveratrol e os números mais elevados de células viáveis ​​na presença de V5, sugerindo o envolvimento desta proteína pro-apoptótica em células MCF-7 a cascata de sinalização celular morte (Fig. S3).

4. células H1299 requer p53 de sofrer apoptose em resposta ao resveratrol exposição

Para determinar se a expressão de p53 em células H1299 faz com que as células se tornam susceptíveis aos efeitos de resveratrol, realizamos ensaios de transfecção transiente de p53 de tipo selvagem plasmídeo -GFP. Um ensaio de MTT foi realizado em H1299 transf ectadas com a p53 para testar a citotoxicidade de resveratrol nestas células. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com 100 uM de resveratrol durante um adicional de 24 h. O efeito citotóxico do resveratrol sobre as células H1299 foi melhorado (isto é, as células tornaram-se mais susceptíveis a este composto) através de expressão da p53 (Fig. 8A). Os efeitos do resveratrol em células H1299, bem como sobre as células MCF-7 parecem ser dependentes da função de p53 de tipo selvagem. A transfecção transiente de p53-GFP desencadeada apoptose induzida por resveratrol em H1299 (Fig. 8B). A taxa de eficiência de transfecção obtida nestas experiências foi de aproximadamente 60% (Fig. 8C). imagens fundidas a partir de microscopia de fluorescência (Fig. 8D) indicam que a maior parte das células transfectadas com p53 foram submetidos a apoptose (setas brancas).

(A) transfectadas com p53 e não-transfectadas células H1299 foram tratadas com resveratrol ( 100 uM). A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Os resultados (n = 4) são expressos como% do controlo, e os dados apresentados são a média ± S.E.M. *

p Art 0,05 em comparação com o respectivo controle (de Student

t

-teste). (B) As células foram transfectadas transientemente com o plasmídeo de comprimento completo de p53-EGFP e tratadas com resveratrol (100 uM). As células foram então duplamente marcada com Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) e com o Click-IT® TUNEL Alexa Fluor® Imagiologia Ensaio (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). fluorescência Hoechst: EX /EM ~350 nm /461 nm. TUNEL fluorescência: EX /EM ~495 nm /519 nm. Nas imagens fundidas, as setas indicam a morte celular das células transfectadas com p53. (C) A taxa de eficiência de transfecção para células H1299. (D) A quantificação da apoptose e não-apoptótica transfectadas H1299 células após a exposição ao resveratrol.

Discussão

Neste estudo, nós examinamos os efeitos do resveratrol sobre a p53 deficiente a linha não-pequenas humano cancro do pulmão de células H1299 em comparação com os efeitos do resveratrol sobre linhas de células de cancro (cancro da mama humano MCF-7, células do cancro do pulmão A549 e H460) que expressam p53 de tipo selvagem. A hipótese testada foi que a transfecção p53 em células H1299, que carregam um gene p53 parcialmente eliminado, faz com que essas células capazes de responder ao resveratrol propriedades pró-apoptóticos. MCF-7, células A549 e H460 foram encontrados para ser mais sensíveis aos efeitos citotóxicos do que induzida pelo resveratrol eram células H1299. O resveratrol induziu a apoptose mediada por caspases em células MCF-7, mas não em células H1299, e transfecção transiente de p53 de tipo selvagem rendeu H1299 susceptíveis aos efeitos pró-apoptóticos de resveratrol.

H1299 células foram mais resistentes ao resveratrol , particularmente em concentrações elevadas, do que foram as linhas celulares de cancro de p53-positivos. A ausência da expressão da p53 em H1299 pode ser responsável pela sua maior resistência à morte celular em comparação com as células p53-positivo MCF-7. H1299 não sofrem apoptose após a exposição ao resveratrol, em contraste com células MCF-7. Outros mecanismos de morte celular pode ser relacionado a este efeito;

por exemplo

., Um estudo recente indicou que o resveratrol desencadeia uma interacção de processos que ocorrem durante a apoptose, a paragem do ciclo celular, e autofagia em células tumorais [37].

citotoxicidade induzida pelo resveratrol e apoptose foram mediadas, em parte, pela p53 em células MCF-7, como indicado pelas experiências realizadas de viabilidade celular na presença do inibidor pifithrin-α específico da p53. Os níveis endógenos de proteína p53 foram significativamente mais elevada na presença de resveratrol, que está de acordo com outros relatórios [38], [39]. No presente estudo, o aumento dos níveis de p53 não foi seguida por um aumento nos níveis de MDM2, sugerindo que a relação de alta p53 /MDM2 reflectiu um nível de degradação de p53 dependente de ubiquitina inferior, provavelmente como resultado de mecanismos de estabilização que operam na proteína .