Abstract

Fundo

O receptor da vitamina D (VDR) via é importante na prevenção e, potencialmente, no tratamento de diversos cancros. Um importante mecanismo de acção VDR está relacionada com a sua interacção com a via /β-catenina Wnt. VDR ligado a agonista inibe a via /β-catenina /TCF oncogénica de Wnt por interagir directamente com β-catenina e em algumas células, aumentando a expressão de caderina que, por sua vez, recruta β-catenina à membrana. Aqui nós identificamos TCF-4, um parceiro de transcrição regulador e β-catenina de ligação como um alvo indireta da via VDR.

Metodologia /Principais Achados

Neste trabalho, mostramos que TCF- 4 (nome do gene TCF7L2) é reduzida na glândula mamaria do rato de abate VDR, em comparação com o rato do tipo selvagem. Além disso, mostramos 1,25 (OH)

2D

3 aumenta TCF-4 nos níveis de RNA e proteína em várias linhas celulares de cancro colo-rectais humanos, o efeito dos quais é completamente dependente do VDR.

In silico

análise dos promotores TCF7L2 rato humanos e identificou vários elementos de ligação VDR putativos. Embora TCF7L2 repórteres de promotores respondeu a VDR exógeno, e 1,25 (OH)

2D

3, ensaios de mutação e análise de imunoprecipitação da cromatina, demonstraram que o aumento em TCF7L2 não requer o recrutamento do VDR para os elementos identificados e indica que a regulação por VDR é indireta. Isto é ainda confirmado pela exigência de

de novo

síntese de proteínas para este aumento da regulação.

Conclusões /Significado

Embora seja geralmente assumido que a ligação de β-catenina para os membros da família TCF /LEF é cancro de promoção, os estudos recentes têm indicado que TCF-4 funciona no seu lugar como um repressor transcricional que restringe o crescimento celular de mama e cancro colo-rectal. Por conseguinte, conclui-se que a 1,25 (OH)

2D

3 /aumento mediada por VDR em TCF-4 pode ter um papel protetor no câncer de cólon, bem como diabetes e doença de Crohn.

Citação: Beildeck ME, Islam M, Shah S, Welsh J, Byers SW (2009) Controle de TCF-4 Expressão por VDR e vitamina D nas linhas celulares mouse glândula mamária e câncer colorretal. PLoS ONE 4 (11): e7872. doi: 10.1371 /journal.pone.0007872

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de maio de 2009; Aceito: 14 de outubro de 2009; Publicação: 17 de novembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Beildeck et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. R01- CA-129-813 (SWB); DoD CDMRP Award Predoctoral Estágio: W81XWH-06-1-0786 (MEB) https://cdmrp.army.mil/bcrp/default.htm; Instalações núcleo Grant: NIH P30 CA51008 (LCCC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a activação da via da vitamina D tem sido associada com uma diminuição do risco para o desenvolvimento e progressão de muitas cancros (revisto em [1]). Embora os estudos epidemiológicos são menos claras em relação à associação do risco de câncer com os níveis séricos de vitamina D e seus metabolitos, biologia molecular e estudos animais apoiam um papel para a vitamina D no aumento da apoptose e diferenciação celular, e diminuiu o crescimento celular. Como a vitamina D é um composto que está disponível na dieta (embora insuficientemente) como um suplemento, ou prontamente sintetizados pelo organismo, é um candidato atraente para quimioprevenção e quimioterapia. O seu benefício clínico nesta capacidade, no entanto, é inibida por hipercalcemia limitante da dose, o efeito adverso que se desenvolve a partir do papel primário da vitamina D na homeostase do cálcio. Num esforço para utilizar vitamina D na clínica como um agente anti-cancro, têm sido feitos esforços para gerar análogos da vitamina D que resulta em hipercalcemia reduzida. Enquanto estes análogos têm mostrado grande promessa

in vitro

e em modelos animais, eles ficam aquém em evocar uma resposta equivalente na clínica. Além disso, um análogo de sucesso pode representar um problema particular no contexto do câncer colorretal, a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em homens e mulheres em os EUA. Apesar de a evidência para a vitamina D, tal como um agente anti-cancro neste órgão é particularmente forte, o tracto GI está intimamente envolvido na mediação dos efeitos da vitamina D sobre a homeostase do cálcio. Isto indica que no cólon, pode ser difícil separar os anti-câncer e cálcio efeitos homeostáticos de vitamina D. Embora, em outros estudos que mostram que alguns antagonistas parciais de vitamina D irá ativar o receptor da vitamina D em células que expressam níveis elevados de β-catenina activadas (células de cancro), mas não em células normais e podem ter o potencial para fazer isso [2].

receptores de hormonas nucleares podem influenciar a cascata de sinalização de Wnt canónica, interagindo com β-catenina [3 ]. Este fenómeno pode ser particularmente relevante no câncer de cólon, onde 80% dos casos são um porto de mutações APC que aberrante ativar β-catenina [4], levando ao acúmulo de activado β-catenina no núcleo (Avaliado em [5]). Dentro do núcleo, β-catenina é responsável pela co-activação da transcrição de genes cujos promotores são ocupados por membros da família TCF /LEF de factores de transcrição. Alguns destes genes tais como

c-myc

[6] e

A ciclina D1-

[7], estão envolvidos na regulação do ciclo celular e pode contribuir para um fenótipo oncogénico. O tratamento de células com alguns agonistas (mas não todos) do receptor da hormona nuclear (NHR) faz com que uma sobre-regulação de genes NHR-responsivos ao mesmo tempo causando simultaneamente uma diminuição no TCF /β-catenina de transcrição do gene alvo. Isto tem sido atribuído à ligação competitiva entre TCF e NHRS para β-catenina [3], [8] – [11], e /ou co-activadores comuns, tais como p300 [2]. Um segundo modo de inibição da transcrição de Wnt gene alvo tem sido atribuído à prevenção de translocação nuclear β-catenina por recrutamento de citoplasmática β-catenina para junções aderentes [9], [12], [13]. Em terceiro lugar, há provas de que NHRS se ligam a membros da família de TCF /LEF, directamente, e deste modo inibir a transcrição de TCF /β-catenina genes responsivos [14] – [18]. Este é provavelmente devido ao recrutamento de co-repressores tais como TLE (Groucho) [19], NCoR e SMRT [20].

Aqui nós relatamos um mecanismo adicional de interação entre a via β-catenina e da vitamina receptor D (VDR) via. Para clarificar, utilizaremos a seguinte nomenclatura: TCF7L2 no contexto de plasmídeos, DNA e RNA, e TCF-4 no contexto de proteína, somente. Descobrimos que TCF-4 é expresso diferencialmente em células derivadas de tumores mamários de rato induzidos por DMBA de VDR de tipo selvagem e ratinhos knock out, e o mamária-se glândulas. Uma exploração mais profunda revelou um dependente de VDR-regulação de TCF7L2 no mRNA e os níveis de proteína por tratamento com 1,25 (OH)

2D

3 em células Caco2. Análise do promotor TCF7L2 rato e humano foram identificados vários elementos de ligação putativo do receptor de vitamina D proximal ao local de início da transcrição. Embora a clonagem desta região promotor revelou regulação pelo VDR /1,25 (OH)

2D

3, a análise de mutações subsequente, imunoprecipitação da cromatina e experiências de síntese de inibição da proteína indicam que este efeito é provavelmente transmitida indiretamente, através de um VDR /1,25 (OH)

2D

intermediário 3-sensível. Aumentos nos TCF-4 traduzir níveis de proteína ao aumento da actividade TopFlash após 24 horas de tratamento ligando em células Caco2. Propomos um mecanismo pelo qual este efeito pode inibir a actividade oncogénica

em cellulo

.

Resultados

glândulas mamárias de ratos VDR Knockout têm menos TCF-4 de glândulas mamárias de VDR selvagem -tipo Mice

VDR145

+ /+ e VDRK240

– /- linhas de células são derivadas de rato tumores mamários induzidos por DMBA de tipo selvagem (WT) e ratos VDR knockout (KO), , respectivamente, e foram descritos anteriormente [21]. VDR ratinhos KO são mais susceptíveis à mamária induzida por carcinogénico e cancerígenas do cólon, bem como de outras lesões [22], [23]. As experiências preliminares indicaram que TCF-4 foi mais abundante em células do que as células WT KO (não mostrado). Foram realizadas análises de Western Blot para TCF-4 e confirmou que VDRK240

– /- células têm níveis muito baixos de TCF-4 em comparação com VDR145

células + /+ (Figura 1A). Nós próxima realizado um ensaio de pull-down no qual foram utilizados dois proteínas de fusão β-catenina marcado com GST. WT GST-marcado β-catenina se liga TCF /lefs via região de repetição do tatu, enquanto GST-dTCF-β-Gato, que abriga mutações nos resíduos 253, 312, e 435 na região tatu, tem afinidade drasticamente reduzida para TCF /lefs [24]. Consistente com os dados de Western blot, a proteína de fusão WT puxado para baixo mais TCF-4 a partir de VDR145

+ /+ do que a partir de lisados ​​VDRK240

– /- lisados. A proteína de fusão mutante puxado para baixo muito menos TCF-4 a partir do VDR145

+ /+ células e nenhum do VDRK240

– /-. As células (Figura 1B)

(A) Western blot de lisados ​​de células inteiras, em duplicado, de VDR145

+ /+ (VDR + /+) células (pistas 1 e 2) e VDRK240

– /- (VDR – /-) células (pistas 3 e 4) sondadas para TCF-4, VDR e GAPDH. (B) Pull-down de proteínas em VDR + /+ e VDR – /- lisados ​​com construções de β-catenina GST-marcado e sondado para TCF-4. GST-WT-β-catenina (GST-β-gato) é usado nas pistas 1 e 2. Mutante β-catenina que não se ligam eficazmente proteínas TCF /LEF (GST-dTCF-β-gato) é usado nas pistas 3 e 4. Beads só são usados ​​em pistas 5 e 6. (C) OT atividade no VDR + /+ e VDR – /- células transfectadas com

Renilla Comprar e VP16-β-catenina. Os dados são normalizados para

Renilla

. As barras de erro representam SEM. Os valores de p representar o teste t de Student para as diferenças entre significan linhas celulares. RLU: unidades relativas de luz (D) na OT actividade VDR + /+ e VDR – /- células transfectadas com

Renilla

, VP16-β-catenina e com ou sem um plasmídeo TCF7L2. As barras de erro representam SEM. As estatísticas são t de Student para as diferenças entre células transfectadas e transfectadas de controle. * P 0,05; *** P 0,0005. (E) tecidos da glândula mamária de VDR WT (painéis superiores) e VDR KO (painéis inferiores) ratos corada para TCF-4 apresentados em três ampliações.

A seguir, usou o OT /OF sistema repórter ensaio de actividade /β-catenina TCF nestas células. O repórter OT contém três conjunto TCF /LEF elementos de ligação a montante de um gene luciferase e o repórter de controle correspondente (OF) sofreu uma mutação sítios de ligação TCF e representa ligação de fundo. Uma vez que estas células têm baixa actividade β-catenina endógena, VP16-β-catenina foi co-expressa com os vectores repórter em todas as amostras. Consistente com os níveis reduzidos de TCF-4, VDRK240

– /- células teve menos actividade β-catenina que VDR145

+ /+ células (Figura 1C). Esta diferença foi significativa, embora não seja grande e indica que VDRK240

– /- células de outros membros da família TCF que podem compensar TCF-4, e /ou os baixos níveis de TCF-4 que permanecem nestas células é suficiente para a activação , pelo menos no contexto de níveis elevados de β-catenina activada [25], [26]. A co-transfecção com TCF7L2 exógeno resgatado a actividade β-catenina reduzida na VDRK240

– /- células (Figura 1D). Para determinar se este fenômeno também estava acontecendo

in vivo

, nós manchado tecidos mamários normais de VDR WT e ratos VDR KO para TCF-4. Em concordância com o resto dos dados da Figura 1, tecidos mamários de animais WT VDR têm uma coloração mais proeminente em comparação com tecidos mamários de animais KO VDR (Figura 1E). TCF-4 coloração não está completamente ausente em glândulas mamárias VDR KO, embora seja muito menos freqüente e menos intensa (Figura 1E, painel inferior direito).

CYP24A1 é a melhor caracterizada, alvo a jusante da vitamina pathway D e seu mRNA é extremamente sensível aos agonistas VDR. CYP24A1 está envolvido no metabolismo de compostos de vitamina D activa em metabolitos inactivos. Atividade do repórter CYP24A1 estava ausente e não foi afectada por 1,25 (OH)

2D

3 em VDRK240

– /- células, mas foi restaurada após a transfecção de VDR (Figura 2A). Colectivamente, estes dados mostram que as células que são nulo para o VDR têm menores níveis basais de TCF-4 e que este diminui a actividade β-catenina no nosso modelo mamária VDR-nulo.

(a) Actividade CYP24-Luc em VDRK240

– /- (VDR – /-) e VDR145

+ /+ (VDR + /+), as células que foram transfectadas com GFP ou VDR e tratados com 10

-7 H 1,25 ( OH)

2D

3 ou EtOH-controlo durante 24 horas como indicado. RLU = unidades relativas de luz. (B) Análise por PCR de Transcriptase Reversa de CYP24A1 rato (painel superior), rato e VDR humano (painéis meio) e transcritos em resposta à expressão exógena VDR humano e 1,25 (OH)

2D β-actina (painel inferior)

3 tratamento tal como descrito na parte A. (C) Várias linhas celulares de cancro colorrectal foram incubadas durante 24 horas em 10

@ 7 M de 1,25 (OH)

2D

3 ou EtOH, conforme indicado. As proteínas celulares foram ensaiadas quanto à expressão de TCF-4 (painel superior) e de GAPDH foi monitorizada durante o carregamento igual Lane (painel inferior). Ambos os TCF-4 bandas representam diferentes isoformas de TCF-4 que têm diferentes comprimentos C-terminais. (D) Células Caco2 foram transfectadas com quantidades diferentes de VDR ou ARNsi durante 24 horas e tratada com 10

@ 7 M de 1,25 (OH)

2D

3 ou EtOH durante 24 horas subsequentes, conforme indicado, e sondaram-se por TCF-4. NT: não-alvo. análise (E) densitométrica de três Western blot, conforme indicado na parte A. Os dados foram plotados em relação a cada controlo tratados com EtOH. Os valores de p foram gerados por um-tailed t-teste: * p 0,05; ** P 0,005; *** P .0005 (F) Células Caco2 foram transfectadas durante 24 horas com VDRE-Luc,

Renilla

e ARNsi e tratou-se para 24 horas subsequentes com 10

-7 H 1,25 ( OH)

2D

3 como indicado. RLU: unidades relativas de luz. células Caco2 (g) foram transfectadas com ARNsi durante 24 horas e tratou-se por 24 horas subsequentes com 10

@ 7 M de 1,25 (OH)

2D

3 ou EtOH como indicado. CYP24A1 transcrições foram analisadas por qPCR. Os dados são normalizados para a expressão GAPDH e plotados em relação a cada controlo EtOH.

VDR /1,25 (OH)

2D

3 Regula mRNA TCF7L2 e Proteína em linhas celulares de cancro colorrectal

A seguir transfectadas VDRK240

– /- células com VDR humano e descobriram que TCF-4 proteína e mRNA TCF7L2 não foram afectadas pela VDR ou 1,25 (OH)

2D

3 (Recurso Figura S1A e S1B). Notavelmente, mesmo que a actividade do repórter CYP24A1 era sensível à exógeno VDR e 1,25 (OH)

2D

3 nestas células (Figura 2A), como TCF7L2,

CYP24A1 ARNm endógeno

não era, apesar de otimização de transfecção que nos permitiu alcançar 60% de eficiência (Figura 2B). Estes dados indicam que VDRK240

– /- apresentam alterações células de longa vida em a capacidade de genes alvo endógenas para responder à restauração transiente de VDR. Como exogenamente expressas promotores são sensíveis, este é provavelmente um resultado de mudanças na organização da cromatina, que não pode ser revertida através da expressão de curto prazo de VDR e o tratamento com 1,25 (OH)

2D

3.

por conseguinte, para determinar ainda mais os efeitos de VDR e o seu ligando clássica em TCF-4 expressão, que ensaiado várias linhas celulares de cancro colorrectal para alterações na expressão de TCF-4 em resposta a 1,25 (OH)

2D

3 (Figura 2C, Recurso Figura S2). Apesar de todas estas células o aumento da expressão de TCF4 em resposta à vitamina D optou-se por utilizar a linha celular de adenocarcinoma colo-rectal humano, CaCo2 por várias razões. Estas células são bem estudado no contexto da sinalização de vitamina D e o seu crescimento é inibido por 1,25 (OH)

2D

3 [27]. Além disso, eles são um sistema único que imita epitélio intestinal normal, uma vez que eles se tornam confluentes se diferenciam em cultura [28]. Estas células expressam também VDR, mas em níveis baixos (isto é, normais) em relação a várias outras linhas celulares de cancro do cólon [29], [30]. O tratamento de células confluentes com Caco2 10

@ 7 M de 1,25 (OH)

2D

3 com ou sem transfecção de VDR conduzir a um aumento forte e estatisticamente significativa na proteína TCF-4 (Figura 2D e E). Os efeitos da 1,25 (OH)

2D

3 são modestamente potenciado pelo RVD exógeno e esta é provavelmente uma subestimativa, uma vez que apenas 50-60% das células são transfectadas. Mais importante ainda, o aumento no TCF-4 induzida por 1,25 (OH)

2D

3 é absolutamente dependente da VDR, como seu knockdown inibe não só os efeitos da 1,25 (OH)

2D

3 sobre a actividade de um promotor repórter VDRE e na indução de ARNm de CYP24A1, mas também no TCF-4-indução (Figura 2D-G). Em contraste com VDRK240

– /- (células Suplementar Figura S1B), TCF7L2 e CYP24A1 mRNAs foram aumentadas por 1,25 (OH)

2D

3 em CaCo2 células (Figura 3A). Ambos TCF7L2 e níveis CYP24A1 foram elevados após 4 horas com TCF7L2 atingir uma indução máxima às 24 horas (Figura 3B). Este regulamento também está sujeito a densidade de células, como as diferenças estatisticamente significativas na mRNA TCF7L2 são vistos apenas com maior densidade (Recurso Figura S3). Este pode ser análoga aos efeitos potenciou modestamente de VDR exógeno sobre a 1,25 (OH)

2D

3-mediada aumento de TCF-4 (Figura 2E), como células Caco2 são conhecidos para regular VDR sobre confluência /diferenciação [31].

(a) análise de qPCR de células Caco2 transfectadas e tratados como descrito na Figura 2D e 2E. TCF7L2 (painel esquerdo) e CYP24A1 (painel direito) transcrições. Os dados estão normalizados para GAPDH e representados graficamente em relação a cada um controlo tratado com EtOH. Os valores de p são derivados de comparação o teste t de estudante entre EtOH e sub D

3 controlos: * P 0,05; **; p 0,005; *** P 0005 (B) células Caco2 foram tratados em momentos diferentes com 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 até 48 horas antes da coleta. ARNm para TCF7L2 (painel da esquerda) e CYP24A1 (painel da direita) foi ensaiada por qPCR. Os dados foram normalizados para GAPDH e representada graficamente como a mudança vezes em relação ao ponto de tempo 0 Hr. Os valores de p foram obtidos a partir do teste t de estudante, em comparação com 0 Hr ponto de tempo: * p 0,05; **; p 0,005; *** P . .0005

VDR /1,25 (OH)

2D

3 regula a atividade do TCF7L2 Promotor em mamário de ratinho e células de câncer colorretal humano

Desde TCF7L2 é regulada por 1,25 (OH)

2D

3 ao nível do ARNm em células Caco2, que examinou o rato e os genes humanos TCF7L2 aproximadamente 4000 pares de bases a montante do local de início da transcrição para a presença de meios locais que conformam com o consenso RGKTSA VDRE (R = a ou G, K = G ou T; S = G ou C), ou meias-sites que se desviam um pouco a partir do consenso, mas que têm sido descritos como VDRE funcional meios locais na literatura. Foram identificados vários VDREs putativos codificados na promotor TCF7L2 de ambos o gene humano e do rato (Tabela Suplementar S1 [32] – [41]). Uma vez que o rato e o promotor partes TCF7L2 humano mais do que 80% de identidade de sequência nos primeiros ~2000 pares de bases, que clonado duas porções do promotor de rato em uma construção de luciferase (Figura 4A). Um repórter, -1037-Luc, contém a região entre +522 e -515 pares de bases relativamente ao local de iniciação da transcrição e contem o 5 ‘UTR e a caixa TATÁ a -25 previu pares de bases. O repórter -2068-Luc abrange a região entre 430 e -1542 relativamente ao local de início da transcrição. Os nomes de plasmídeo e VDREs subsequentemente mencionados referem-se à distância a partir do codão de iniciação e não o local de início da transcrição uma vez que locais de início da transcrição do banco de dados variam. As meias-sites dos -187 /-177 DR4 elementos, (duas meias-sites hexam�ica dispostos como repetições diretas espaçados por quatro nucleotídeos) compartilham um meio de sites entre eles.

(A) promotor TCF7L2 Rato dois constructos foram clonados a montante de um repórter de luciferase. Os quatro locais putativos VDRE relativamente ao local de início da tradução está indicado, e todas as VDREs são codificados na cadeia não codificante. Os -177 e -187 VDREs são sobrepostas e compartilhar uma meia-local entre eles. O construto -1037 (-1037-Luc) contém a região de -1 a -1037 em relação ao local de início da tradução e possui a -177 /-187 VDRE, somente, enquanto o repórter -2.068 (-2.068-Luc) contém o região entre -96 e -2068 em relação ao local de início da tradução do promotor do rato TCF7L2, e possui todas as quatro VDREs putativos. (B) As células Caco2 foram transfectadas durante 24 horas com

Renilla

e repórteres como indicado, bem como diferentes quantidades de p53. Os dados são normalizados para

Renilla Comprar e à expressão repórter vazio. RLU = unidades relativas de luz. (C) -1038-Luc ou construções de vector vazio foram transfectados em células Caco2 com

Renilla Comprar e diferentes quantidades de VDR, como indicado. 24 horas após a transfecção, as células foram tratadas durante mais 24 horas com 10

@ 7 M de 1,25 (OH)

3 ou de controlo de veículo 2D EtOH. As barras de erro representam SEM. As estatísticas foram derivadas a partir de ANOVA de duas vias para diferenças entre EtOH- e 1,25 (OH)

2D

3 sub-amostras tratados: * p 0,05; **; p 0,005; *** P 0,0005. (D) As células foram transfectadas Caco2, tratados e analisados ​​como na parte C usando -2068-Luc, em vez de -1038-luc. As estatísticas foram gerados por ANOVA de duas vias para diferenças significativas entre a quantidade de VDR transfectadas: *** p 0,0005. As barras de erro representam SEM. RLU:. Unidades relativas de luz

Reporter -1037-luc contém apenas o primeiro VDRE putativo, composto, enquanto o repórter -2068-luc contém todos os quatro VDREs. p53 diminui a actividade de um repórter TCF7L2 humano e verificou-se que a p53 também inibiu a actividade tanto -2068-Luc e repórteres de ratinho-luc -1037 [42], [43] (Figura 4B). Além disso, a actividade basal do repórter -2068-Luc foi marcadamente menos do que o repórter -1037-Luc indicando a presença de um elemento repressor forte nesta região (Figura 4B). Em células Caco2, o construto -1038-Luc responde modestamente, mas de forma significativa, para a adição do ligando, mas o efeito não foi potenciado pelo RVD exógena (Figura 4C, painel esquerdo). Em contraste, -2068-Luc responde fortemente ao VDR exógeno, mas não com o tratamento com 1,25 (OH)

2D

3 em CaCo2 e VDRK240

– /- células (Figura 4C, o painel direito e suplementares Figura S4A, respectivamente). Estes dados indicam que VDR e o tratamento com 1,25 (OH)

2D

3 influencia a atividade do promotor TCF7L2 mas eles não demonstram que o efeito é direto.

putativo VDREs dentro do rato TCF7L2 promotor não são importantes para a regulação por VDR em mamário de ratinho e células de câncer colorretal Humanos

para testar a hipótese de que os VDREs putativos foram importantes para transmitir a resposta do promotor TCF7L2 ao VDR, a terceira e quarta nucleótidos dentro de cada metade do local foram mutados para resíduos de alanina duplo (Figura 5A). metade do local 5 ‘de -187 não foi mutada desde o local 3’half-se este VDRE é compartilhada com -178 VDRE, e foi mutado em que o construto. Estas mutações alteram os meios locais de tal forma que eles não se conformam com a sequência de consenso VDRE, e não deve vincular VDR. As mutações foram geradas de tal modo que cada VDRE (contendo dois semi-sítios, cada) foi mutado em todas as sete combinações possíveis de mutações únicas, duplas mutações, e uma mutação tripla. A transfecção destas construções revelou que retinham a capacidade de resposta ao VDR exógeno em células Caco2 e VDRK240

– /- (Figura 5B e Figura S4B complementar, respectivamente). A seguir, realizados ensaios de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) para testar o recrutamento do VDR para os seis VDREs putativos identificados no promotor TCF7L2 humana (Figura 5C). células Caco2 foram semeadas a uma densidade elevada e tratou-se durante 4 horas com 10

@ 7 M de 1,25 (OH)

2D

3. Tanto o receptor de retinóide X (RXR) e o VDR foram recrutados para as VDREs publicados sobre o promotor CYP24A1 (Figura 5D, as pistas 1 e 2), no entanto, nem NHR foi recrutado para qualquer um dos VDREs putativos na região promotora TCF7L2 humano. Estes dados sugerem que o aumento na expressão TCF7L2 não é devido ao recrutamento do VDR a estes VDREs putativos no rato e promotores TCF7L2 humanos. Isto poderia significar que o VDR está sendo recrutados para outras regiões do genoma e controlar a transcrição de TCF7L2 diretamente, ou o VDR está regulando este fenómeno através de um 1,25 (OH)

2D

intermediário 3-sensitive .

(a) representação gráfica dos quatro VDREs putativos dentro dos primeiros ~1500 pares de bases do promotor do rato TCF7L2 e as suas sequências. DR3: repetição directa intercaladas por três nucleotídeos. 2xDR4: dois, repetições directas sobrepostas intercaladas por quatro nucleótidos. Embora os VDREs putativos são codificados na cadeia não codificante, as suas sequências são escritos em sentido inverso pelo complemento de tal modo que as VDREs pode ser identificado como estando em conformidade com o consenso RGKTSA. (B) construto -2068-Luc que contém todos os três conjuntos de mutações metade do local (d1502 /d1153 /D177) foi transfectado em células Caco2 e tratada com ligando, como descrito na Figura 4C com apenas três concentrações de VDR (baixa, média e alta ). As barras de erro representam SEM. Estatísticas representam análise utilizando ANOVA de duas vias: * p 0,05. Unidades de luz RLU-Relativa. (C) Representação dos seis VDREs putativos identificados dentro de 4000 pares de bases a montante do local de início da transcrição da região do promotor TCF7L2 humano e são nomeados em relação à sua distância a partir do local de início da tradução (+ sendo a jusante, e estar a montante). Todas as regiões (88, excepto marcados com) são codificados na cadeia não codificante. (D) Cromatina imunoprecipitação de VDR e fragmentos de DNA RXR-bound a partir de células Caco2 tratados durante 4 horas com 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 (pistas D-de numeração par) ou EtOH (lanes e-ímpar). As regiões que amplificam-VDRE contendo regiões são indicadas na parte superior das pistas. O produto CYP amplifica uma região do promotor de CYP24A1 humano que se sabe ligar-VDR e de RXR na presença de ligando e serve como um controlo positivo. IgG representa a amplificação não específica. Entrada demonstra material equivalente utilizado em cada amostra.

Regulamento do TCF7L2 por VDR /1,25 (OH)

2D

3 é susceptível mediada por um mecanismo indireto em células de câncer colorretal

Para testar a última hipótese, empregamos o inibidor de tradução, cicloheximida (CHX). células Caco2 foram pré-tratados com diferentes quantidades de CHX durante 30 minutos e depois tratou-se com 10

@ 7 M de 1,25 (OH) 2D>

3, durante 24 horas. Em células Caco2, a concentrações tão baixas quanto 12,5 ^ g /ml, CHX foi capaz de bloquear a indução de ARNm significativamente TCF7L2 by1,25 (OH)

2D

3, como é DKK-4, um outro alvo indirecta vitamina D que é negativamente regulada (Figura 6) [44]. Estes dados indicam a necessidade de

de novo

síntese de proteína para a regulação por 1,25 (OH

) 2D

3. A indução de ARNm por CYP24A1 1,25 (OH)

2D

3 também é marcadamente inibida por CHX, mas ainda é induzida por ~ 20 vezes a 1,25 (OH)

2D

3 no maior concentração de CHX (Recurso Figura S5), um fenómeno que foi demonstrado para um outro gene alvo directo vitamina D, E-caderina [9]. A regulamentação do CYP24A1 é tão dramática que ele provavelmente requer a síntese contínua de proteínas co-ativador para apoiar uma indução dessa magnitude. Tomados em conjunto, estes dados significam que a regulação do TCF7L2 por VDR /1,25 (OH)

2D

3 é indireta.

células Caco2 foram pré-tratados durante 30 minutos com concentrações diferentes de o inibidor da síntese proteica cicloheximida (CHX) antes da adição de 10

@ 7 M de 1,25 (OH)

2D

3 ou de EtOH durante 24 horas, tal como indicado. Análise da abundância de ARNm de TCF7L2 (painel superior) e DKK4 (painel inferior) foi ensaiada por qPCR. As barras de erro representam SEM. * P . .05 Através do teste t de Student para diferenças significativas entre D

3 contra células tratadas EtOH

1,25 (OH)

2D

3 Aumenta Reporter TCF atividade em células de câncer colorretal

Enquanto a regulação da TCF7L2 é importante para muitos resultados patológicos, que queria vê-lo no contexto do câncer. Nós escolhemos a olhar para os efeitos da VDR-mediada TCF-4-regulação através do sistema repórter TopFlash clássica que tem sido descrito anteriormente (TopFlash, ao contrário de OT, utiliza um mínimo

c-fos

promotor). células Caco2 têm uma mutação somática APC que permite β-catenina e a acumular-se translocar para o núcleo. No caso de sobre-abundante, ativo β-catenina, podemos esperar um aumento na expressão TCF7L2 para resultar em aumento da atividade TopFlash. Com efeito, repetiu-se as mesmas experiências de titulação VDR como descrito nas experiências repórter do promotor TCF7L2 (Figura 4C), usando TopFlash (normalizada para o plasmídeo de controlo, FopFlash) em vez disso, e observou-se um aumento consistente e significativa da actividade TopFlash com 24 horas de 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 em células Caco2 (Figura 7) que, como os dados de proteínas (Figura 2D e 2E) é potencializada pela VDR. Estes dados apoiam um papel para VDR-dependente, aumento de 1,25 (OH)

2D

3-mediada de TCF-4 em mamar io de ratinho e células de tumores colo-rectais humanos, os efeitos dos quais pode regular diferencialmente β-catenina atividade

in vivo

.

células Caco2 foram transfectadas durante 24 horas com TopFlash,

Renilla Comprar e diferentes quantidades de VDR e tratados para 24 horas subsequentes com 10

-7 M de 1,25 (OH)

2D

3 ou EtOH. dados de luciferase foram normalizados para

Renilla Comprar e FopFlash e plotados em relação a cada amostra de controlo tratado com EtOH. As barras de erro representam SEM. Os valores de p apresentados são a partir de t-teste de Student. RLU:. Unidades relativas de luz

Discussão

A vitamina D tem mostrado grande promessa como um agente anti-câncer em ambos os estudos moleculares e animais, bem como alguns estudos epidemiológicos (revisto em [45]). Em um esforço para separar os efeitos anti-câncer de vitamina D a partir dos efeitos calcémicos que limitam a sua utilidade na clínica, muitos laboratórios estão dissecando suas actividades a jusante. Vários mecanismos moleculares que contribuem para o potencial de acção terapêutica da vitamina D envolvem interacções com a via β-catenina. Uma interacção directa entre β-catenina e um NHR, neste caso, o receptor de ácido retinóico foi descrita pela primeira vez em 1999 [3]. Desde então, muitos estudos têm encontrado interações semelhantes para receptor de andrógeno [8], [10], [11], PPAR [18], e VDR [2], [9]. Estes estudos mostram que os membros da família NHR e TCF /LEF competir para a ligação a p-catenina e /ou co-activadores comuns, tais como o P300. Na presença de ligando, β-catenina e /ou favorece P300 ligação ao NHR, causando um sinérgico sobre-regulação (em conjunto com o ligando NHR) de genes NHR-regulados, bem como a regulação negativa simultânea de TCF /β -catenina genes responsivos.