Sumário

PKCα (proteína quinase C alfa, PRKCA) é uma importante proteína envolvida em várias etapas de vias de sinalização no cancro do pulmão, e microARNs (miARNs) também têm sido mostrados para participar na carcinogénese do pulmão. No entanto, não é claro como PKCα e miARNs estão correlacionados na doença. Neste relatório, buscamos identificar novos miRNAs que visam PKCα e estudar a sua função biológica. Usando a análise bioinformática, previmos um candidato novela, miR-203, e encontraram padrões de expressão diferencial de miR-203 e PKCα em tecidos de câncer de pulmão humanos. Além disso, validadas experimentalmente miR-203 como um regulador direto de PKCα. Finalmente, demonstrou-se que a segmentação das PKCα por miR-203 desempenhou um papel crítico na regulação da proliferação celular, apoptose e a migração em células de cancro de pulmão. Em resumo, este estudo identifica um miRNA romance que tem como alvo PKCα e ilustra que a regulação negativa da PKCα por miR-203 modula os processos biológicos em células de câncer de pulmão

Citation:. Wang C, Wang X, Liang H, Wang T , Yan X, Cao, M. et al. (2013) miR-203 inibe a proliferação e migração celular de cancro do pulmão células por Segmentação PKCα. PLoS ONE 8 (9): e73985. doi: 10.1371 /journal.pone.0073985

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 08 de abril de 2013; Aceito: 24 de julho de 2013; Publicação: 10 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (Nos. 81101330, 31271378, 81250044 e J1103512) e da Fundação de Ciência Natural da província de Jiangsu (Nos. BK2011013 e BK2012014). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por aproximadamente 80% de todos os casos [1]. A maioria dos cancros do pulmão (56%) são diagnosticados numa fase distante porque a doença precoce é normalmente assintomática; apenas 15% dos casos são diagnosticados numa fase locais [2]. De facto, os pacientes com cancro do pulmão exibem frequentemente invasão de células tumorais e metástases antes do diagnóstico que torna os tratamentos actuais, incluindo cirurgia, radioterapia, quimioterapia e ineficaz. A taxa de sobrevida em 5 anos global para o cancro do pulmão de não pequenas células é muito baixa (17,1%). Por conseguinte, o estudo da base molecular de cancro do pulmão é crucial para a concepção de novos agentes terapêuticos capazes de melhorar a taxa de sobrevivência.

Proteína cinase C (PKC) é uma cinase de serina /treonina que desempenha um papel chave em diversos transdução de sinal vias, incluindo aqueles que estão envolvidos na proliferação celular, a diferenciação e a apoptose [3-5]. A família contém 10 isoformas de PKC relacionados com diferentes requisitos de cofactor, tecidos e distribuição subcelular, especificidade do substrato e [6]. A família é dividida em convencionais (cPKCs: α, βI, βII, e γ), novel (nPKCs: δ, ε, η, e θ), e atípica (aPKCs: Ç e ι /l) subclasses. PKC, incluindo PKCα (PRKCA), desempenha um papel no câncer de pulmão. O nível de proteína PKCα é significativamente mais elevada em linhas celulares de NSCLC (H1355, A549, H1703, H157, H1155) e, quando em comparação com células epiteliais de pulmão humano primárias (NHBE); Portanto, o aumento da expressão PKCα pode ser uma característica geral de células NSCLC [7]. Houve vários relatos sobre o papel da PKCα na proliferação celular, apoptose e a migração de células de câncer de pulmão. PKCα foi mostrado para ligar e fosforilar os discos de proteínas homólogas de uma grande andaime (dlg1) e promover a migração celular em células NSCLC [8]. Além disso, a supressão de PKCα aumenta a citotoxicidade e mutagenicidade de acetato de chumbo (Pb), as células de câncer de pulmão humano CL3 tenha sido tratada com [9]. A estaurosporina, um potente inibidor de PKC, controla a adesão celular, a mobilidade, e invasão de células A549 [10]; IL1-beta induz a expressão do activador de plasminogénio uroquinase (uPA) através PKCα, o que conduz à migração de células NSCLC A549 [11].

microARNs (miARNs) são reguladores críticos da expressão do gene [12,13] . miARNs maduro mRNAs alvo ligam-se em sítios complementares nas regiões 3 ‘não traduzida (3’-UTRs) ou nas sequências de codificação, suprimindo desse modo a expressão do gene alvo [14,15]. miRNAs são desregulamentado no cancro do pulmão humano e desempenhar papéis importantes na carcinogênese [16]. Por exemplo, a baixa expressão de let-7a e alta expressão do cluster do miR-17-92 estão associadas com um mau resultado clínico no cancro do pulmão [17,18]. A família miR-34 também é reprimido em cancro e está envolvida na supressão tumoral associada-p53 em muitos cancros [19-23], incluindo cancro do pulmão [24]. Estes resultados sublinham a necessidade de uma pesquisa em profundidade para miRNAs expressos de maneira aberrante durante a carcinogênese de pulmão que pode desempenhar um papel crítico na regulação do crescimento do cancro do pulmão ou tumorigênese.

Embora a desregulamentação dos miRNAs e PKCα desempenham papéis importantes na carcinogênese de pulmão , não houve correlação entre PKCα e RNAs tem sido relatada. Neste estudo, nós olhamos para miRNAs que possa visar PKCα e função celular influência.

Materiais e Métodos

Ética declaração

O câncer de pulmão e amostras de tecidos normais adjacentes combinados foram derivada de doentes submetidos a um procedimento cirúrgico em Nanjing Drum Tower Hospital (Nanjing, China). Todos os pacientes ou seus responsáveis ​​consentimento escrito fornecido e do Comitê de Ética da Universidade de Nanjing e Nanjing, Drum Tower Hospital aprovou todos os aspectos deste estudo. Os fragmentos de tecido foram imediatamente congeladas em azoto líquido no momento da cirurgia e armazenado a -80 ° C. Os tecidos congelados foram homogeneizados e o ARN total foi extraído utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As características clínicas dos pacientes estão listadas na Tabela 1.

idade

Sexo

Patológica Stage

Tumor Hystotype

148MIIIA (T2b, N2, OCM) de células escamosas Carcinoma270FIA (T1b, Não, OCM) Adenocarcinoma362FIIB (T3, não, OCM) Adenocarcinoma455FIIIA (T3, N2, Mo) Adenocarcinoma567MIB (T1, não, Mo) Adenocarcinoma649MIV (T4, N2, M1d) AdenocarcinomaTable 1. As características clínicas de pacientes com câncer de pulmão.

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células, reagentes, e anticorpos

células A549 de adenocarcinoma de pulmão humano foram adquiridos a partir do celular China Culture Center (Xangai, China). As células foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Gibco, CA, EUA) suplementado com soro de bovino fetal a 10% (FBS; Gibco) e foram crescidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. moléculas de ARN sintéticos, incluindo o pré-miR-203, e o mexidos ARN não codificante (ncRNA) foram adquiridos da Ambion (Austin, TX, EUA). Anti-PKCα (H-7) e anti-GAPDH (6C5) anticorpos foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA). Contagem celular Kit-8 foi comprado de Dojindo (Japão). O Kit de FITC-anexina V Detecção de apoptose I foi obtido a partir de BD Biosciences (CA, EUA).

miARN e siRNA transfecção

miR-203 sobre-expressão foi obtido por transfecção de células com pré-miR- 203, um oligonucleótido de ARN sintética que imita o precursor de miR-203, e um ncRNA serviu como um controlo negativo. Três sequências de ARNsi dirigidos a diferentes locais de ADNc humano PKCα (Si-PKCα) foram concebidos e sintetizados pela Invitrogen. Um siARN mexidos que não alvo PKCα ADNc humano foi incluído como um controlo negativo. sequências de siRNA foram como se segue: Si-PKCα # 1: 5′-GGAUGUGGUGAUUCAGGAU-3 ‘(com sentido); SI-PKCα # 2: 5’-GCAAAGGACUGAUGACCAA-3 ‘(com sentido); SI-PKCα # 3: 5’-AAGCUCCAUGUCACAGUACGA-3 ‘(sentido)

As células A549 foram semeadas em placas de 6 poços e foram transfectadas no dia seguinte usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. . Para cada doses bem, iguais (100 pmol) de ncRNA mexidos, pré-miR-203, mexidos siRNA, ou si-PKCα foram adicionados. As células foram colhidas 24 h após a transfecção. O nível de expressão de miR-203 foi analisada por RT-PCR quantitativa, enquanto o nível de proteína PKCα foi avaliada por transferência de Western utilizando um anticorpo contra PKCα. Estas amostras foram normalizadas por blotting com um anticorpo contra a GAPDH. O software ImageJ foi utilizada para quantificar os níveis de proteína. A sequência de siRNA com o melhor efeito de interferência (si-PKCα # 3) foi selecionado e usado em estudos posteriores.

A superexpressão de PKCα

Um plasmídeo de expressão de mamífero que codifica a PKCα humanos quadro de leitura aberta sem 3′-UTR foi adquirido de Invitrogen. Um plasmídeo vazio serviram como um controlo negativo. O plasmídeo superexpressão PKCα foi transfectado em células A549 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

Isolamento de ARN e RT-PCR quantitativo

O ARN total foi extraído a partir das células cultivadas utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Para a análise de RT-PCR quantitativo de PKCα e transcritos de p-actina, 1 ug ARN total foi transcrito de modo reverso em cDNA usando um oligdT e Thermoscript Transcriptase Reversa (Takara, Dalian, China). PCR em tempo real para o PKCα e transcritos de p-actina foi realizada num sistema aplicado Biosystems 7300 Sequence Detection (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) utilizando SYBR corante verde (Invitrogen). As reacções de PCR foram realizadas numa reacção de 20 uL incluindo 1 ul de ADNc, 1 de mistura de PCR × QuantiTect SYBR verde mestre, e 0,5 uM iniciadores senso e antisenso. As reacções foram incubadas numa placa de 96 poços a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 30 s. Todas as reacções foram realizadas em triplicado. Após as reações foram executados, os ciclos de limiar (C

T) foram determinadas usando configurações de limite fixo. As sequências dos iniciadores de sentido e anti-sentido utilizados para a amplificação de PKCα e β-actina foram como se segue: PKCα (sentido): 5′-GTGGCAAAGGAGCAGAGAAC-3 ‘; PKCα (anti-sentido): 5’-TGTAAGATGGGGTGCACAAA-3 ‘; β-actina (de sentido): 5’-AGTACTTCCTC TGCCCTGCTGCAG-3 ‘; β-actina (anti-sentido):. 5’-AGGGCAGGCAGCGTATATACAGGA-3 ‘

Ensaios para quantificar madura miR-203 foram realizadas utilizando sondas Taqman microRNA (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 1 ug ARN total foi transcrito em sentido inverso, ADNc, utilizando transcriptase inversa de AMV (Takara) e um iniciador de haste-laçada RT (Applied Biosystems). PCR em tempo real foi realizado utilizando um kit TaqMan PCR em uma Biosystems 7300 Sequence Detection System Aplicada (Applied Biosystems). Todas as reações, incluindo os controlos sem modelo, foram realizadas em triplicado. Após as reações, o C

valores de T foram determinadas usando configurações de limite fixo. Nas experiências apresentadas aqui, a expressão miARN nas células foi normalizado para a expressão do snRNA U6. A quantidade relativa de miR-203 para o controle U6 interna foi calculada usando a equação 2

-ΔCT, onde Sc

T = C

T miR-203 -C

U6 T.

miRNA previsão alvo

Os miRNAs que podem alvo PKCα foram determinados utilizando algoritmos de TargetScan (https://genes.mit.edu/targetscan/) [25], PicTar (http: //PicTar .bio.nyu.edu /) [26], e miranda (https://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl) [27] ensaio

construção de plasmídeo e luciferase.

uma sequência parcial do humano PKCα 3′-UTR, que inclui o previsto sítios de ligação de miR-203, foi sintetizado pela Invitrogen, com uma modificação adicional 3′-fosforilação. A sequência foi a seguinte: PKCα 3′-UTR (sentido): 5′-CTAGTTCTAAGGACGTTGCTGAACAAGCGTGTGAAATCATTTCAGATCAAGGATAAGCCAGTGTGTACATATGTA-3 ‘; PKCα 3′-UTR (anti-sentido): 5’-AGCTTACATATGTACACACTGGCTTATCCTTGATCTGAAATGATTTCACACGCTTGTTCAGCAACGTCCTTAGAA-3 ‘. Uma molécula de cadeia dupla foi formado por emparelhamento de duas cadeias simples destas a 60 ° C, e este duplex foi inserido no plasmídeo p-MIR-relatório (Ambion). inserção eficiente foi confirmada por sequenciação. Para os ensaios de repórter de luciferase, as células foram cultivadas em placas de 6 poços e cada poço foi transfectado com 2 ^ g de plasmídeo repórter de luciferase de pirilampo, 2 ug vector de expressão β-galactosidase (Ambion), e quantidades iguais de ncRNA mexidos ou pré-miR- 203 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). O vector β-galactosidase foi utilizado como um controlo de transfeco. As células foram ensaiadas usando os kits de ensaio de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA) 24 h após a transfecção. Os dados apresentados representam três experiências independentes.

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade de células A549 foi determinada utilizando a contagem celular Kit-8 (Dojindo), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células A549 foram plaqueadas a 5,0 x 10

3 células por poço em placas de 96 poços e incubadas durante a noite em meio DMEM suplementado com FBS a 10%. Após a transfecção, 10 ul de CCK-8 líquido foi adicionado ao poço de teste e incubadas durante 3 h. Absorvância (

A

) foi então medida num comprimento de onda de 450 nm.

A migração celular ensaio

A capacidade de migração de células A549 foi testado usando um Boyden Câmara Transwell (6,5 mm, Costar, Cambridge, MA). As células foram tratadas com ncRNA, pré-miR-203, ou ARNsi durante 6 h e foram suspensas em meio DMEM isento de soro com uma concentração de 4 × 10

5 células /mL; então, 4 × 10

4 células /poço foram adicionados à câmara superior. Ao mesmo tempo, 0,5 ml de DMEM suplementado com 10% de FBS foi adicionado ao compartimento inferior, e as placas contendo Transwell foram incubadas durante 18 h em 5% de CO

2 atmosfera saturada com H

2O. No final da incubação, as células que tinham entrado na superfície inferior da membrana do filtro (células migrantes) foram fixadas com 4% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente; as células foram então lavadas três vezes com água destilada e coradas com violeta de cristal a 0,1% durante 15 min à temperatura ambiente. As restantes células na superfície superior da membrana de filtro (não migrante) foram suavemente raspados com um cotonete. Imagens de células migrantes foram capturados usando um fotomicroscópio (BX51, Olympus, Japão). A migração celular foi quantificada por contagem de ocultação das células que migraram na superfície inferior da membrana; cinco campos foram contadas por câmara.

apoptose celular ensaio

Vinte e quatro horas após a transfecção com ncRNA, pré-miR-203, ou siRNA, as células A549 foram tratadas com peróxido de hidrogénio 200 uM ( H

2O

2) durante 30 min para induzir a apoptose. De acordo com as instruções do fabricante do FITC-anexina V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences), as células foram então lavadas duas vezes com PBS frio e ressuspensas em 1 × tampão de ligação a uma concentração de 1 × 10

6 células /mL . As células (1 x 10

5 células) foram transferidos para um tubo de cultura de 5 mL, e FITC-anexina V e iodeto de propídio (PI) foram adicionados. As células foram incubadas durante 15 min à temperatura ambiente no escuro e foram analisadas por citometria de fluxo (BD Biosciences) dentro de 1 h de coloração.

A análise estatística

Todas as fotografias de transferências de Western, de células ensaios de apoptose, e ensaios de migração foram representativas de pelo menos três experiências independentes. Os dados apresentados são apresentados como a média ± desvio padrão (D.P.).

t

teste foi utilizado para as comparações, e uma

p valor

de . 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Prediction de miRNAs que podem direcionar PKCα

Com a ajuda de três programas de previsão alvo de miRNA (TargetScan, PicTar e Miranda), previmos que miR-203 alvos a transcrição de mRNA PKCα.

as interações previstos entre os seus locais alvo no PKCα 3′-UTR miR-203 e encontram-se ilustrados na Figura 1A. Como mostrado nesta figura, existe um potencial local alvo de miR-203 da 3’UTR do ARNm da sequência PKCα. Os valores de energia livre mínima destas interacções estão -27,6 kcal /mol, como determinado por análise de híbrido ARN [28]. Além disso, o emparelhamento de bases perfeito entre a região da semente (a sequência de núcleo que abrange os primeiros 2-8 bases da miARN maduro) e os alvos cognatos foi observado (Figura 1A), e sequências de ligação no PKCα o miR-203 3′ UTR são altamente conservadas entre espécies (Figura 1B).

a, descrição esquemática dos duplexes hipótese formados pelas interacções entre os 3′-UTR locais de ligação PKCα e miR-203. A estrutura prevista do híbrido de bases emparelhadas está esquematizada. bases emparelhados são indicados por um

black linha

e G: pares de U são indicados por

três pontos

. A energia livre prevista do híbrido é indicado. B, sequência de alinhamento dos sítios de ligação putativos de miR-203 em toda a espécie. Os sites complementares de sementes estão marcados em

vermelho, e todos os nucleótidos nas regiões são conservadas em várias espécies, incluindo humanos, ratos e ratinhos.

padrões de expressão diferencial de miR-203 e PKCα em tecidos de câncer de pulmão humanos

miRNAs são geralmente pensados ​​para regular negativamente a expressão de seus alvos através da repressão translacional ou degradação mRNA [29,30]. Portanto, se um miARN medeia a degradação dos seus ARNm-alvo, este miARN e seus alvos devem ter padrões de expressão opostas. Com base nisto, foram examinados os padrões de miR-203 e PKCα expressão na mesma 6 pares de cancro do pulmão e amostras de tecido não-cancerosas correspondente. Usando a análise quantitativa por PCR em tempo real, foi demonstrado que a expressão de miR-203 foi significativamente menor em tecidos de cancro do pulmão humano do que nos tecidos normais adjacentes (Figura 2A); Em contraste, a expressão de ARNm PKCα era notavelmente maior em células de cancro (Figura 2B).

A, quantitativo em tempo real A análise de PCR da expressão relativa de miR-203 em 6 pares de tecido de cancro de pulmão (LCT) e não cancerosos tecido (NCT) amostras. B, em tempo real A análise de PCR quantitativa do nível de ARNm PKCα relativa nas mesmas 6 pares de TCL e amostras NCT. Os resultados em A, e B são apresentados como a média ± S.D. de três experiências independentes (*,

p Art 0,05; **

p Art 0,01)

Validação da regulação PKCα por miR-203

para uma validação adicional, as células A549 do adenocarcinoma do pulmão humano foram transfectadas com ncRNA ou pré-miR-203, e as células foram analisadas quanto à expressão de miR-203 por RT-PCR quantitativa de 24 h após a transfecção. Todas as células que foram transfectadas com pré-miR-203 mostrou um aumento significativo da expressão do madura miR-203 (Figura 3A). Para determinar se a sobre-expressão de miR-203 tinha qualquer efeito sobre os níveis de PKCα, repetiu-se as experiências acima e examinaram a expressão da proteína e ARNm PKCα 24 h após a transfecção. Tal como mostrado na Figura 3B, a expressão da proteína PKCα foi significativamente reduzido pela introdução de pré-miR-203, enquanto que as células transfectadas com o ncRNA mexidos mantida uma quantidade considerável de proteína PKCα. Do mesmo modo os níveis, as células transfectadas com o pré-miR-203 tinha diminuído de ARNm PKCα, em relação às células transfectadas com o ncRNA (Figura 3C). Em animais, miARNs são acreditados para actuar principalmente através da repressão de translação em vez de clivagem de ARNm [30], mas novos estudos mostram que miARNs metazoários pode reduzir os níveis de muitos dos seus transcritos alvo, não apenas a quantidade de proteína que derivam a partir destes transcritos de [31 ]. Nossos dados sugerem que miR-203 regula a expressão de PKCα em ambos os níveis de transcrição e proteínas, e considerando uma maior diminuição da proteína PKCα, pode agir mais sobre a repressão de translação de degradação do mRNA.

A, a sobre-expressão de miR -203. As células A549 foram semeadas numa placa de 6 poços e transfectaram-se no dia seguinte. Para cada poço, 100 pmol mexidos ncRNA ou pré-miR-203 foi adicionado. Os níveis de miR-203 foram avaliadas por RT-PCR quantitativa de 24 h após a transfecção. Para efeitos de comparação, os níveis de expressão de miR-203 em células transfectadas foram ncRNA-fixado em 1. O

Y

-axis mostra unidades arbitrárias que representam os miR-203 níveis de expressão relativos. Os resultados são apresentados como a média ± S.D. de três experiências independentes (***

p Art 0,001). B, de imunotransferência de proteínas PKCα endógeno em células A549 que foram ou transfectadas ou transfectadas com ncRNA ou pré-miR-203 durante 24 h simulada. GAPDH foi usada como um controlo de carga. Fotos do ensaio Western blot foram analisados ​​utilizando o software ImageJ, e uma análise estatística é mostrada no painel direito (média ± D.P. .; **

p Art 0,01). C, a análise de RT-PCR quantitativa de níveis de mRNA PKCα em células A549 tratadas com ncRNA mexidos ou pré-miR-203. O

y

-axis mostra níveis relativos de mRNA PKCα normalizados para os níveis de β-actina (média ± D.P. .; *,

p Art 0,05). D, o reconhecimento direto do PKCα 3′-UTR por miR-203. Quer de tipo selvagem (wt) ou mutante (Mut) sítios de ligação de miR-203 (a sequência que interage com os 2-8 bases de miR-203 foram mutados) na PKCα 3′-UTR estão representados. Firefly repórteres de luciferase contendo quer o de tipo selvagem (wt) ou mutante (Mut) humana PKCα 3′-UTR foram co-transfectados em células A549, juntamente com ncRNA mexidos, ou pré-miR-203. Às 24 h pós-transfecção, as células foram analisadas utilizando um kit de ensaio de luciferase. Firefly luciferase valores foram normalizados para a p- galactosidase e representada graficamente como a actividade de luciferase relativa. Para comparação, a actividade de luciferase nas células ncRNA-transfectadas foi definido como 1. Os resultados são apresentados como a média ± S.D. de três experiências independentes (**

p Art 0,01).

PKCα é um alvo direto de miR-203

Para determinar se os efeitos reguladores negativos miR-203 exercida sobre expressão PKCα eram mediados através da ligação de miR-203 para os locais presumíveis na 3′-UTR do mRNA PKCα, que parte do fundido PKCα 3′-UTR, que inclui a ligação previsto miR-203 locais, a jusante do plasmídeo repórter de luciferase de pirilampo. O plasmídeo resultante foi introduzido em células A549, juntamente com um controlo de expressão de plasmídeo de transfecção β-galactosidase e pré-miR-203 ou o ncRNA mexidos. Como esperado, a sobre-expressão de miR-203 resultou numa diminuição significativa na actividade repórter de luciferase, que foi normalizado para p- galactosidase, quando comparada com células tratadas com o ncRNA mexidos (Figura 3D). Além disso, introduzimos mutações pontuais nos locais complementares no correspondente semente PKCα 3′-UTR para eliminar o local de ligação de miR-203 previsto. Tal como mostrado na Figura 3D, mutações nos sítios de sementes complementares resgatado quase totalmente a repressão da actividade repórter causada pela expressão de pré-miR-203. Isto sugere que o local de ligação contribui fortemente para a miARN: interacção ARNm que medeia a inibição pós-transcricional da expressão PKCα. Em conclusão, os nossos resultados demonstram que o miR-203 reconhece directamente o 3′-UTR do mRNA PKCα e liga-se a ele de regular negativamente a sua expressão.

O papel de miR-203 mediada downregulation PKCα na proliferação celular, apoptose e migração celular

para investigar os fenótipos celulares desencadeadas pelo miR-203 downregulation mediada de PKCα, células A549 foram transfectadas com ambos os pré-miR-203 ou si-PKCα e analisadas para mudanças na proliferação celular, apoptose e migração.

Como se mostra na Figura 4A, a interferência mais eficaz de expressão PKCα podia ser alcançado por si-PKCα # 3 (nomeado posteriormente Si-PKCα) a transfecção, em comparação com o ARNsi de controlo. Foram determinadas as taxas de proliferação de células A549 com a diminuição da expressão de PKCα ou sobre-expressão de miR-203 usando a contagem celular Kit-8. Em contraste com as células transfectadas com ARNsi de controlo, as células transfectadas com Si-PKCα proliferaram a uma taxa significativamente mais baixa (Figura 4B). Além disso, observou-se uma diferença significativa nas taxas de proliferação entre as células transfectadas com ncRNA e pré-miR-203 (Figura 4C).

A, a validação do ARNsi contra PKCα. Três siRNAs dirigidos a diferentes locais de PKCα ADNc humano e um siRNA de controlo mexidos foram transfectados em células A549 utilizando Lipofectamine 2000. A análise de mancha de Western mostra os níveis de proteína PKCα às 24 h pós-transfecção. quantificação normalizada dos imunoblots foi levada a cabo a partir de experiências independentes. Os dados são apresentados como a média ± S.D. (**

p Art 0,01). B, ensaio de viabilidade celular às 12, 24, 36, e 48 h após transfecção das células A549 com doses iguais de ARNsi de controlo ou Si-PKCα, ou C, doses iguais de mexidos ncRNA ou pré-miR-203 (média ± SD; **

p Art 0,01). D, análise de mancha de Western do nível de proteína de PKCα em células A549 transf ectadas com ncRNA, pré-miR-203, ou pré-miR-203 mais PKCα plasmídeo sobre-expressão, e uma análise estatística é apresentada no painel direito (média ± SD; **

p Art 0,01). E, para Immunoblot PKCα proteína em células A549 que foram ou transfectadas ou transfectadas com plasmídeo PKCα superexpressão simulada. F, ensaio de viabilidade celular às 12, 24, 36, e 48 h após a transfecção das células A549 com ncRNA, pré-miR-203, pré-miR-203 PLUS plasmídeo superexpressão PKCα, ou PKCα superexpressão plasmídeo sozinho (média ± SD; * *

p Art 0,01; ***

p

. 0,001)

em seguida, investigamos se a superexpressão de PKCα é suficiente para reverter o inibidor efeitos de miR-203 em PKCα e processos biológicos em células de câncer de pulmão. Um plasmídeo especialmente concebido para expressar o quadro completo de leitura aberta (ORF) de PKCα sem o miR-203-responsivo 3′-UTR foi construído e transfectado para pré-miR-203 transfectadas células A549. Em comparação com células transfectadas com pré-miR-203, as células transfectadas com o pré-miR-203 e o plasmídeo superexpressão PKCα exibiram níveis significativamente mais elevados de PKCα (Figura 4D), sugerindo que resistente a miR-203 PKCα resgatado a supressão PKCα causada pela miR-203. As células transfectadas com o plasmídeo superexpressão PKCα sozinho também mostrou mais nível de expressão de PKCα em comparação com células transfectadas com um plasmídeo de controlo vazio (Figura 4E). Consequentemente, a superexpressão de PKCα resgatado miR-203 downregulation mediada das taxas de proliferação de células A549 (Figura 4F). Estes resultados sugerem que o miR-203 pode inibir a proliferação celular por silenciamento PKCα.

Após células A549 foram transfectadas com pré-miR-203, ncRNA, ou SI-PKCα durante 24 h, que foram tratadas com 200 uM de hidrogénio peróxido durante 30 min para induzir a apoptose. Em seguida, investigou a apoptose em células com um aumento da expressão de miR-203 ou silenciados PKCα análise por citometria de fluxo. Quando comparado com as células transfectadas com ncRNA, a percentagem de células apoptóticas no grupo transfecção pré-miR-203 foi significativamente mais elevada, a partir de 7,64% para 14,01%, respectivamente (Figura 5). Quando comparado com as células transfectadas com ARNsi de controlo, a transfecção com Si-PKCα ligeiramente, mas não significativamente, aumentada a percentagem de células apoptóticas, a partir de 7,98% para 10,16%, respectivamente. Estes resultados sugerem que o miR-203 pode promover a apoptose celular, mas este efeito baseia-se apenas parcialmente sobre a sua infra-regulação de PKCα.

células A549 foram transfectadas com doses iguais de ncRNA mexidos ou pré-miR-203, ou doses iguais de ARNsi de controlo ou Si-PKCα. perfis de apoptose celular foram analisadas por citometria de fluxo. O histograma biparametric mostra células no início (quadrante inferior direito) e estados apoptóticos tardias (quadrante superior direito). As células viáveis ​​são negativos dupla (quadrante inferior esquerdo). O experimento foi repetido três vezes, e uma análise estatística é mostrada no painel direito (média ± SD; **

p Art 0,01)

Nós avaliamos o papel de. miR-203 na migração de células usando o ensaio Transwell. Como mostrado na Figura 6A, a taxa de migração de células A549 transf ectadas com pré-miR-203 foi significativamente menor quando comparado com as células transfectadas com o controlo ncRNA. Além disso, a transfecção com Si-PKCα notavelmente reduzido o número de células A549, que passam através da câmara Transwell. Além disso, quando as células A549 foram simultaneamente transfectadas com o pré-miR-203 e o plasmídeo superexpressão PKCα, PKCα recuperado a migração drasticamente atenuado por miR-203 (Figura 6B). Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que miR-203 provavelmente modulam a migração celular por downregulating PKCα.

A, análise Transwell de células A549 tratadas com doses iguais de mexidos ncRNA ou pré-miR-203, ou doses iguais de controle siRNA ou Si-PKCα. Imagens representativas de três experiências independentes são apresentados no painel do lado esquerdo, e uma análise estatística é apresentada no painel direito (média ± D.P. .; **

P

0,01). B, imagens representativas de análise Transwell de células A549, que foram transfectadas com ncRNA, pré-miR-203, pré-miR-203 PLUS plasmídeo PKCα sobre-expressão, ou PKCα plasmídeo superexpressão sozinho, são mostrados no painel superior, e uma análise estatística é mostrado no painel inferior (média ± SD; **

p Art 0,01).

Discussão

Além de câncer de pulmão, PKCα é também um fator crítico em muitos outros tipos de câncer. Verificou-se que, PKCα δ, e ι foram significativamente mais abundante em carcinoma hepatocelular (HCC) tecidos em comparação com os tecidos do fígado não tumorais [32]. A análise imuno-histoquímica confirmou que os níveis acima do normal PKCα pode ser encontrado no carcinoma hepatocelular humano [33,34]. Quando PKCα foi introduzido na linha celular de cancro da mama MCF-7, a migração celular e invasão aumentou [35]. Foi relatado que o tratamento de SK-Hep-1 anti-sentido com HCC PKCα suprimiu significativamente o crescimento celular, a migração celular e invasão [36]. Os mesmos resultados foram reproduzidos usando o inibidor Go6976 PKCα /β, que foi capaz de inibir significativamente a proliferação, a migração e a invasão de células de carcinoma hepatocelular pouco diferenciados. Estas experiências sugerem que PKCα é uma direção de pesquisa prático para a compreensão do desenvolvimento do câncer.

miR-203 foi relatado para agir como um microRNA tumor-supressora, e sua expressão foi regulada negativamente em células de carcinoma da laringe [37]. Estudos de outro grupo mostraram que a expressão de miR-203 foi regulada negativamente na LNCaP, DU145, PC3, VCaP, e linhas de células de cancro MDA-PCa-2b próstata [38]. Descobrimos que a expressão de miR-203 em tecidos de cancro do pulmão foi significativamente mais baixo do que a dos tecidos normais adjacentes. Também tem sido mostrado que as funções de miR-203 em diversos cancros. A expressão ectópica de miR-203 em linhas celulares de cancro da próstata podia influenciar a proliferação, a apoptose, e a migração [38,39], enquanto que a sobre-expressão de miR-203 em células de carcinoma da laringe reduziu a viabilidade celular e levou a uma paragem do ciclo celular na fase G1 [37].