Abstract

A célula-tronco cancerosas (CSC) modelo pressupõe a presença de um pequeno número de CSCs na população de células cancerígenas heterogêneo, que são responsáveis ​​para a iniciação do tumor , bem como a recorrência e metástase do cancro. CSCs foram isolados a partir de uma variedade de cancros humanos e são capazes de gerar uma população de células de cancro hierárquica e heterogénea. CSCs são também resistentes à quimioterapia convencional e rádio-terapias. Aqui nós relatamos que a radiação ionizante pode induzir propriedades stem cell-como em células cancerosas heterogêneos. A exposição das células cancerosas não estaminais a radiação ionizante spherogenesis aumentada, e este foi acompanhada por sobre-regulação dos genes de pluripotência Sox2 e OCT3 /4. Knockdown de Sox2 ou OCT3 /4 spherogenesis induzida por radiação inibida e aumento da sensibilidade celular à radiação. Estes dados demonstram que a radiação ionizante pode activar caminhos stemness em células cancerosas heterogéneas, resultando em enriquecimento de uma subpopulação CSC com maior resistência à radioterapia

citação:. Ghisolfi G, CA Keates, Hu X, Lee Dk, Li CJ (2012) a radiação ionizante induz stemness em células cancerosas. PLoS ONE 7 (8): e43628. doi: 10.1371 /journal.pone.0043628

editor: Taro Yamashita, da Universidade Kanazawa, Japão

Recebido: 26 Janeiro, 2012; Aceito: 24 de julho de 2012; Publicação: 21 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Ghisolfi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por Skip Ackerman Centro de Fundo Therapeutics Molecular e Prêmio global Research Laboratory (Ministério da Ciência e Tecnologia, Coreia Educação). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro de células estaminais (CSCs), uma subpopulação de células malignas na população heterogénea de células de cancro, são considerados como sendo responsáveis ​​pela recorrência de cancro, metástase e resistência aos medicamentos. CSCs foram isolados a partir de uma variedade de doenças malignas humanas incluindo leucemia [1], [2], o cancro da mama [3], [4], tumor cerebral [5], o carcinoma hepatocelular [6], o cancro do pâncreas [7] e do cancro colo-rectal [8], [9]. CSCs têm a capacidade de auto-renovação e diferenciação em multidão de células que constituem a maioria da massa tumoral [10], [11]. CSCs também expressam altos níveis de proteínas transportadoras de resistência a drogas (por exemplo, ABC) [12], [13], [14], enzimas de reparação de ADN [15], [16] e anti-apoptóticos proteínas [17], [18], [ ,,,0],19], o que os torna altamente resistentes a terapias convencionais do cancro, incluindo quimioterapia e radiação. Por exemplo, estudos publicados por Bao et al [20] demonstraram que a radiação ionizante pode enriquecer CD133 + células-tronco cancerosas glioma

in vitro

e

in vivo

. Além disso, esses autores demonstraram que este efeito de enriquecimento foi mediada pela ativação preferencial do checkpoint danos no DNA de CD133 + células-tronco cancerosas em comparação com glioma CD133- células de glioma não-tronco. O modelo de CSC, portanto, apela para a concepção de terapias que visam as CSCs para melhorar o tratamento do câncer [21], [22].

Embora não haja cada vez mais provas para apoiar a hipótese CSC, a origem exata destas células permanece controverso. Uma possibilidade é que os CSCs resultar da transformação oncogénica de células estaminais de tecidos normais [23]. Neste cenário, as mutações nos mecanismos reguladores que controlam células estaminais auto-renovação são pensados ​​para promover a formação CSCs [24], [25], que, em seguida, gerar um células hierárquicos e heterogéneos com cancro, sugerindo que a célula cancerosa de origem tem a capacidade de gerar tipos múltiplos celulares (ou seja plasticidade multidifferentiative), uma característica das células estaminais-like [26], [27], [28]. Alternativamente, os CSCs pode ser derivada a partir de células de cancro não-tronco que tenham adquirido propriedades stemness [22], [29]. Em consonância com isso, estudos publicados pela Quintana et al, e Roesch et al [30], [31] mostraram que um fenótipo CSC pode ser adquirido por células tumorais previamente negativos para marcadores específicos CSC.

Neste estudo, nossos dados sugerem irradiação de células cancerosas como um romance potencial origem stemness câncer. A exposição de células cancerígenas heterogêneas à radiação gama reforçada spherogenesis ionizante em condições de cultura de células-tronco. Surpreendentemente, a irradiação das populações heterogéneas de células de cancro CSC-empobrecido induziu o aparecimento de células formadoras de esfera. Ao nível molecular, a análise da expressão do gene pluripotência após irradiação gama mostraram a sobre-regulação de Sox2 e OCT3 /4 ARNm e proteína. Em contraste, knockdown de Sox2 ou OCT3 /4 marcadamente reduzida colónias sobreviventes após o tratamento com radiação, e também inibiu significativamente spherogenesis induzida por radiação. Estes dados demonstram que a radiação pode activar caminhos stemness em células cancerosas heterogéneos, sugerindo um novo mecanismo de resistência das células cancerosas a radioterapia. Eles também implicam que a segmentação dos CSCs pode melhorar a eficácia da radioterapia.

Resultados

Gamma Radiation Aumenta Spherogenesis por células cancerosas

Em primeiro lugar, examinaram o efeito da radiação ionizante sobre o capacidade de células de carcinoma hepatocelular, para o qual um componente CSC foi previamente descrito [6], [32], a crescer como esferas sob meios de células estaminais (SCM) as condições de cultura. As suspensões de células individuais de células HepG2 e células Huh7 foram expostos a 0-10 Gy de radiação gama (para LD

50 ver Figura S1) e em seguida semeado com uma densidade clonal em placas ultra-baixas de fixação em SCM isento de soro. formação esfera foi avaliada após 7 dias e 14 dias de cultura. Ambas as linhas celulares foram capazes de formar esferas (Figuras 1c, 1d). Como se mostra nas Figuras 1a e 1b, foi observado um aumento de 40-50% do número de esferas por células HepG2 no dia 7 e no dia 14, e para as células Huh7 no dia 14 após o tratamento com 2 Gy ou 4 Gy de radiação gama. Estes resultados mostram que a radiação ionizante gama pode aumentar significativamente o

In vitro

spherogenesis de células HepG2 e Huh7.

A e B de células HepG2 (a) e células Huh7 (b), foram expostas a o aumento das doses de radiação gama e, em seguida semeadas em meios de células estaminais em placas de 96 poços de ultra baixo de fixação a 500 células /poço. Os números esfera foram contados após 7 dias (superior) e 14 dias (em baixo) da cultura, e os números relativos foram relatados nos gráficos. doses de radiação mais baixas de 2 e 4 Gy induziu um aumento significativo na formação de esfera em ambas as linhas celulares em comparação com amostras não tratadas. Os resultados são apresentados como média ± EPM de quatro experiências independentes. * P 0,05, ** p 0,01 versus células de controlo não tratadas. C e D representativos imagens de células HepG2 (c) e (d) Huh7 esferas formadas após 14 dias de cultura em meio de células estaminais. As imagens foram capturadas usando uma câmera digital (AmScope, iScope Corp., Chino, CA), montado em um microscópio invertido Zeiss Axiovert 25. Ampliação:. 100x

Gamma Radiation Induz Spherogenesis em HepG2 e Huh7 Non-side Cells População

população Side citometria de fluxo (definido pela capacidade de excluir o corante de ligação de ADN Hoechst 33342 ) [33], [34] tem sido utilizada para enriquecer a CSC e não-CSC a partir de várias linhas de células de cancro, bem como culturas primárias derivadas de tumores [26], [35], [36]. Esta abordagem mostrou que HepG2 e Huh7 CSCs representam ~1-2% das células tumorais a granel [6], [32]. Dado que a capacidade para formar esferas

in vitro sob condições de cultura

não-aderente é considerada uma propriedade de CSCs [32], [37] nossos dados indicam fortemente que a irradiação gama de células HepG2 e Huh7 aumentou significativamente no número de CSCs em ambas as linhas celulares.

para investigar se o aumento spherogenesis observados após exposição a radiação gama pode originar dentro da população de células de cancro não estaminais heterogénea, utilizou-se citometria de fluxo lateral população para identificar e isolar não- CSC a partir de células HepG2 e Huh7. Uma experiência típica população não lateral triagem é ilustrado na Figura 2a. As células sensíveis ao verapamil inibidor de bomba de efluxo (R3 portão) mostram baixa intensidade de coloração Hoechst e foram identificados como o componente população lateral (SP) do tumor (i.e. CSC-enriquecido). células Verapamil-insensitive com alta intensidade de coloração Hoechst (R4 portão) foram isolados como células de população não-lado (não-SP). Para excluir a possibilidade de efeitos não específicos sobre a formação de esfera resultantes das FACS procedimento de classificação, células HepG2 e Huh7 também foram falsamente classificados com base no iodeto de propídio (PI) coloração. Após separação de células em SCM, não-SP (isto é, a CSC empobrecido) e células de controlo (não triados granel ou HepG2 e Huh7 classificados-PI) foram irradiadas com 0, 2 ou 4 Gy de radiação gama em SCM. granel irradiado e irradiado, células não-SP e células classificadas-PI irradiadas foram então semeadas em ultra baixa placas de fixação e formação esfera foi avaliada após 7 e 14 dias de cultivo.

A células HepG2 (painéis à esquerda) e Huh7 células (painéis da direita) foram coradas usando a Hoechst 33342 com (painéis inferiores) ou sem (painéis superiores) verapamil, e em seguida, seleccionadas utilizando um seleccionador de células activadas por fluorescência MoFLO2. O portão R3 identificado a fracção lateral População (SP). As células não-Side População (Non-SP), isoladas através do R4 portão, foram recolhidos, lavados em PBS e novamente suspensas em meio de células-tronco. B e C não separados, não-SP e classificados-PI HepG2 (b) e Huh7 (c) As células foram expostas a 0, 2 ou 4 Gy de radiação gama e depois semeadas em placas de 96 poços ultra-baixa de fixação a 500 células /poço . números esfera foram então contadas após 7 dias (painéis superiores) e 14 dias (painéis inferiores) da cultura, e os números relativos foram relatados nos gráficos. As barras brancas representam as células tumorais não triados, barras pretas representam células classificadas população não-lado (não-SP), e barras tracejadas representam células classificadas-PI. Após 14 dias de cultura em SCM, as doses de radiação de 2 e 4 Gy induziu um aumento significativo na formação da esfera na população de tumores grandes quantidades e na população não-SP de ambas as linhas celulares em comparação com amostras não tratadas, enquanto que as células Huh7 PI-ordenadas mostrou aumentou significativamente a formação esfera seguinte 2 Gy de radiação tratamento. Os resultados são apresentados como média ± SEM de cinco experiências independentes (populações não triados e não-SP) ou média ± SEM de duas experiências independentes (população classificados-PI). * P 0,05, ** p . 0,01 versus células de controlo não tratadas

Como se mostra na Figura 2b e Figura 2c, não foi observada nenhuma diferença significativa na formação de esfera após 7 dias de cultura em SCM para não triados , não-SP, ou células HepG2 ou Huh7 classificados-PI submetido a dois ou quatro Gy de radiação gama. Em contraste, as células HepG2 não triados expostos a 2 Gy de radiação e as células Huh7 não triados expostos a 2 ou 4 Gy de radiação aumentaram significativamente a formação de esfera após 14 dias de cultura no SCM (Figura 2b, 2c). Além disso, as células de controlo classificadas-PI de ambas as linhas de células mostrou capacidade de formação de esfera semelhante ao HepG2 granel não triados ou células Huh7 após 14 dias de cultura em SCM. Especificamente, as células Huh7 classificados-PI submetido a 2 Gy de radiação gama foi aumentada de forma significativa a formação de esfera após 14 dias de cultura em SCM (p 0,05). As células HepG2 classificados-PI expostos a 2 ou 4 Gy de radiação também exibida a formação de esfera marcadamente elevada após 14 dias de cultura em SCM. Estas diferenças, contudo, não atingiu significância estatística. Surpreendentemente, a exposição a radiação gama marcadamente induzidos spherogenesis nas fracções não-SP de células HepG2 e Huh7 após 14 dias de cultura em SCM. Para as células HepG2, o tratamento da fracção não-SP com 2 Gy de radiação gama induziu um aumento de 150% na formação de esfera em comparação com células não-SP não tratados (p 0,001). Da mesma forma, o tratamento de células Huh7 não-SP com 4 Gy de radiação gama induziu um aumento de 80% na formação de esfera (p 0,01). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a radiação de baixa dose gama pode promover a formação de CSCs dentro da população de células de câncer não-tronco heterogêneo.

Gene stemness expressão está aumentada em HepG2 e Huh7 células após Gamma Radiation Treatment

para examinar se o aumento spherogenesis induzida por radiação gama pode ser devido à expressão do gene stemness elevada, células HepG2 e células Huh7 foram expostas várias doses de radiação gama, e o nível de OCT3 /4 e ARNm Sox2 foi avaliada por real PCR em tempo. Como mostrado na Figura 3A e 3C, um aumento significativo na OCT3 /4 ARNm e de proteína foi detectada em células HepG2 6 horas após a exposição a 2 ou 4 Gy de radiação gama. O aumento nos níveis de proteína Oct4 foi também observada em células Huh7 6 horas após a exposição a 4 Gy de radiação (Figura 3D). aumentos induzidos por radiação no nível de células Huh7 OCT3 /4 ARNm, no entanto, não atingiu significância estatística (Figura 3b).

A e B, E e F células HepG2 e Huh7 foram expostas a 0, 2 ou 4 Gy de radiação gama e o ARN total foi extraído após 3, 6 ou 24 horas. OCT3 /4 níveis de ARNm em cada linha celular (a e b) e Sox2 (E e F) foram então determinados por quantitativa PCR em tempo real e normalizado para os níveis de ARNm de GAPDH em cada amostra. Em células HepG2, o tratamento com 2 e 4 Gy de radiação gama induziu um aumento significativo da OCT3 /4 níveis de mRNA. níveis de mRNA Sox2 também foram fortemente regulada em células Huh7 seguinte baixa dose de tratamento de radiação gama. Os resultados são apresentados como média ± EPM de quatro experiências independentes. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 contra amostra t0 ou amostras não tratadas. A linha a tracejado representa uma comparação com o controlo no mesmo ponto de tempo. células C e D, G e H HepG2 e células Huh7, foram expostas a 0, 2 ou 4 Gy de radiação gama e expressão Oct4 ou proteína Sox2 foi determinada por análise de transferência de Western após 6 horas (para Oct4; C e D), ou após 4 horas (para Sox2; g e h). níveis de Oct4 e Sox2 proteína aumentou após o tratamento de radiação coerente com os aumentos nos níveis de mRNA para cada gene.

De acordo com nossos achados em relação OCT3 expressão /4, descobrimos que Sox2 mRNA e os níveis de proteína também foram significativamente aumentada em células Huh7 3 e 6 horas após a exposição a 4 Gy de radiação (Figura 3F, 3H). No entanto, não houve aumento em ARNm Sox2 e os níveis de proteína foi detectada em células HepG2 após o tratamento com radiação (Figura 3e, 3g). Estes resultados sugerem que a radiação gama pode induzir a reprogramação das células cancerosas diferenciadas para um fenótipo mais semelhante a haste por indução da expressão do gene stemness.

OCT3 /4 e Sox2 knockdown sensibiliza HepG2 e cancro hepatocelular Huh7 células a radiação de gama

Desde Sox2 e OCT3 /4 upregulation correlaciona com o aumento stemness (spherogenesis) em células HepG2 e Huh7 após a exposição à radiação gama, o próximo examinou se esses fatores poderiam afetar a capacidade das células HepG2 ou Huh7 para resistir o tratamento de radiação. Para estas experiências, Sox2 ou gene Oct4 foi silenciada expressão em células Huh7 e HepG2 utilizando ARN interferente assimétrica (aiRNA). aiRNA foram escolhidos, em vez do siRNA, devido à sua especificidade superiores [38]. eficiência knockdown foi avaliada por Western blot 48 h após aiRNA transfecção. aiRNA segmentação Sox2 ou Oct4 eficazmente reduzida a expressão de ambas as proteínas (Figura 4a e 4b). Isto é consistente com estudos anteriores usando células-tronco embrionárias que demonstram Oct4 e Sox2 estão ligados à mesma via regulamentar, que inclui loops de auto-regulação e regulação recíproca auto-transcrição [39], [40]. Seria, portanto, ser esperados silenciamento de genes único dentro do circuito regulador Sox2-Oct4 para reduzir o nível de expressão de ambas as proteínas.

A e B de células HepG2 (A) e células Huh7 (b), foram transfectadas com 100 nM de aiRNA segmentação GFP, Sox2 ou Oct4, e eficiência knockdown foi avaliada por transferência de Western após 48 horas. Sox2 e Oct4 pertencem ao mesmo circuito regulador; por conseguinte, um único gene knockdown conduz a níveis reduzidos de expressão de ambas as proteínas. células C e D HepG2 e Huh7 transfectadas com aiRNA segmentação GFP, Sox2 ou Oct4 foram irradiadas com 0, 2, 4, 6, 8 ou 10 Gy de radiação gama e números iguais de células foram plaqueadas em placas de 6 poços para ensaio de formação de colónia . No dia 7, as colónias foram contadas e a fracção sobrevivente de células clonogénicas expressos como log natural foi representada graficamente. As linhas são montados utilizando uma regressão de primeira ordem polinomial e representam a média de quatro experiências independentes. * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0,001 versus células transfectadas com GFP

Para avaliar o efeito do knockdown Oct4 Sox2 ou na viabilidade das células após o tratamento com radiação, e Huh7 As células HepG2 foram transfectadas com aiRNA segmentação Sox2, Oct4 ou GFP. Após 24 h, as células foram divididas e expostos a 0, 2, 4, 6, 8 ou 10 Gy de radiação gama. As suspensões de células individuais foram, em seguida, cultivadas em DMEM completo em placas de 6 poços padrão para permitir que as células se fixem e colónias de formulário. Após 7 dias de cultura em meio DMEM completo, as colónias formadas no âmbito de cada tratamento foram coradas e contadas. Tal como mostrado na Figura 4c e 4d, o silenciamento de expressão do gene Sox2 ou Oct4 em células HepG2 e Huh7 resultou num aumento significativo na sensibilidade à radiação gama (diminuição LD

50 valor; ver Tabela 1) quando comparado com células transfectadas com um aiRNA dirigido contra GFP, ou células não transfectadas. Estes dados sugerem que a regulação negativa de genes stemness pode sensibilizar células de carcinoma hepatocelular em Gamma tratamento de radiação.

OCT3 /4 e Sox2 Knockdown em HepG2 ou Huh7 Cells Inibe induzida por radiação Formação Sphere

desde knockdown de Sox2 ou Oct4 aumentou a sensibilidade das células HepG2 e Huh7 a tratamento de radiação, que se analisou lado a capacidade spherogenesis de células HepG2 e Huh7 seguintes irradiação gama foi associada com a expressão destes factores. Para avaliar o efeito do tratamento com radiação, as células Huh7 e HepG2 foram transfectadas com aiRNA dirigido contra Sox2, Oct4 ou GFP, colhidas após 24 h, e, em seguida, dividido e expostos a 0, 2 ou 4 Gy de radiação gama. As células foram então semeadas a uma densidade clonal em placas ultra-baixas de fixação em SCM isento de soro. Após 7 dias de cultura, as células irradiadas com raios gama transfectadas com aiRNA dirigido contra GFP mostraram um aumento semelhante na formação de esfera para o grupo não tratado. células Huh7 e HepG2 tratadas com Sox2 ou Oct4 aiRNA e expostas à radiação, no entanto, formadas significativamente menos do que as células esferas de controlo transfectadas com GFP aiRNA (Figura 5A e 5B). Mais importante ainda, as células tratadas com Sox2 ou Oct4 aiRNA tinha uma capacidade significativamente reduzida para formar esferas, após a exposição a 2 ou 4 Gy de radiação gama, em comparação com células não irradiadas. Em células HepG2, uma inibição significativa da formação de esfera foi também observada em células não irradiadas em cima do silenciamento de Sox2 ou Oct4. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que a expressão de Sox2 e OCT3 /4 é necessária para a CSC em células HepG2 e Huh7, e que a regulação positiva de estes factores em não-CSCs pode ser suficiente para induzir a aquisição de um fenótipo de CSC, conferindo assim uma maior resistência à radiação para a população de células tumorais em massa.

células a e B HepG2 e células Huh7 transfectadas com GFP aiRNA segmentação, Sox2 ou Oct4 foram expostas após 24 horas a 0, 2 ou 4 Gy de radiação gama e depois plaqueadas em placas de 96 poços de fixação ultra baixa em 500 células /poço em meio de células estaminais. números de esfera, para cada grupo de tratamento e radiação knockdown foram registadas no dia 7 da cultura em meio de células estaminais. O silenciamento de Sox2 ou Oct4 reduzida significativamente a formação de esfera em células HepG2 e Huh7 tratados com doses baixas de radiação gama, em comparação com células não-irradiadas ou células transfectadas com aiRNA contra GFP. Os resultados são apresentados como média ± EPM de quatro experiências independentes, n = 4. * P 0,05, ** p . 0,01 versus células transfectadas com GFP ou células de controlo não irradiadas (0 Gy)

Discussão

células-tronco cancerosas (CSCs) são pensados ​​para representar uma pequena subpopulação de células presentes na maioria dos tumores que, semelhantes às células-tronco de tecidos normais, possuem a capacidade de auto-renovação, para dividir assimetricamente e simetricamente, e submeter-se a multi-linhagem diferenciação [41], [42]. Estas características de CSCs são fundamentalmente responsáveis ​​por sua capacidade única para iniciar e manter tumores [10], [42], [43]. Além disso, também CSCs Acredita-se que desempenham um papel chave em metástase do cancro, a recorrência do cancro, e a resistência aos medicamentos cancro [15], [20], [44], [45].

Neste estudo, nós demonstramos que as células cancerosas pode ser induzida, por radiação gama, para adquirir um estado stemness caracterizada pelo aumento da expressão do gene stemness e um fenótipo de células-tronco, como o cancro. população lateral citometria de fluxo mostrou que os CSCs em HepG2 e Huh7 representar cerca de 1-2% das células tumorais a granel [6], [32]. Dado que a capacidade para formar esferas in vitro sob condições de cultura de células não-aderentes é específico para os CSCs [32], [37], os nossos dados sugerem que a irradiação gama de células HepG2 e Huh7 aumentou significativamente o número de CSCs em ambas as linhas celulares.

Publicações recentes têm demonstrado que, ao contrário das células tumorais a granel, CSCs possuem resistência intrínseca à terapia de radiação

in vitro

e

in vivo

[20], [45], [ ,,,0],46], e que esta propriedade resulta muito provavelmente da maior expressão de enzimas radicais de remoção livres, o aumento da eficiência na reparação do ADN-danos, e de activação do ponto de verificação de DNA-danos preferencial [15], [16], [20], [47] . Para explorar ainda mais a origem dos números aumentados de CSCs em irradiadas com raios gama células HepG2 e Huh7 foi realizada citometria de fluxo utilizando a Hoechst exclusão 33342 corante para isolar população lateral (SP), as células que são enriquecidas no CSC, e a população não-lado (não-SP ) células que são desprovidas de CSC. Surpreendentemente, foi observado aumento significativamente a formação de esfera em células não-SP HepG2 e Huh7 após exposição a 2 ou 4 cinza de radiação gama (Figura 2). Além disso, o aumento da formação de esfera também foi observada em células HepG2 não tratadas e células não-SP Huh7. Estas descobertas indicam que as células não-SP (isto é, células tumorais não-CSC) pode adquirir propriedades CSC-like, e são consistentes com o conceito recente de que os tumores são compostos por uma variedade de células em diferentes estádios de maturação [48], [49] , com a capacidade de converter em uma mais-tronco estado de células-like [50], [51].

estudos anteriores relataram que o enriquecimento induzida por radiação de CSCs está associada à ativação da auto-renovação vias de sinalização tais como Wnt /β-catenina, Notch e Hedgehog [52], [53], [54]. Além disso, uma vez que são capazes de CSCs tanto a divisão celular assimétrica e simétrica [55], [56], o efeito de enriquecimento é pensada para ser mediada principalmente por CSCs submetidos a divisão celular simétrica. Os nossos dados sugerem, contudo, que um componente adicional deste efeito pode ser a aquisição de características stemness mediante tratamento com radiação por células cancerosas não estaminais. Esta conclusão é ainda suportada pela nossa observação de uma maior Sox2 e OCT3 /4 expressão de genes de pluripotência em células de carcinoma hepatocelular seguintes irradiação gama (Figura 3).

Juntamente com c-Myc, KLF4 e NANOG, Sox2 e OCT3 /4 factores de transcrição são considerados os principais genes para a produção de murino e humanas induzida por células estaminais [57], [58]. Especificamente, Sox2 e OCT3 /4 expressão parece ter um papel fundamental na garantia da manutenção da auto-renovação, a plasticidade ea capacidade de reprogramação em células estaminais embrionárias e CSCs [59], [60], [61], [62] . A expressão aumentada de Sox2 e OCT3 /4 após o tratamento com radiação gama (Figura 3) é, portanto, consistente com a indução de um programa genético em algumas células HepG2 e Huh7 que resulta em aumento da stemness, e a aquisição de um fenótipo de células estaminais do tipo [ ,,,0],63], [64], [65]. Uma vez que o componente CSC em ambas as linhas celulares representa ≤2% da população celular total (Figura 2) [6], [32], a sobre-expressão observada de Sox2 e OCT3 /4 em células HepG2 e Huh7 após irradiação de baixa dose mais provavelmente representa mudanças na população não-CSC.

neste estudo, descobrimos que para baixo, regulação, Sox2 e OCT3 /4 em células HepG2 ou Huh7 foi associado com menor resistência à radiação gama em um ensaio de sobrevivência clonogênica que permite a sobrevivência e proliferação das células cancerosas não estaminais, bem como os CSCs (Figura 4). Esta descoberta está de acordo com estudos anteriores que demonstram que a radiorresistência de células de tumores em massa parece estar relacionada com o componente de CSC da população tumoral [20], [45], [46]. Para examinar esta ainda mais, que derrubado Sox2 ou expressão Oct4 em células HepG2 ou Huh7 usando tecnologia de RNA assimétrica e analisou a sua capacidade para crescer como culturas de esfera. Descobrimos que knockdown de Sox2 ou expressão Oct4 foi associada com uma redução significativa na formação de esfera seguindo tratamento com radiação gama (Figura 5). Uma vez que este experimento foi realizado em condições de cultura de células-tronco, que são seletivos para o enriquecimento CSC e sobrevivência, nossos resultados deve reflectir apenas o efeito de Sox2 e OCT3 /4 knockdown em CSCs. Curiosamente, Sox2 e OCT3 /4 downregulation reduziu significativamente a esfera capacidade de formação em células HepG2 e Huh7 não irradiados, indicando que esses fatores também podem ser necessários para a manutenção da CSCs existentes. Estes achados sugerem que knockdown de Sox2 e OCT3 /4 pode ser uma abordagem potencial para sensibilizar os carcinomas hepatocelulares para radioterapia já que o bloqueio destes factores pode impedir a auto-renovação de não-CSCs que adquiriram propriedades stemness, bem como CSCs existentes.

a longo prazo, os efeitos não-alvo, de radiação ionizante, tal como a instabilidade do genoma, as respostas adaptativas e o efeito espectador são considerados como tendo um papel importante na carcinogénese induzida por radiação [66], [67], [68] . A exposição das células à radiação, especialmente doses baixas, pode mediar a instabilidade genômica e respostas adaptativas que têm o potencial de induzir a expressão do gene, rearranjo cromossômico, modificações pós-translacionais e mudanças epigenéticas que iniciam carcinogênese. Estas alterações também pode ser induzida em outras células que não tenham sido submetidos a inicial de radiação de danos (pelo efeito circunstante) que conduz a um fenótipo mais amplificado. Além disso, eles são hereditárias, não clonal, e dependem de modificações tais como a desregulação epigenética de metilação de ADN [69], [70], [71]. A nossa descoberta de que a radiação gama pode induzir spherogenesis em células de cancro não estaminais, e que este processo requer a expressão de Sox2 e OCT3 /4, são consistentes com a activação de um “programa de stemness” mediado por efeitos não-alvo epigenética em células irradiadas onde a reprogramação da expressão do gene está associado significativamente aumentada radio-resistência [72].

Para o século passado, a terapia de radiação tem sido amplamente utilizado como um tratamento de câncer curativo ou adjuvante, e radiação dose baixa como uma medida paliativa para o gerenciamento de pacientes com câncer avançado. No entanto, a maioria dos tumores malignos humanos, incluindo hepatoma, são refratários a essa importante modalidade terapêutica. Neste estudo, nós mostramos que a radiação pode induzir propriedades de células estaminais semelhantes, tais como a formação de esfera e expressão gênica stemness na não-CSCs, demonstrando que as células cancerosas não-tronco podem adquirir uma mais-tronco estado de células-like com maior capacidade de auto renovar, sugerindo um novo mecanismo para o radiorresistência comumente observadas em malignidades humanas.

Métodos

Cultura celular e tratamento da toxicodependência

células de carcinoma hepatocelular

HepG2 foram adquiridas da American Type Culture Collection (HB-8065). células de carcinoma hepatocelular Huh7 foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Chung Raymond [73], [74]. células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 e Huh7 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich) suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS, Sigma-Aldrich), 2 mM de glutamina, 50 UI /ml de penicilina e 50 ug /ml de estreptomicina, em numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 a 37 ° C. Para avaliar a formação de esfera (spherogenesis) células HepG2 e Huh7 foram cultivadas em meio de células estaminais (SCM), composto de meio DMEM-F12, 1 × B27 suplemento, 200 ng /ml de EGF, 10 ng /ml de FGF básico, 0,4% de BSA, 4 ug /ml de insulina, 50 UI /ml de penicilina e 50 ug /ml de estreptomicina, em numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 a 37 ° C.

radiação de gama Tratamento

HepG2 não separadas e células Huh7 e não-SP ordenadas população suspenso em SCM foram divididas em alíquotas para tubos de 1,5 ml a uma concentração de 1 × 10

6 células /ml. Os tubos foram colocados em gelo e irradiadas com 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy ou 10 Gy de radiação gama usando uma

irradiador de 137Cs (CIS de diagnóstico). As células tratadas foram então semeadas em SCM para ensaio spherogenesis (em 0,5 × 10

3 /poço), ou em meio DMEM completo para o ensaio de viabilidade MTT (a 1 10

3 células x /poço) de ensaio e colónia formação ( em 3 × 10

3 células /cavidade).

Hoechst 33342 coloração e lateral População Citometria de fluxo

lateral População citometria de fluxo foi realizada de acordo com o método de Goodell et ai. [75] com modificações para melhorar a coloração de linhas de células hepáticas. Resumidamente, HepG2 ou Huh7 culturas foram tratadas com tripsina, e as células isoladas foram recolhidas por centrifugação a 500 r.p.m. durante 5 minutos. As células sedimentadas foram ressuspensas a uma concentração de 10

6 células /ml em DMEM pré-aquecido, enriquecido com 2% de FBS e Hepes 10 mM, contendo 5 ug /ml de Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) com ou sem 50 uM verapamilo (Sigma-Aldrich). As células foram então incubadas a 37 ° C num banho de água durante 90 minutos com agitação suave a cada 15 minutos. No final do período de incubação, as células foram centrifugadas a 500 r.p.m. durante 5 minutos a 4 ° C, e ressuspensas a uma concentração final de 2 x 10

7 células /ml em solução de Hank tamponada de sal arrefecida com gelo suplementado com 0,2% de FBS, HEPES 10 mM, 40 ^ M de malha-filtrada e coradas com /mL de iodeto de propídio 2 ug. As amostras foram mantidas em gelo até que se separaram utilizando uma máquina de FACS de alta velocidade MoFlo (DakoCytomation) em fracções contendo células lateral População (SP) e células não lateral População (não-SP) [6], [32], [ ,,,0],33], [34]. Hoechst 33342 foi animado usando um laser UV em 350 nm e sua fluorescência foi detectada usando um 450 nm Hoechst filtro azul e uma 670 nm Hoechst filtro vermelho. Propídio iodeto de fluorescência foi medida usando um filtro de 650 nm. células não triados e não-SP foram então transferidas para SCM o tratamento por radiação gama e análise da formação de esfera. Para PI-ordenação de células a granel, as células HepG2 e Huh7 foram ressuspensas a uma concentração de 10

6 células /ml em DMEM, pré-aquecido suplementado com 2% de FBS e Hepes 10 mM, em seguida, processadas como descrito acima.