Abstract

cancro do pulmão de células escamosas (SCC) e adenocarcinoma são os

mais comuns subtipos histológicos

de não- cancro do pulmão de pequenas células (NSCLC), e têm sido tradicionalmente controlado na clínica como uma única entidade. Cada vez mais provas, no entanto, ilustra a diversidade biológica destes dois subgrupos histológicos de câncer de pulmão, e apoia a necessidade de melhorar a nossa compreensão das bases moleculares além dos diferentes fenótipos, se pretendemos desenvolver terapia-alvo mais específico e individualizado. O objetivo deste estudo foi identificar microRNA (miRNA) dependente da transcrição diferenças de regulação entre SCC e adenocarcinoma subtipos de câncer de pulmão histológico. Neste trabalho, emparelhado miRNA (667 miRNAs por TaqMan Arrays de baixa densidade (TLDA)) e de mRNA profiling (Whole Genome 44 K matriz G112A, Agilent) foi realizada em amostras de tumores de 44 pacientes com NSCLC. Nove miARNs e 56 ARNm foram encontrados para ser diferencialmente expressos em SCC contra amostras de adenocarcinoma. Onze destes ARNm 56 foram previstos como alvos dos miARNs identificados para ser diferencialmente expressas nestas duas condições histológicos. Destes, 6 miRNAs (MIR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a e miR-708) e 9 genes-alvo (CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1 ) foram validados por PCR quantitativa em uma coorte independente de 41 pacientes com câncer de pulmão. Além disso, a correlação inversa entre mRNAs e microRNAs expressão também foi validado. Estes resultados sugerem diferenças de regulação transcricional dependente de miRNA desempenhar um papel importante na determinação de características-chave do NSCLC, e pode fornecer novos biomarcadores para estratégias de tratamento personalizado

Citation:. Molina-Pinelo S, Gutiérrez G, Pastor MD, Hergueta H, Moreno-Bueno L, Garcia-Carbonero R, et al. Regulamento (2014) MicroRNA-Dependente da transcrição em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (3): e90524. doi: 10.1371 /journal.pone.0090524

editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, França |

Recebido: 29 de agosto de 2013; Aceito: 03 de fevereiro de 2014; Publicação: 13 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Molina-Pinelo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. LPA é financiado pelo Fondo de Investigación Sanitaria (PI081156, PI1102688 e R12 /0036/0028), Proyecto de Excelencia de la Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucía (P08-CVI-04090), ea Roche Fellowship no 75º aniversário, Espanha. SMP é financiado pelo Fondo de Investigación Sanitaria (CD1100153), Fundação Científica de la Asociación Española Contra el Câncer, Consejería de Salud, Servicio Andaluz de Salud (PI-0224/2009 e PI-0046/2012), ea Fundação Mutua Madrileña (2009 ). MDP é financiado pelo Fondo de Investigación Sanitaria (CD0900148). RGC é financiado pelo Fondo de Investigación Sanitaria (PI10 /02.164). GMB é financiado pelo SAF2010-20175 e Madrid Governo Regional (S2010 /DMB-2303). laboratório AC foi apoiada por doações para a partir do Ministério da Economia e Competitividade, ISCIII Espanhol (PI12 /00137, RTICC: RD12 /0036/0028), Consejería de Ciencia e Innovacion (CTS-6844) e Consejería de Salud da Junta de Andaluzia (PI-0135-2010 e PI-0306-2012). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer em todo o mundo, sendo responsável por um milhão de mortes por ano [1]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por 80% de todos os tumores de pulmão, e inclui vários subtipos histológicos, tais como carcinoma de grandes células (LCC), carcinoma de células escamosas (SCC), e adenocarcinoma. SCC e adenocarcinoma são os

tipos mais comuns de NSCLC, respondendo por 25% e 40% de todos os casos, respectivamente [2], [3]. SCC deriva do epitélio em multicamadas displásicos no

de Central vias aéreas, enquanto adenocarcinoma origina preferencialmente a partir de células precursoras do mono ou bicamada epitélio superficial da periferia do pulmão [4].

NSCLC , independentemente do tipo histológico, tem sido tradicionalmente tratada

na clínica como uma entidade única homogénea. No entanto, cada vez mais provas ilustra a grande diversidade biológica da doença, que é progressivamente levando a estratégias diagnósticas e terapêuticas mais específicas, dependendo do tipo histológico em causa. De fato, os avanços na terapia do câncer de pulmão alvo agora exigem classificação precisa das NSCLC [5]. Por exemplo, mutações de EGFR são mais prevalentes em doentes com adenocarcinoma do pulmão, e a presença destas mutações está associada a sensibilidade aos inibidores da tirosina-cinase EGFR [6]. Da mesma forma, traslocations ALK, presente em apenas 4% dos adenocarcinomas, são preditivos de um alta sensibilidade a terapias dirigidas, tais como LFA-crizotinibe. Por outro lado, a amplificação FGFR1 é mais comumente observada em SCC, e agora está sendo considerado um alvo potencialmente acionável em ensaios clínicos com inibidores de FGFR [7]. Portanto, um maior conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na gênese, progressão e propagação de diferentes subtipos de NSCLC é necessário para o desenvolvimento de métodos diagnósticos específicos e o desenho de estratégias terapêuticas mais adequadas, individualizadas e eficazes.

Os grandes avanços nas tecnologias genômicas têm gerado muitos candidatos a biomarcadores com potencial valor clínico em NSCLC. MicroRNAs, como moduladores de pós-transcricional, são actores fundamentais na regulação de muitos processos biológicos. A desregulação dos seus papéis fisiológicos contribui para várias condições patológicas, incluindo o início e progressão do cancro. Neste contexto, um número de estudos avaliaram o papel potencial de assinaturas de miARN para discriminar subtipos histológicos ou para prever a recorrência ou a sobrevivência de doentes com NSCLC [8], [9], [10], [11], [12], [ ,,,0],13], [14], e miRNA perfil tem sido proposta como uma estratégia altamente confiável para classificar CPNPC [11], [15], [16]. No entanto, a alta complexidade da regulação transcriptoma dificulta a plena compreensão de redes regulatórias envolvidas nestes processos.

Para resolver esse problema, o objetivo deste estudo foi avaliar as diferenças de regulação transcricional dependente de miRNA entre SCC e adenocarcinoma histológicos subtipos de câncer de pulmão. Com esta finalidade, miRNA e mRNA emparelhado perfis de expressão foram analisados ​​em amostras de tumores NSCLC, e as interações potenciais entre eles foram exploradas. Neste estudo nós identificamos e validado um subconjunto de miRNAs desregulados e genes alvo que são capazes de definir características moleculares distintas destes dois principais subtipos histológicos do NSCLC.

Materiais e Métodos

Pacientes e tumor amostras

Os pacientes incluídos no estudo eram obrigados a ter confirmado histologicamente SCC fase inicial ou adenocarcinoma NSCLC. amostras de tumores de 85 pacientes foram coletados prospectivamente durante o procedimento cirúrgico e imediatamente snap-congelados a -80 ° C até à sua utilização. tecido pulmonar adjacente não-tumoral também foi coletada de pacientes incluídos na coorte de validação. O protocolo do estudo foi aprovado pelos conselhos de revisão institucionais de centros participantes [Hospital Universitario Doce de Octubre (Madrid) e Hospital Universitário Virgen del Rocío (Sevilla)] e todos os pacientes forneceram consentimento por escrito antes da entrada no estudo informou. Os dados clínicos e patológicos foram extraídos dos registros médicos e centralmente avaliação para efeitos do presente estudo. A população do estudo foi dividida em uma coorte de treinamento (N = 44) que foi usado para o desenvolvimento de perfil e uma coorte independente de validação (N = 41). Principais características de população do estudo estão resumidos nas Tabelas 1 e 2.

Gene Microarray expressão Perfis

microarrays experimentos foram realizados usando Whole Human Genome 44 K matriz G4112A (tecnologias Agilent , Wilmington, DE). O ARN foi isolado utilizando Trizol (Invitrogen) e RNAesy Extraction Kit (Qiagen, Alemanha), como indicado pelos fabricantes. O ARN foi marcado e hibridado matriz usando o Kit para baixo ARN linear amplificação e a hibridação in situ Kit Plus (Agilent tecnologias, Wilmington, DE), respectivamente. Após a hibridização e lavagem, as lâminas foram digitalizadas em um Axon GenePix Scanner (Axon Instruments Inc., Union City, CA) e analisados ​​utilizando Feature Extraction Software 6.1.1 (tecnologias de Agilent, Wilmington, DE). ARN a partir de amostras de tumor foram marcadas com Cy5-dUTP, e hibridou-se de encontro a um conjunto de referência cancro do pulmão (marcado com Cy3-dUTP com) que consiste em tecido de tumor primário a partir de pacientes com diferentes subtipos histológicos de cancro do pulmão. Como controle, dez hibridizações adicionais foram realizadas utilizando a rotulagem fluorocromo recíproco.

Para detectar genes diferencialmente expressos entre os dois subtipos histológicos, dois tipos de análise foram realizados com a ferramenta MIDAW [17]. Primeiro, um t-teste foi realizado com controle de taxa de descoberta de falsas (FDR) estimada utilizando o procedimento de Bonferroni de etapa única. Os genes que passavam através do filtro t-teste foram sujeitos a um segundo filtro. Apenas os genes que mostram um valor de proporção média logarítmica menor que -0,3 ou maior do que 0,3 (equivalente a uma alteração de 2 vezes) foram seleccionados como expresso diferencialmente. Em segundo lugar, uma análise discriminante para a identificação do conjunto de melhores genes marcadores foi realizada com base na análise de previsão do algoritmo de microarray (PAM). tabelas de dados brutos de microarray foram depositados na Omnibus Gene Expression sob o número de acesso de GSE42998.

MicroRNA qRT-PCR Ensaio

O ARN total, contendo RNA pequeno, foi extraída a partir de amostras de tecido tumoral por kit de isolamento miRvana miARN (Ambion, Austin, TX, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O rendimento de ARN total foi determinada utilizando um espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Tech, DE, EUA). O Agilent Bioanalyzer 2100 foi usada para determinar a quantidade e a qualidade das amostras de ARN (Agilent, Palo Alto, CA). Maduro expressão miARN humana foi detectada e quantificada utilizando as matrizes de TaqMan de baixa densidade (TLDA) com base em ‘Applied Biosystems 7900 HT Micro pneumático Cartões (Applied Biosystems, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O MicroRNA Humano Card Set matriz v2.0 (Número de Catálogo 4400238) é um conjunto de duas cartas contendo um total de 384 TaqMan microRNA Os ensaios por placa para permitir a quantificação precisa de 667 microRNAs humanos, todos catalogados no banco de dados miRBase. TLDAs foram realizadas em um processo de duas etapas. Resumidamente, durante o primeiro passo, 450 ng de ARN total foram transcritas inversa utilizando iniciadores Megaplex RT e o kit de transcrição reversa TaqMan miARN num volume total de 7,5 mL. Os 7,5 reacções ul foram incubadas em um G-tempestade Thermal Cycler (gene Technologies, Essex, Reino Unido) durante 2 min a 16 ° C, 1 min a 42 ° C e 1 min a 50 ° C durante 40 ciclos, mantida durante 5 min a 85 ° C, e depois mantida a 4 ° C. No segundo passo, 6 ul de amostra de ADNc e TaqMan Universal PCR Master Mix foram carregadas nos portos de enchimento no cartão de microfluidos TLDA. O cartão foi brevemente centrifugada durante 1 min a 331 g para distribuir as amostras nos poços múltiplos ligados às portas de enchimento e, em seguida, selado para evitar a contaminação bem-a-poço. As reacções foram incubadas numa placa de 384 poços a 50 ° C durante 2 segundos e 94,5 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 30 seg a 97 ° C e 1 min a 59 ° C. Finalmente, as placas foram processados ​​e analisados ​​em um sistema de detecção de 7900 HT Sequência modelo ABIPRISM. tabelas de dados em bruto TLDA foram depositados na Omnibus Gene Expression sob o número de acesso de GSE43000. Expressão de miARN alvo foi normalizada para a expressão de RNU48. Uma miARN não-humano, foi utilizado em cada ensaio como um controlo negativo. Os valores limite de ciclo (Ct) foram calculados usando o software v.2.3 SDS usando as configurações de linha de base automáticas e um limite máximo de 0,2. a quantificação relativa da expressão de miARN foi calculada pela 2

-ΔCt método (Applied Biosystems utilizador boletim n. ° 2 (P /N 4303859)). Apenas miARN detectável em pelo menos 80% das amostras foram consideradas para avaliação. Significância das diferenças de expressão miRNA observadas entre os dois subgrupos histolofical (adenocarcinoma e SCC) foi avaliada pelo teste t.

mRNA e miRNA expressão de correlação Avaliação

Para avaliar a associação potencial entre diferencialmente expressos mRNA e miRNA observado em nosso estudo, procurou os alvos de transcrição dos miRNAs identificados em três bases de dados da web para previsão alvo miRNA: Miranda [18], TargetScan versão 6.0 [19], e miRWalk [20]. genes-alvo putativos que combinavam com os encontrados a ser desregulada em nossa população de pacientes foram selecionados para posterior validação por qPCR.

genes Validação de perfis de expressão gênica Microarray por qPCR

Onze diferencialmente expressos entre os dois condições de estudo (SCC e adenocarcinoma NSCLC), identificadas como possíveis alvos de vários miRNAs dis-regulados, foram selecionados para posterior validação por qPCR na coorte formação original e, em seguida, em uma coorte de validação independente. O ARN foi transcrito de forma inversa em ADNc com o High Capacity cDNA Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems). Resumidamente, o ADNc de cadeia simples foi sintetizado a partir de 1 ug de ARN total, em 10 uL de volume de reacção, de acordo com o protocolo do fabricante. A reacção foi incubada a 25 ° C durante 10 minutos, seguido de 120 minutos a 37 ° C e a inactivação a 85 ° C durante 5 min. O sistema de expressão Ensaio Gene TaqMan (Applied Biosystems) foi utilizado para quantificar os níveis de transcrição de genes selecionados (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DMRT2, DSC3

e

KRT6A ).

Três genes de controle endógenos (

B2M

,

ACTB

e

GAPDH

) e um sem-template-controle (NTC) também foram executados para cada RNA amostra. Nós escolhemos

B2M Compra de normalização através de diferentes genes como este gene mostrou a expressão mais relativamente constante entre diferentes amostras de tecido (dados não mostrados). A expressão do gene para cada gene foi determinada utilizando o nível de expressão da mediana dos três repetições técnicas. As reacções de PCR foram realizadas num sistema de detecção 7900HT Sequence Applied Biosystems em 10 volumes uL a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. Os valores Ct foram obtidos com o software SDS v.2.3 (Applied Biosystems). A quantificação relativa da expressão de mRNA foi calculado pela 2

-ΔCt método (Applied Biosystems boletim de usuário no. 2 (P /N 4303859)).

Validação de perfis de expressão miRNA TLDA por qPCR

a expressão de nove miRNAs selecionados (mIR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a, miR-483-5p, miR-494, miR-601 e miR-708) foi avaliada no coorte independente validação pelos ensaios TaqMan microARN específicos de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems). Resumidamente, 2 ng /ul de ARN total foi convertido em ADNc por meio de reacção da transcriptase reversa que foi realizada por incubação sequencial a 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min e 85 ° C durante 5 min. Mistura de reacção de PCR (10 ul) continha 0,66 uL de produto de RT, 5 ul de 2X TaqMan Universal PCR Master Mix e 0,5 mL da apropriada TaqMan MicroRNA Ensaio (20X) contendo os iniciadores e a sonda para o miARN de interesse (Applied Biosystems). A mistura foi inicialmente incubadas a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 60 segundos. expressão MicroRNA foi quantificada pelo comparativa 2

-ΔΔCt método, normalizando os valores Ct para RNU48. Na coorte de validação, os valores de expressão tumor foram adicionalmente normalizada para valores de expressão no tecido pulmonar normal adjacente emparelhado.

3′-UTR Reporter Ensaio para miR-alvo de validação

A confirmação de miR-149 de ligação para a UTR 3 ‘de ABCC3 e de miR-378 e miR-422 de ligação à extremidade 3′ UTR de TMEM45B. HEK 293 células em 80% de confluência, foram co-transfectadas com plasmídeos repórter da luciferase que albergam a completa 3’-UTR do gene desejado (Painéis Genomics) juntamente com 100 nM de cada controlo miARN miR-mímica ou (Sigma). DharmaFECT Duo (Thermo Scientific) foi utilizado como o reagente de transfecção de

Opti-MEM

(Life Technologies). A luminescência foi determinada 24 horas mais tarde utilizando Lightswitch Assay Reagents (Painéis Genomics) de acordo com as instruções do fabricante. Knockdown foi avaliada pelo cálculo das razões sinal da luciferase para miARN específico /controlo não segmentação, utilizando vazio vector repórter como controlo para efeitos não-específicos. Cada experiência foi realizada em triplicado. teste t foi realizado para poços de vários experimentos, comparando células imitam-transfectadas com um controle de mímica para cada vector de gene.

Avaliação de Desempenho de diagnóstico de genes selecionados

Foram calculados os parâmetros de desempenho de diagnóstico para genes selecionados em tabelas 2×2-de contingência. Os intervalos de confiança para estes parâmetros foram calculados com o método de Pearson, com base na distribuição F. Como a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) são medidas estatísticas do desempenho de um teste de classificação binária, os valores de expressão gênica foram convertidos em variáveis ​​binárias com o valor da expressão mediana como o valor de referência (alta em relação baixa expressão). Estes parâmetros foram calculados para cada miARN /par ARNm alvo validada. A ocorrência simultânea de expressão miRNA alta e expressão de mRNA baixo alvo na condição histológico apropriado (SCC ou adenocarcinoma) foi considerado um teste positivo verdadeiro. Sensibilidade ou verdadeiras medidas taxa positiva a proporção de positivos reais que estão correctamente identificados. Especificidade ou verdadeiras medidas de taxas negativas, a proporção de negativos que são identificadas corretamente. O PPV descreve a probabilidade de ter a condição dada um resultado de teste de triagem positivo na população analisada. O NPV descreve a probabilidade de não ter a condição dada um resultado de teste de triagem negativa na população analisada.

Resultados

Perfil de Desenvolvimento

perfis de expressão gênica por subtipo histológico.

genoma inteiro matrizes de expressão foram realizados em amostras de tumores de pacientes da coorte de treinamento e perfis de expressão de tipos SCC e tumor adenocarcinoma foram comparados um gene de cada vez usando o one-sample

t Restaurant – teste. Depois de um único passo de ajustamento de Bonferroni, foram identificados para ser diferencialmente expresso por mais do que duas vezes em qualquer tipo histológico em relação ao conjunto de referência (Quadros A, B, C e D no Quadro S1) 727 genes. Destes 727 genes, cinco foram up-regulada e 195 sub-regulada em pacientes com adenocarcinoma, e 13 foram up-regulada e 516 sub-regulada em pacientes com CEC.

Além disso, uma segunda avaliação independente do mRNA expressão diferencial foi realizada por análise de dados microarray discriminante para minimizar resultados falso-positivos. A análise de previsão do algoritmo de microarray (PAM) identificados 61 genes que definiram uma assinatura molecular capaz de discriminar o adenocarcinoma de amostras de CEC (figura 1). Destes 61 genes, 56 genes desregulados combinados encontrado pela previamente realizada uma amostra t-teste, e, portanto, foram selecionados para análise e validação.

A análise de previsão de Microarray algoritmo identificou 61 genes que definiram um molecular assinatura para cada subtipo histológico. dendrograma Os moduladores ‘representa uma análise de agrupamento hierárquico não supervisionado de 19 de adenocarcinoma e 25 SCC com base no seu perfil de expressão gênica. O mapa de calor foi codificado por cores usando vermelho para o aumento da regulação e verde para baixo-regulação de um pool de referência câncer de pulmão. No

topo do mapa montão,

cores correspondem a perfis de expressão gênica de amostras de CEC (azul) versus amostras de adenocarcinoma (vermelho).

perfil de expressão MicroRNA por subtipo histológico.

matrizes MicroRNAs TLDA foram realizados em amostras de tumor de pacientes na coorte de formação. Nove miRNAs (MIR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a, miR-483-5p, miR-494, miR-601 e miR-708) foram encontrados para ser diferencialmente expressos entre a SCC e subtipos histológicos de adenocarcinoma por um limiar FDR-corrigido de 0.05. Oito destas 9 miARNs foram sobre-expressos em CEC em comparação com adenocarcinoma, e um (miR-375) foi sobre-expressa no adenocarcinoma em comparação com CEC (Tabela 3).

predição alvo MicroRNA.

Onze dos 56 genes (20%) que se verificou estar desregulado por tipo de tumor no nosso estudo foram consideradas ser alvos putativos de, pelo menos, um dos 9 miARNs também identificados para ser expresso diferencialmente na nossa população de estudo de acordo com a subtipo histológico (SCC contra adenocarcinoma). Para os 8 miRNAs sobre-expressos em SCC, 8 mRNA (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B

e

MUC1

) foram previstos como alvos por vários algoritmos. Estes genes foram encontrados para ser regulada em SCC em relação ao adenocarcinoma em nosso estudo (Tabela 2). Três destes genes 8 (

CEACAM6, MLPH

e

TMEM45B)

foram previstos alvos de mais do que um destes miARNs (figura 2). Como mostrado na Tabela 2, três genes (

DSC3, KRT6A

e

DMRT2

) foram previstos como alvos de miR-375, a miARN regulada positivamente no adenocarcinoma, e estes genes foram consistentemente sub-regulada neste subtipo histológico.

O gráfico mostra as metas de transcrição de forma diferente expressa miRNAs em tipos SCC e tumor adenocarcinoma utilizando três bases de dados da web de miRNA previsão alvo (Miranda, TargetScan e miRWalk). O esquema de cores padrão usado para representar nível de expressão é vermelho /azul (vermelho para a sobre-expressão de mRNAs ou miRNAs em SCC contra adenocarcinoma e azul para baixo-expressão de mRNAs ou miRNAs no SCC contra adenocarcinoma). O

setas indicam

mRNA repressão pela

ligado miRNAs

. Os quadrados representam mRNAs desregulamentado e ovais representam diferencialmente expressos miRNAs em adenocarcinoma de pulmão e SCC.

Perfil Validação

Validação da expressão diferencial de genes por RT-PCR quantitativo.

onze genes desregulados (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DSC3, DMRT2

e

KRT6A),

identificados como genes alvo putativos de miRNAs desregulados em nosso estudo , foram selecionados para posterior validação por RTPCR tanto na coorte de treinamento e em uma coorte independente de pacientes.

na coorte de treinamento, 9 dos 11 genes testados foram confirmados para ser diferencialmente expressos pelo subtipo histológico por quantitativa PCR (figura 3).

CEACAM5

,

CLDN3, CGN, ABCC3, MUC1, ACSL5

,

MLPH

e

TMEM45B

foram significativamente regulada em SCC, e

KRT6A

foi significativamente regulada para baixo em adenocarcinoma.

Para validar os genes expressos diferencialmente identificadas como por histologia do tumor nos dados de microarray, os níveis de expressão relativa de ARNm foram quantificados por PCR em tempo real usando o método ΔCt pela

B2M

como gene housekeeping. Os gráficos mostram os valores ΔCt medianos de genes validados em pacientes com adenocarcinoma contra SCC. Dados derivados de RT-qPCR são apresentados como

2 2

-ΔCt valores log.

P valor

inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Com base nos resultados obtidos no grupo de treinamento, 9 mRNA e 9 miRNAs foram selecionados para posterior validação por baseada em Taqman RT-qPCR em tumor e tecido normal acompanhado de uma coorte independente de pacientes com câncer de pulmão. Nesta coorte, os padrões de expressão de mRNAs foram consistentes com os quantificada na coorte de formação. padrões de expressão de subtipo histológica de todas as 9 ARNm testadas assemelhavam-se aos observados no grupo de formação, e as diferenças observadas entre os subgrupos foram todos estatisticamente significativo (Figura 4). Nos 9 miARNs, cinco (miR-149, o miR-205, o miR-378, miR-422a e miR-708) foram encontrados para ser significativamente sobre-expressos em SCC e miR-375 foi significativamente sobre-expressa no adenocarcinoma (figura 5).

Expressão de ARNm nove foi validada por PCR em tempo real numa coorte independente de doentes com NSCLC. Os níveis de expressão de ARNm foram determinados em amostras de tumor e tecido pulmonar normal emparelhado a partir de doentes com cancro do pulmão e expressão relativa por subtipo histológico foi avaliada. valores ΔΔCt medianas foram determinadas nos genes validados em pacientes com adenocarcinoma e SCC. Dados derivados de RT-qPCR são apresentados como 2

-ΔΔCt valores.

P valor

inferior a 0,05 foi considerado significativo.

A expressão de miRNAs desregulados foi avaliada na coorte de validação. Os níveis de expressão de microRNA foram determinados em tumor e emparelhado tecido pulmonar normal de pacientes com câncer de pulmão e expressão relativa por subtipo histológico foi avaliada. valores ΔΔCt medianas foram determinadas em nove miRNAs em pacientes com adenocarcinoma contra SCC. Dados derivados de RT-qPCR são apresentados como 2

-ΔΔCt valores.

P valor

inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Correlação entre a expressão de miRNA e mRNA.

Para estudar a relevância funcional dos miRNAs na regulação de mRNAs específicos identificados como biomarcadores potenciais, analisamos na coorte de validação a correlação entre a expressão miARNs e previu-alvo ARNm em cada paciente (Figura 6). Observou-se uma correlação inversa entre a

ABCC3, MUC1

e

CEACAM6 Comprar e miR-149 níveis de expressão. Além disso, os níveis mais elevados de

CEACAM6

foram associados com níveis mais baixos de miR-205 e miR-708, sendo a correlação significativa para miR-708 (r = -0.362; p = 0,030).

ACSL5

e

KRT6A

teve uma correlação estatisticamente significativa com o miR-205 (r = -0,475; p = 0,003) e miR-375 (r = -0,311; p = 0,065), respectivamente .

No caso de

TMEM45

B, foram encontradas correlações significativas para miR-378 e miR-422a (r = Restaurant –

0,394, p = 0,016 er = Restaurant –

0,413, p = 0,015, respectivamente).

estes resultados sugerem um papel potencial dos miRNAs na regulação destes genes. Subsequentemente, alguns desses alvos foram testados utilizando ensaios de gene repórter de luciferase. Obtivemos que a sobre-expressão de miR-149 em células HEK 293 para baixo regula a actividade de luciferase de construção repórter contendo a ABCC3 3-UTR (figura 7). Isto mostra que o miR-149 liga-se directamente a este RNA alvo e inibe a sua expressão. Além disso, a sobre-expressão de miR-378 e miR-422a inibe significativamente a expressão TMEM45B (figura 7).

Expressão dos 6 miARNs validados e dos seus genes-alvo putativas foi medido em cada paciente na coorte de validação. O significado da associação inversa entre cada um desses miRNA /casais de mRNA foi avaliada pelo coeficiente de correlação de Spearman. P valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A) As relações entre

ABCC3

,

MUC1

e

CEACAM6

com miR-149. B) As relações entre

ACSL5

e

CEACAM6

com miR-205. C) Relação entre os

TMEM45B Comprar e miR-378. D) Relação entre os

TMEM45B Comprar e miR-422a. E) Relação entre

CEACAM6 Comprar e miR-7018. F) Relação entre os

KRT6A Comprar e miR-miR-175.

células HEK 293 foram transfectadas com vector repórter luciferase contendo a região 3 ‘UTR de ABCC3 e TMEM45B. vectores repórter foram co-transfectadas com um miRN miRN imitam ou imitar controlo. Após 24 h de incubação, a actividade da luciferase foi medida. * P 0,05 e ** p 0,001 por

t

-test

Desempenho diagnóstico de genes selecionados para Discriminar SCC de Adenocarcinoma histológica NSCLC subtipos

Finalmente. , avaliou-se a especificidade e a sensibilidade destes seis miARNs validados em combinação com os seus mRNAs preditos para discriminar entre CCS e adenocarcinoma (figura 8). Observou-se o melhor desempenho para

KRT6A,

como alvo de miR-375, com valores de sensibilidade e especificidade de 94,1% e 88,9%, respectivamente. Também foi observado bom desempenho diagnóstico para

CEACAM6, ACSL5 y MLPH,

como alvos de miR-205, com valores mais baixos especificidade (71,4-76,2%), porém com maior sensibilidade (100%). Finalmente,

TMEMB45B,

como alvo de miR-378, mostraram uma sensibilidade de 87,5% e uma especificidade de 57,7%. Os outros casais miRNA /mRNA revelaram valores de sensibilidade e especificidade mais baixos, apesar de terem sido superior a 75% e 50% em todos os casos, respectivamente (Tabela S2).

Plot mostrando especificidade e sensibilidade dos miRNAs validados em combinação com mRNAs previstos para discriminar entre SCC e adenocarcinoma. As cores representam regulada mRNA a partir de seis miRNAs desregulados em SCC ou adenocarcinoma.

Discussão

Neste estudo foram analisados ​​os mRNA e miRNA assinaturas de pacientes expressão com diferentes subtipos de NSCLC . Isso nos permitiu construir um perfil transcricional robusto de adenocarcinoma de pulmão e SCC. Os nossos resultados indicam não só a existência de um ARNm e /ou padrões de expressão de miARN que são capazes de distinguir entre a SCC e adenocarcinoma, mas também que o assinatura de expressão genética alterada é causada em parte pela desregulação miARN específico.

Primeiro, analisou-se por duas abordagens todo o genoma de dados de microarray expressão para minimizar falsos positivos. Foram examinados os níveis de expressão diferencial de genes por meio de análise de dados microarray discriminar e pela one-sample

t

-teste. Cinquenta e seis genes foram encontrados para ser significativamente desregulamentado por ambas as análises e, portanto, foram selecionadas para avaliação e validação. Notavelmente, vários deles já havia sido implicada em processos biológicos relevantes (de acordo com a ontologia gene) no câncer de pulmão. Por exemplo, alguns genes do

KRT

família, que foram regulados negativamente em adenocarcinoma, estão envolvidos em várias funções celulares críticas, tais como a migração celular, crescimento e proliferação [21]. Em segundo lugar, miRNA Profiling identificados 9 miRNAs que foram diferencialmente expressos entre os dois subtipos histológicos de NSCLC estudadas. Seis deles (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a e miR-708) foram ainda validado em uma coorte independente de pacientes com NSCLC como biomarcadores capazes de discriminar adenocarcinoma e SCC. Para avaliar se estes miRNAs poderia ser regular directamente alguns dos 56 genes desregulados identificados, foram utilizados vários algoritmos amplamente usados. Onze destes genes 56 (20%) foram assim previsto para ser alvos putativos de pelo menos um dos seis miARNs encontrado para ser diferencialmente expressos em CEC em comparação com adenocarcinoma.