Abstract

A expressão da proteína fosfatase 32 (PP32, ANP32A) é baixa em cancros pancreáticos pouco diferenciados e está ligada aos níveis de Hur (ELAV1), um marcador preditivo de resposta gemcitabina. Em células de câncer de pâncreas, a sobre-expressão exógena de pp32 inibiu o crescimento celular, apoiando o seu papel reconhecido há muito tempo como um supressor tumoral no câncer de pâncreas. Em ensaios de rastreio de sensibilidade quimioterapêuticos, as células que sobre-expressam pp32 eram resistentes selectivamente ao nucleósido análogos gemcitabina e citarabina (ARA-C), mas foram sensibilizados com 5-fluorouracilo; inversamente, silenciar pp32 em células de câncer de pâncreas maior sensibilidade gemcitabina. Os níveis citoplasmáticos de pp32 aumentaram após as células cancerosas são tratados com certos factores de stress, incluindo a gemcitabina. pp32 superexpressão reduzida a associação de Hur com o ARNm que codifica a enzima desoxicitidina quinase metabolizadoras de gemcitabina (dCK), causando uma redução significativa nos níveis de proteína DCK. Do mesmo modo, a expressão ectópica pp32 causou uma redução na ligação Hur de mRNAs que codificam proteínas promotoras de tumor (por exemplo, VEGF e hur), enquanto pp32 de silenciamento drasticamente aumentada a ligação destas alvos de ARNm. expressão nuclear pp32 baixa correlação com tumores de alto grau ea presença de metástase ganglionar, em comparação com tumores de pacientes com alta expressão pp32 nuclear. Embora os níveis de expressão pp32 não aumentar o poder preditivo do estado Hur citoplasmática, os níveis de pp32 nucleares e os níveis de Hur citoplasmáticos associados de forma significativa em amostras de pacientes. Assim, nós fornecemos evidências romance que a função supressora de tumores de pp32 pode ser atribuída à sua capacidade de perturbar Hur ligação ao alvo mRNAs que codificam proteínas-chave para a sobrevivência de células cancerosas e eficácia da droga

Citation:. Williams TK, Costantino CL , Bildzukewicz NA, Richards NG, Rittenhouse DW, Einstein L, et al. (2010) pp32 (ANP32A) Expressão inibe o crescimento celular do cancro do pâncreas e induz a resistência à gemcitabina por perturbar Hur vinculação a mRNAs. PLoS ONE 5 (11): e15455. doi: 10.1371 /journal.pone.0015455

editor: Janine Santos, da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de julho de 2010; Aceito: 26 de setembro de 2010; Publicação: 29 de novembro de 2010

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita

Financiamento:. JRB foi apoiado por um Prémio Carreira de Desenvolvimento de PanCAN, a Associação americana de Pesquisa do Câncer; fundos da American Cancer Society (# IRG-08-060-01), e do Fundo para uma cura, Newtown, PA. MG foi apoiado pelo Instituto Nacional sobre o Programa de Pesquisa em Envelhecimento-Intramural, National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma do pâncreas (PDA) é um tumor maligno agressivo com um prognóstico ruim, mesmo após ressecção cirúrgica [1], [2]. Embora 5-fluorouracil (5-FU) e gemcitabina (GEM), com ou sem radioterapia constituem tratamento padrão no cenário adjuvante, eles fornecem pouca melhoria na sobrevida a longo prazo [3], [4], [5]. Portanto, uma melhor compreensão da adquirida e

de novo de

mecanismos de resistência quimioterápicos é necessário para que possamos melhorar as estratégias atuais de tratamento. Embora muito tenha sido aprendido sobre as alterações moleculares envolvidas no processo de desenvolvimento de neoplasias do pâncreas, tem havido pouco sucesso em nossa compreensão do por que as células de câncer de pâncreas são resistentes à quimioterapia [6], [7].

pp32 ( ANP32A) tem um padrão único de expressão em muitos cancros humanos [8], [9], [10], [11]. funções pp32 como uma proteína supressora de tumor [12], como demonstrado pela sua capacidade para inibir a

K-ras

transformação mediada maligno [13], [14]. Nós anteriormente mostraram que a expressão pp32 correlaciona-se com o estado de diferenciação de PDA, com níveis normais de expressão detectada em tumores bem diferenciados, mas reduziu-a-ausentes os níveis de expressão em tumores pouco diferenciados [14]. Estes resultados são importantes porque as formas pouco diferenciadas de PDA são ambos comum e agressivo, mas pouco se sabe sobre as características moleculares específicas desta forma de PDA [15]. Num estudo anterior, a introdução de pp32 em uma linha de células do pâncreas pouco diferenciada causada paragem do ciclo celular e inibiu o crescimento de células [14].

pp32 foi demonstrado ser um parceiro de ligação de várias proteínas importantes [14], [16], [17], [18], [19]. Trabalhos anteriores demonstraram que a pp32 está envolvida em: 1) de estabilização de determinados ARNm BEARING-UA rico elementos (Ares) nas regiões não traduzidas 5 ‘e 3’ (UTRs) através da interacção de pp32 com a proteína de ligação a ARN Hur (ELAVL1) [18]; 2) a modificação de acetilação da histona através do seu papel em que o inibidor da acetil-transferase complexo (denominado INHAT) [17]; e 3) a modulação do ciclo celular através da sua interacção com a forma fosforilada de Rb [18], [19], [20], [21].

Recentemente, também descobrimos que um parceiro de ligação de pp32, Hur [18], [22], é fundamental para a eficácia GEM contra células de câncer pancreático [23]. Nós demonstramos que Hur pode associar com a desoxicitidina-quinase (dCK) mRNA e, assim, regular a expressão de proteína dCK [23]. Esta associação é reforçada quando as células de câncer de pâncreas são expostos a GEM. Após a exposição GEM, níveis DCK aumentar para metabolizar GEM (um análogo de nucleósido) a partir de um pró-fármaco nos seus metabolitos activos. Assim, os pacientes tratados com GEM cuja ressecado tumores expressaram níveis Hur citoplasmáticos elevados tinha um aumento de 7 vezes na sobrevida em comparação com pacientes com tumores ressecados expressando baixo citoplasmática Hur [23]. Este trabalho anterior fornece a estrutura para explorar hur e proteínas relacionadas (pp32) no contexto da eficácia quimioterapêutico [24].

O papel exacto de pp32 como um gene supressor do tumor e, no seu papel de Hur em pós-transcricional regulamentação dos mRNAs alvo é em grande parte desconhecido. Anteriormente, pp32 co-imunoprecipitada com Hur em modelos de cultura celular e demonstrou-se que os motivos de reconhecimento de ARN de pp32 eram críticos para esta interacção [18]. Além disso, diferentes pesquisadores têm afirmado que pp32 é estritamente nuclear ou citoplasmática. Brennan

et al.

Primeiro descreveu pp32 como uma proteína que pode shuttle entre o núcleo eo citoplasma juntamente com Hur [18]. Com base neste trabalho, buscou-se explorar as ligações funcionais entre pp32 e Hur no que diz respeito à sobrevivência de células de câncer pancreático (ou seja, crescimento de células cancerígenas e eficácia GEM).

Métodos

Estabelecimento de pp32 isogênico -overexpressing e linhas de células de controlo

MiaPaCa2 células foram transfectadas utilizando Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA). pp32 de ADNc de comprimento completo foi subclonado no plasmídeo pc3.1 Zeo (Invitrogen), o qual possui um gene de resistência à zeocina para selecção ™ tal como descrito anteriormente [14], [23].

Para cada amostra, 5 ul VERIFY do antigénio padrão Origene superexpressão lisado (1 ug /1UL) foram colocados com 5 ul de tampão de amostra de SDS 2x (OriGene Rockville, Maryland). Superexpressão de pp32, Hur, ou vector vazio foram impulsionados por um plasmídeo pCMV6-Entry Vector que adicionaram uma tag Myc /DDK C-terminal para cada gene (OriGene). As amostras foram preparadas e, em seguida, carregado sobre uma NuPage 10% Bis-Tris do gel e separadas a 200 volts durante 60 minutos. As proteínas foram então transferidas para uma membrana PDVF a 30 volts durante 90 minutos. A membrana foi bloqueada durante 1 hora. As membranas foram sondadas com anticorpos primários (timidilato sintase, DCK, pp32, Hur e alfa-tubulina; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante a noite. As concentrações de anticorpo primário foram como se segue: Hur 1:1000, dCK 1:500, TS e alfa tubulina 1:200. Os anticorpos foram então sondadas lavada com uma solução de TBST e anticorpo secundário foi aplicado com anticorpo anti-IgG de ratinho-HRP Santa Cruz de cabra a uma concentração de 1:10,000. As membranas foram então lavadas e desenvolvido usando o sistema de detecção Immobilon Ocidental Quimioluminescentes HRP Substrato (Millipore, Billerica, MA).

transfecção transiente de vector de expressão de pp32 e siRNA para Ribonucleoproteína ensaios de ligação (RNP-IP) imunoprecipitação.

transfecção transiente foi realizada como descrito acima. siRNA knockdown foi realizada usando um pp32 concebido pequena interferência siRNA (Dharmacon, Thermoscientific) com a utilização de oligofectamine (Invitrogen) como descrito anteriormente [9], [23]. Em, linhas celulares de cancro pancreático breves células MiaPaCa2 PL5 e foram plaqueadas a 60% de confluência e transfectadas in Oligofectamine e Optimem (Invitrogen) utilizando siRNA pp32 e uma sequência de encriptação de controlo negativo (Dharmacon). As células foram recolhidas após 48 horas de immunoblot, ensaios de sensibilidade e ensaios RNP-IP.

Isolamento de ARN e detecção de DNA genômico de plasmídeos

Para confirmar a superexpressão e redução do mRNA pp32 na célula linhas, semi-quantitativo de RT-PCR foi realizada. (Mia.pp32) e células de vector vazio (Mia.EV) foram tripsinizadas e recolhidas MiaPaCa2 transfectadas pp32-como previamente descrito [25] e o nosso gerado fazer novo utilizando a linha celular de cancro pancreático parental gerado anteriormente e adquiriu (ATCC, Manassas, VA ). O ADN genómico foi isolado a partir de linhas celulares e Mia.pp32 Mia.EV e integração do plasmídeo foi confirmada através da realização de PCR com um iniciador de sentido directo específicos para a sequência do plasmídeo T7 e um iniciador de sentido reverso específico para pp32: FWD 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ‘ , 5’-REV CAGGTTCTCGTTTTCGCTTC-3 ‘.

O ARN total foi isolado utilizando o kit de isolamento de ARN RNeasy (Qiagen) e, em seguida, tratada com o Turbo-ADN

livre

(Ambion, Austin, TX) para eliminar quantidades vestigiais de ADNg [25].

imunoprecipitação Ribonucleoproteína (RNP-IP) e PCR em tempo real quantitativa (qPCR).

As células foram plaqueadas a 65% de confluência e tratadas como indicado. A imunoprecipitação foi realizada utilizando anticorpos de controlo anti-IgG anti-Hur ou como previamente descrito (MBL International, Woburn, MA) [23], [26]. RT-PCR foi então realizada, após a normalização de massa de amostras de ARN, para gerar ADNc. Densidade óptica de ADNc foi medida e RT-PCR quantitativa (qPCR) foi realizada num instrumento ABI 7500; 75 ng de modelo de cDNA foi usada por reacção para determinar a abundância relativa de dCK, VEGF, e hur ARNm; As amostras foram normalizados para os níveis de mRNA GAPDH.

SDS-PAGE /Western Blot

células

Mia.pp32 e Mia.EV foram tripsinizadas e lisados ​​de células inteiras foram obtidos utilizando tampão de lise RIPA. quantificação de proteína foi realizada utilizando um ensaio de Bradford (BioRad, Hercules, CA). As concentrações das amostras foram equalizados usando RIPA. As amostras foram, em seguida, misturado com 01:01 tampão Laemmli 2X e separada utilizando um gel de Bis-Tris polyacrylimide 10% em 1x tampão MOPS execução e as proteínas foram transferidas e colocados a hibridar com anticorpos indicados como previamente descritos acima [13].

células de imunofluorescência

Mia.pp32 Mia.EV e foram plaqueadas em lâminas com câmara e tratada com os fármacos indicados. Após o tratamento, as células foram lavadas em PBS, incubadas com o anticorpo indicado e processado como anteriormente descrito [23]. os núcleos das células foram coradas com DAPI e lâminas de câmara foram montados para análise com uma Zeiss LSM-510 Confocal Laser microscópio.

Citoplasmáticas Extractos

MiaPaCa2 células foram colocadas em placas a 60% de confluência. Seis horas após o tratamento com gemcitabina 1 uM (Eli Lilly) ou nenhum tratamento, extractos citoplasmáticos foram preparados tal como descrito [23], [26], e análise de imunotransferência realizada [23] utilizando anticorpos primários que reconheceram Hur (3A2, 1:1000, Santa Cruz), RNPhn ou pp32 (1:500) [13].

Crescimento ensaio

Usando o mesmo protocolo de transfecção descrito acima, as células parentais MiaPaCa2 foram transfectadas com quantidades iguais de pp32-encoding e pcDNA vazio vector em frascos T-75. O meio foi mudado e selecção de zeocina ™ foi realizado como descrito acima. No final do período de duas semanas, o meio foi aspirado e os balões foram coradas com solução de violeta de cristal durante 20 minutos, seguido por lavagens exaustivas ou células foram contadas como descrito na legenda da figura.

Droga Ensaios de sensibilidade

ensaios de sensibilidade foram realizados utilizando PicoGreen ™ (Invitrogen), um corante fluorescente que se liga selectivamente o ADN de cadeia dupla. A intensidade do sinal fluorescente correlaciona-se com o número de células viáveis. Em resumo, as células 2000 foram plaqueadas por cavidade de uma placa de 96 poços e tratadas 24 h depois [23]. Os agentes quimioterapêuticos foram adquiridos a partir de Sigma salvo indicação em contrário.

ligação a ARN ensaios

Para imunoprecipitação ribonucleoproteína (RNP-IP) análise, as células MiaPaCa2 foram plaqueadas a uma confluência de 65%, tratou-se 24 h mais tarde com 1 uM gemcitabina durante 3 h e IP realizada utilizando anticorpos de controlo IgG anti-Hur ou como descrito [23], [26]. Após o isolamento de ARN, os níveis de ARNm dCK foram medidos por análise de PCR utilizando iniciadores e TCTCTGAATGGCAAGCTCAA CTATGCAGGAGCCAGCTTTC [23].

A imuno-histoquímica e amostras de doentes

fixo com formalina, embebidos em parafina blocos foram processados ​​tal como descrito [ ,,,0],23] com recuperação antigênica calor e detecção de complexo avidina-biotina. A imunocoloração foi realizada em 37 amostras de PDA ressecados dos arquivos de patologia Thomas Jefferson University após a Universidade Institutional Review Board Thomas Jefferson (IRB). Nós adere a todas as considerações éticas aqui. Todas as amostras de pacientes utilizados estavam sob a Thomas Jefferson University Institutional Review Board (IRB) protocolo aprovado. Assim, este estudo foi realizado com 100% consentimento do paciente. Sem novas linhas de células geradas directamente a partir de tecido humano foram utilizados para este estudo. O consentimento foi escrito. título aprovação IRB é “coleção, depositar, e avaliação de tecidos, sangue, suco pancreático e bile de pacientes com pâncreas e carcinomas relacionadas submetidos a ressecção cirúrgica.” De acordo com o Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos (IRB aprovado). A maioria dos doentes recebeu GEM sozinho, ou em combinação com Xeloda ou terapia de radiação. Os anticorpos que reconhecem pp32 [14] ou Hur [23] foram usadas anteriormente [23]. localização celular (nuclear contra citoplasmática) e intensidade de coloração (forte contra o fraco) foram marcados. Com base na percentagem de células coradas ( 50% em relação a 5-50%) a expressão foi classificada como difusa ou focal, respectivamente. As curvas de sobrevida foram gerados utilizando GraphPad Prism (versão 4.0) e valores de p calculado usando um teste log-rank (Mantel-Cox).

Resultados

Caracterização de linhagens de células com superexpressão pp32

integração do plasmídeo em células MiaPaCa2 foi confirmada por amplificação por PCR de ADN genómico (dados não mostrados). A Figura 1 representa a confirmação da superexpressão da proteína pp32 na linha celular Mia.pp32 relação ao Mia.EV. Carga igual de proteína foi confirmada através de coloração da membrana utilizando Fast Green (Figura 1A). A presença nuclear forte da pp32 nas células Mia.pp32 foi detectada por imunofluorescência (Figura 1B). análise de imunotransf erência foi realizada periódica para validar a sobre-expressão contínua de proteínas pp32 nas células Mia.pp32 (Figura 1). A análise de imunotransferência

(A) Os lisados ​​de proteína a partir de células e os controles Mia.pp32. Mia.pp32 células expressam níveis aumentados de pp32 de células Mia.EV. (B) imunofluorescência com células Mia.pp32 e Mia.EV (

topo

). Imunofluorescência também foi realizada com a rotulagem de Hur, pp32, e DAPI com uma ampliação maior (

parte inferior

). As células foram então analisadas utilizando microscopia confocal a laser. células (C) Mia.pp32 reduziram significativamente o potencial de crescimento relativamente a células Mia.EV. (

Esquerda

) As células foram igualmente chapeado e coletadas nos dias 3 e 5 e contados. Cinco vezes menos células Mia.pp32 foram contadas em cinco dias em comparação com células Mia.EV. (

direita) células MiaPaCa2 foram transfectadas com quantidades iguais de pp32 e vazio pcDNA vetor 3,1 (Zeo). Os balões foram tratados de forma semelhante ao longo de um período de duas semanas e, subsequentemente, corados com violeta de cristal para quantificar o número de células viáveis ​​(ver métodos). Cada frasco é representativa de 3 frascos.

células cancerosas do pâncreas reduziram significativamente o potencial de crescimento em comparação com células de controlo

.

Inúmeras tentativas de gerar células Hs766T e PL5 pp32 com superexpressão não tiveram sucesso, enquanto que o plasmídeo vazio vector colónias gerados rotineiramente (dados não publicados, consulte Métodos) [14]. Resultados semelhantes foram descritos em estudos anteriores [8], [14].

células Mia.pp32 rotineiramente exigida passaging menos frequentes do que as células Mia.EV. ensaios de crescimento (Figura 1C,

esquerdo

) realizados como descrito (ver Métodos) revelou que pelo dia 5, havia cinco vezes menos células do que as células Mia.pp32 Mia.EV. Nota o crescimento logartihmic típico do Mia.EV em comparação com a taxa de crescimento embotada, linear de Mia.pp32. Não se observou morte celular significativa em nenhuma das linhas de células, no estado de sub-confluência, apoiando a conclusão de que a redução do crescimento de células, em vez de apoptose, foram responsáveis ​​pela diferença dramática na contagem das células, como descrito previamente [14].

Nós transfectadas as pp32 e plasmídeos vetor vazias em quantidades iguais de células MiaPaCa2 parentais. Uma redução drástica do crescimento nas células MiaPaCa2 transfectadas com pp32 foi detectado em comparação com as células transfectadas com vector vazio. Notamos coloração diminuiu marcadamente no balão transfectada-pp32 (Figura 1C,

direita), demonstrando o potencial de crescimento diminuída destas células em comparação com o controlo. Em conjunto, estas experiências excluída a possibilidade de que pp32 reduziu a proliferação celular por “efeito de posição-variegação” resultante da integração aleatória de um gene para uma região indesejável no genoma.

ensaios de sensibilidade ao fármaco revelaram Mia.pp32 As células resistentes a nucleósidos análogos

uma vez estavelmente transfectadas e linhas celulares Mia.pp32 Mia.EV foram estabelecidas, as células foram tratadas com vários agentes quimioterapêuticos a partir de diferentes classes de drogas (Tabela 1). Para a maioria das drogas, tais como etoposido, cisplatina, oxaliplatina (Figura 2A), ciclofosfamida e paclitaxel (Figura 2B, ver Tabela 1 para descrições de classes de drogas) apenas alterações insignificantes na quimiossensibilidade foram observadas entre as células e Mia.pp32 Mia.EV (Tabela 1 e A Figura 2A e B). Um sub-linha adicional de células transfectadas pp32 (Mia.pp32-2) foi incluída como um controle experimental, e foram encontradas diferenças entre todos pp32 superexpressão linhas celulares e as células de controle de vetores vazios, afastando assim um artefato de clonagem (Figura 2 ). Ambas as linhas Mia.pp32 e Mia.EV proliferaram com a mesma velocidade, tal como indicado pelas diferenças insignificantes observados em percentagens surivival celulares entre as linhas celulares em doses baixas extremas e a concentração de cada fármaco testado (Figuras 2A-C).

Sobrevivência de linhas Mia.pp32 e Mia.EV foi medida pelo ensaio de PicoGreen após 5-7 dias de incubação com as doses de fármaco mais indicado. (A) As drogas que não causam sensibilidade dependente de pp32; (B), medicamentos que mostram pequenas diferenças na sensibilidade; (C) drogas para as quais pp32, conferia uma resistência reforçada. Gráficos representam experiências individuais (S.E.M.); cada experiência é representativa de três experiências individuais. Mia.pp32 linhas são indicados como ▴▪ e as células de controle de vetores vazios são indicados como ♦.

Houve um aumento modesto na sensibilidade de linhas Mia.pp32 ao inibidor da proteína quinase C estaurosporina (STS) em comparação com Mia.EV (Figura 2B,

direito

). Mia.pp32 células foram duas vezes mais sensíveis ao 5-FU em comparação com células Mia.EV (Figura 2C,

esquerda). No entanto, a mudança mais dramática foi observada com drogas da mesma classe que utilizam dCK para o metabolismo celular: GEM e citarabina (ARA-C) (Tabela 1 e Figura 2C,

centro e

direita). Mia.pp32 células demonstrou uma resistência a dez vezes a GEM comparação com Mia.EV, e uma resistência de 2 vezes a ARA-C (Tabela 1 e dados representativos, Figura 2C,

centro).

siRNA knockdown de expressão pp32 endógena sensibiliza células à gemcitabina

a linha de células de câncer pancreático PL5, com expressão pp32 abundante, foi transitoriamente transfectadas usando pp32 siRNA ou uma sequência de controlo mexidos. Knockdown de expressão pp32 (Figura 3A), as células fundidas a cerca de 3 vezes mais sensíveis a GEM em comparação com células de controlo (Figura 3B). pp32 knockdown não afectou a viabilidade celular seguindo etoposido (controlo negativo) o tratamento (Figura 3C). Não foram observadas quaisquer alterações nos parâmetros de crescimento celular ou fenótipo celular nas células pp32 siRNA.

(A) Análise de imunotransferência de abundância pp32 em lisados ​​a partir de células PL5 48 h após a transfecção. Em células transfectadas, tal como explicado em (A), a sensibilidade a GEM (B) ou etoposido (C) foi testada pelo ensaio de sobrevivência de células PicoGreen.

A sobre-expressão e a redução de pp32 perturba VEGF, Hur e dCK mRNA transcrito ligação a Hur e reduz a expressão da proteína dCK

Anteriormente demonstramos que dCK mRNA se liga a Hur e, assim, aumenta a proteína tradução dCK [23]. Nós manipulado níveis de expressão pp32 (Figura 4A) em células cancerosas isogênicos e depois avaliada quantitativamente a associação de conhecido Hur mRNA alvo DCK [23], fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) [27], e Hur [28] mRNAs com Hur por ribonucleoprote�a imunoprecipitação ensaio (RNP-IP), como descrito anteriormente [23]. Depois de um breve tratamento GEM, a associação entre Hur e ARNm dCK foi detectada em células MiaPaCa2 (Figura 4B). No entanto, uma redução significativa em dCK, VEGF, e hur ARNm foi detectada em imunoprecipitados-Hur anticorpo de ARN a partir de células que sobre-expressam pp32 (Figura S1 e Figura 4A e B); enquanto nas células transfectadas com ARNsi de pp32, uma melhoria significativa consistente ( 4-vezes) em dCK, VEGF, e hur mRNAs ligados a Hur (Figura 4A e B). Fold alterações foram determinadas por comparação Hur imunoprecipitada por anticorpos-ARN a partir de células transfectadas com vector vazio-células transfectadas, com níveis de expressão, pp32 endógenos normais. Para especificidade, avaliamos e não havia nenhuma ligação de GAPDH e pp32 mRNAs (Figura 4B e dados não mostrados). Figura S1 mostra o efeito dramático da superexpressão estável de pp32 (células Mia.pp32) têm na ligação dCK mRNA para Hur.

(A) pp32 níveis de mRNA normalizada para os níveis de mRNA GAPDH nas células vazias-vector transfectadas, pp32 siRNA células transf ectadas, e do plasmídeo pp32 células transfectadas. Número indica a mudança de dobragem de expressão de ARNm de pp32 de marcado gerado linhas celulares em comparação com células de controlo de vector vazio. (B) ligação a VEGF Hur e dCK ARNm foi detectada por análise de RNP-PI em células transfectadas com ARNsi MiaPaCa2 pp32, o plasmídeo pp32, ou controlo de vector vazio (A). níveis de mRNA em Hur e amostras de IgG IP foram primeiro normalizados para os níveis de mRNA GAPDH nas mesmas reações IP, e depois plotados como enriquecimento vezes relativamente em VEGF, dCK, Hur mRNAs em Hur IP vs IgG IP. Os dados mostram a média de 3 pontos de dados independentes. Duas experiências independentes foram realizados a fim de confirmar os resultados. Os números indicam mudanças vezes em comparação com o controlo de IgG. (C) análise de transferência de Western dos níveis de expressão pp32 e DCK em lisados ​​de proteína a partir de células Mia.pp32 e Mia.EV. (D) Três pistas representam lisados ​​de células HEK293T gerado que ou esquerda para a direita: superexpressarem Hur, vector vazio, ou pp32 marcadas com myc /DCK. análise de Western blot incluídos anticorpos que reconhecem pp32, Hur DCK, alfa-tubulina e timidilato sintase (TS) proteínas.

Além disso, descobrimos que os níveis de proteína DCK foram reduzidas em células Mia.pp32 comparação com as células de controlo (Figura 4C). Por fim, utilizamos um modelo de cultura de células diferentes para validar esses achados. lisados ​​de proteína de células HEK293T Humanos (ver métodos) que overexpressed Hur, pp32 e um vetor de controle. Validação de Hur e pp32 superexpressão foi confirmada por immunoblotting (Figura 4D). Como esperado, foi detectada a expressão da proteína dCK melhorada nos lisados ​​superexpressão Hur [23], quando comparado com o controlo e diminuição da expressão da proteína nos lisados ​​dCK superexpressão pp32 quando comparado com o controlo (Figura 4D). Alfa-tubulina e timidilato-sintase foram usadas para mostrar o carregamento igual de proteína. Estes dados confirmam que dCK é regulada em um ambiente quando Hur é abundante e reprimidos em um ambiente quando pp32 é abundante. Tomados em conjunto, estes dados indicam que pp32 pode afetar tanto mRNA dCK ligação a Hur e dCK expressão da proteína (Figura 4).

STS e GEM reforçada abundância pp32 citoplasmática

Nós confirmou os relatórios anteriores [29 ] que STS pode aumentar os níveis de ambos citoplasmáticos Hur e pp32 nas células de cancro (Figura 5A). Da mesma forma, o tratamento GEM aumento da abundância citoplasmática pp32, mas em menor grau do que Hur (Figura 5A). O aumento nos níveis de pp32 e citoplasmáticos Hur GEM após o tratamento foi avaliada por análise de transferência de Western (Figura 5B). Nenhuma mudança na expressão pp32 e Hur foi detectada em lisados ​​de células inteiras a partir de células tratadas com GEM (Figura 5B), de acordo com os nossos resultados anteriores [23]. O acompanhamento dos níveis de PRNhn (C1 /C2) confirmou a pureza dos lisados ​​citoplasmáticos (Figura 5B).

(A) imunofluorescência mostrando aumento Hur e expressão citoplasmática pp32 nas células tratadas com STS (1 uM durante 3 h ) e GEM (1 uM durante 3 h), conforme indicado pelas setas brancas. (B) A análise de imunotransferência de níveis Hur e pp32 em lisados ​​e citoplasmáticos de células completas preparados a partir de células que foram tratados tal como se explica na (Figura 5).

intensidade pp32 nuclear é um biomarcador para prognóstico pobre em PDA, mas não aumentar o valor preditivo de Hur para o tratamento GEM

Detectamos separadamente tanto nuclear forte e fraca e expressão citoplasmática de ambos Hur e pp32 em espécimes PDA [14], [23] (Tabela 2 e Figura 6A, Hur,

esquerdo do painel

e pp32,

direito painel

). Para todos os pacientes tratados com GEM (n = 31) [23], a intensidade nuclear pp32 não se correlacionou significativamente com a resposta GEM em relação à sobrevida global (Figura 6B). os níveis de expressão nuclear em combinação com pp32 Hur estado citoplásmico (Figuras 6C e D) não aumentou o valor preditivo de Hur sozinho como um marcador para a resposta GEM (p = 0,0009, os dados agora mostrado [23]). Encontramos uma associação modesta entre pp32 e Hur níveis de expressão de localização subcelular (Tabela 3). A Tabela 2 descreve a associação entre os níveis de pp32 nucleares baixos e tumores mais agressivos (grau superior, p = 0,0002, e positivo para metástases em linfonodos, p = 0,0069, ver Tabela 2). Esta evidência suporta nossas descobertas anteriores, em um conjunto de dados clínicos separados, mostrando que a baixa expressão pp32 correlacionada com PDAs pouco diferenciadas [14], [15].

(A) A abundância e localização subcelular de Hur (

esquerda) e baixa a ausentar expressão pp32 nuclear (

direito

) em amostras de pacientes com câncer pancreático foram avaliados por imuno-histoquímica; ampliação, 200x. As amostras são representativos da coorte analisada em B-D. (B) Correlação entre a expressão nuclear pp32 e resposta ao tratamento GEM (p = 0,3, teste logarítmico). (C) Correlação entre amostras tumorais que expressam pp32 nucleares altas estratificados em estado de alta ou baixa Hur no que diz respeito à resposta GEM (p = 0,88, teste logarítmico). (D) Correlação entre amostras tumorais Hur expressam citoplasmáticos altas estratificados em expressão nuclear pp32 alta e baixa correlação com a resposta GEM (p = 0,25, teste logarítmico).

Discussão

Numerosos investigadores têm caracterizado independentemente pp32 como uma proteína supressora de tumor numa variedade de modelos experimentais [8], [9], [12], [13], [30], [31]. Estudos anteriores mostraram que pp32, através de um domínio específico composto de ~ 25 aminoácidos, actuou como um supressor de tumores através da inibição K-ras, um mutante p53, c-Jun, E1A, E6, E7 e [12], [13]. Descobrimos uma forte correlação entre ambos os tumores de alto grau e metástases em linfonodos com expressão nuclear pp32 fraco (Tabela 2), apoiando nossas descobertas anteriores de que pp32 funciona como uma proteína supressora de tumor no PDA [14]. Os nossos resultados sugerem que os níveis de expressão de pp32 perturbar directamente ou facilitar a capacidade de Hur para suportar a viabilidade das células do cancro e proliferação por perturbar a estabilização das transcrições de mRNA que codifica para as proteínas necessárias para a sobrevivência de células de tumor, tais como dCK, VEGF, ou Hur (Figura 7). Postulamos que a presença de pp32 pode perturbar o papel de Hur no apoio tumorigénese e na sobrevivência de células de cancro, enquanto que a ausência de pp32 facilita a tumorigénese. Nossos suportes de trabalho e se expande ao longo de uma década de pesquisa que provou que pp32 funciona como um gene supressor de tumor em vários modelos e sistemas tumorais [8], [9], [11], [12], [13], [30] [31], [32] (Figura 7).

no lado esquerdo mostra um cenário onde pp32 é reduzido ou ausente (tumorigênese) e Hur está disponível para associar e estabilizar mRNAs que suportam a sobrevivência de células cancerosas e viabilidade. No lado direito é um cenário em que pp32 está presente (supressão do tumor) e Hur não pode vincular a mRNAs importantes para a sobrevivência da célula cancerosa. Nota: GEM é mais susceptível de ser metabolizado a partir da sua forma de pró-fármaco para os seus metabolitos activos em dCK no cenário do lado esquerdo

A modulação da expressão ou sobre-expressão por meio de pp32 silenciamentos alterou a sensibilidade das células cancerosas à. os análogos de nucleosídeos GEM e Ara-C (Figuras 2C e 3). Além disso, os níveis de expressão pp32 realçado ou reduzido alterados directamente a interacção das dCK Hur com ARNm (Figuras 4) e reduziu significativamente a expressão da proteína dCK (Figuras 4C e D). Estes dados indicam que pp32 desempenha um papel na regulação pós-transcricional da Hur de dCK. Verificou-se anteriormente que os níveis de pp32 relata citoplasmáticos podem aumentar na presença de factores de stress específicas [22], [33]. Talvez diferentes estressores transportar diferentes membros da família gene pp32 em conjunto com Hur. Por exemplo, Fries B

et al.

Demonstrou que

abril Comprar e atos não pp32 como um ligando e pode ajudar Hur na sua regulação transcricional de CD83 [33]. Os membros da família de proteínas pp32 (por exemplo, APRIL, pp32r1, pp32) provavelmente fornecer mecanismos de regulação adicionais para Hur e seus mRNAs alvo [31].

Embora nossos dados fornecem fortes evidências de que pp32 modula a função de Hur, nossa clínica dados mostram que, antes do tratamento, pp32 expressão endógena e localização subcelular não altera o valor preditivo do hur de resposta GEM (Figura 6). Além disso, enquanto uma associação foi encontrada entre pp32 e Hur localização subcelular em amostras de tumor (Tabela 3), parece que cada proteína não regula completamente a localização subcelular do outro

in vivo

.