Abstract

infecções febris agudas historicamente têm sido usados ​​para tratar o câncer. Para explorar o mecanismo subjacente, estudamos os efeitos crónicos dos febre sobre o crescimento de células de cancro e eficácia quimioterapêutico em cultura de células. Descobrimos que as células cancerosas de cultura a 39 ° C o crescimento celular ligeiramente inibido por prender as células na fase G1 do ciclo celular. Quando as células foram semeadas em placas de cultura com uma densidade inferior, por exemplo cerca de 1000-2000 células por 35 mm de prato, a inibição do crescimento foi muito maior, que se manifesta como muitas colónias menos células nos pratos de 39 ° C, em comparação com os resultados de cada sementeira de densidade mais elevada, e.g. 20000 células por prato, o que sugere que a colaboração célula-célula como o efeito Allee em cultura de células é inibida a 39 ° C. Retirada de células a partir de soro melhorada a paragem em G1 a 39 ° C e, para algumas linhas celulares, tais como células de cancro do pulmão A549, reposição soro falhou para conduzir rapidamente as células de G1 para a S e fases G2-M. Os efeitos terapêuticos de vários agentes quimioterapêuticos, incluindo extractos de cravo broto, em várias linhas celulares de cancro foram mais potentes a 39 ° C do que a 37 ° C, especialmente quando as células foram semeadas a uma densidade baixa. Para algumas linhas celulares e de alguns agentes, este acessório é de longa duração, ou seja, continuar após a cessação do tratamento. Colectivamente estes resultados sugerem que a hipertermia pode inibir o crescimento de células de câncer por paragem G1 e pela inibição da colaboração célula-célula, e pode aumentar a eficácia de vários agentes quimioterapêuticos, um efeito que pode persistir após o término da quimioterapia.

citação: Zhu S, Wang J, Xie B, Luo Z, Lin X, Liao DJ (2015) Cultura a uma temperatura superior Ligeiramente Inibe o cancro do Crescimento celular, mas melhora Efeitos quimioterápicos inibindo Collaboration célula-célula. PLoS ONE 10 (10): e0137042. doi: 10.1371 /journal.pone.0137042

editor: Arun Rishi, Wayne State University, Estados Unidos

Recebido: 09 de junho de 2015; Aceito: 20 de julho de 2015; Publicação: 23 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

infecções febris agudas por diferentes patógenos durante séculos foi pensado para desempenhar um papel na profilaxia de cancro [1,2] e em regressão espontânea câncer [3-7], tal como revisto antes por nós [8] e outros [ ,,,0],9]. Na verdade, diferentes agentes patogénicos que podem causar febre aguda, tais como bactérias e protozoários parasitas que causam a malária, já foram utilizadas para tratar cancros mais de um século [5,10]. Durante 1866-1867, Busch na Alemanha pacientes infectados pelo Sarcoma com bactérias causadoras de erisipela, que resultaram em não apenas febre alta, mas também a remissão do tumor dentro de duas semanas, e iterações do procedimento impedido regrowth do tumor [4,11,12] . Em 1882, Fehleisen confirmou a terapia de Busch e identificou

Streptococcus pyogenes

como as bactérias causadoras de erisipela [13]. Em 1887, Bruns também curou um melanoma recorrente com erisipela e resumidos 14 casos relatados com remissão completa ou estável [14]. Durante 1891-1936, Coley em Nova Iorque injetada uma mistura de bactérias

S pyogenes

e

Serratia marcescens

[15] em doentes com sarcomas ou determinados cancros epiteliais [10]. Cerca de 500 dos 1000 pacientes tratados dessa maneira por Coley e outros mostraram regressão do tumor [15-18]. Provavelmente, esta mistura bacteriana, apelidado como “A vacina da Coley” ou “toxina de Coley”, não só é uma imunoterapia [15], mas também funciona através de hipertermia (HT), porque a sua eficácia dependia em larga medida se os pacientes responderam com febres elevadas [10 , 16]. Na verdade, a terapia de cancros HT actua em grande parte através da estimulação da função imunológica, incluindo a activação de células dendríticas, células assassinas naturais e da resposta imunitária de células T [19-21]. Além disso, muitos pacientes com câncer hipotermia manifesto ou se sentir “frio” durante a quimioterapia, possivelmente porque os erros do corpo da droga quimio para uma toxina e, portanto, reduz a temperatura para minimizar a sua “toxicidade” [22]. Se esta conjectura está correta, elevando a temperatura do corpo pode restaurar a eficácia quimioterapia.

Dois artigos importantes publicados em meados dos anos 1980 estabeleceram que uma temperatura de 42 ° C durante uma hora pode matar células cancerosas, poupando normais células [23,24] e, assim, definir uma meta térmica para 42-43 ° C para a terapia HT de câncer na maioria dos estudos recentes [25,26]. Muitos dispositivos têm desde então sido desenvolvidos e utilizados clinicamente para tratar o cancro, com o objectivo de elevar a temperatura do corpo a 43-45 ° C durante um período desde 15 minutos até 6 horas [27]. Este design de “um curto período de alta temperatura”, também é concebido porque não é prático para manter os pacientes no dispositivo por um longo período de tempo e, para muitas exposições repetidas. No entanto, a prática clínica tem demonstrado que estes dispositivos têm dificuldades em elevar a temperatura do tumor a 42 ° C. Uma vez que existem basicamente nenhum dos pacientes que mostram uma temperatura febril superior a 42 ° C, 39-42 ° C torna-se o objectivo em alguns estudos [26]. Stevens et al relataram que a cultura de COLO-357 células de cancro pancreático humano, a 42 ° C aumenta a fragmentação cromossoma, uma morte celular mitótico recentemente identificado, e a indução ocorre dentro de 24 horas [28].

Para além de uma térmica directa matar das células cancerosas, HT também foi mostrado para melhorar radio- e quimio-terapias de diversos cancros, especialmente as terapias com cisplatina [29-31]. Os mecanismos para essas melhorias de eficácia diferem entre os diferentes agentes quimioterapêuticos. Para cisplatina, HT aumenta a permeabilidade da membrana celular e fluidez que resultam na acumulação celular da cisplatina, e aumenta a formação de aducto de ADN-platina, enquanto inibe a reparação de danos no ADN causados ​​por cisplatina [29-31].

Determinação um leve efeito de um factor no crescimento celular in vitro é tecnicamente difícil. MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) métodos colorimétricos semelhantes que detectam as células viáveis ​​através da determinação da redução do MTT ou de um seu sal de tetrazólio relacionada pode detectar apenas a viabilidade celular para ensaio ou um período de vários dias. Isto porque, em uma placa de 96 poços as células não tratadas como controlos incluíram vai crescer até à confluência em poucos dias, que se manifesta como um planalto da densidade óptica de MTT reduzido. Relativo aos estudos de HT, uma vez que as células a uma temperatura HT e os seus controlos de 37 ° C são semeadas em duas diferentes placas de 96 poços para cultura em duas incubadoras diferentes, a variação é maior em comparação com o ensaio MTT de rotina no qual o grupo testado e seu controle estão na mesma placa. ensaio de crescimento Colony pode detectar um período mais longo de crescimento celular e fornecer informações sobre o crescimento incremental de cada célula inicialmente semeadas. No entanto, as células têm de ser semeadas a um número muito menor no prato de cultura para evitar a fusão das colónias. Para a maioria das linhas de células, as células devem ser cultivadas a uma densidade certo número ou porque as células precisar colaborar um com o outro, a fim de sobreviver ou crescer, o que é considerado como a versão de cultura de células do efeito Allee [32,33]. Portanto, em certa medida, o crescimento das colónias de ensaio escolhe aqueles subpopulações de sobrevivência e crescimento das células de que são menos dependentes da colaboração célula-célula, embora este efeito Allee

per se

pode também ser um parâmetro para avaliar um tratamento.

Materiais e Métodos

linhas de células humanas e reagentes

Hela linha de células de câncer cervical, A549 e linhas celulares de cancro de pulmão de células não-pequenas H1650, linha de células de cancro colo-rectal HCT116, bem como HEK293T (T grande de antigénio que expressam de rim embrionário humano), linha celular foram adquiridos a partir da cultura celular Tipo americana (ATCC) e usadas no estudo. botões de cravo secas foram comprados de um supermercado chinês. Para fazer o seu extracto de etanol, um grama de botões de cravo foi adicionado em 5 ml de etanol a 95% num tubo Falcon de 15 mL e a extracção foi deixada durante duas semanas à temperatura ambiente [34]. O etanol foi, em seguida, transferido para um novo tubo e considerado como um extracto de 100% para utilização. Além disso, um óleo essencial puro de botões de cravo foi adquirido a partir de agora Foods Bloomingdale, IL 60108, EUA, e foi diluída com etanol absoluto. O etanol foi utilizado como o controlo não tratado. Cisplatina e 5-fluorouracilo (5-FU) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com) e diluído com soro fisiológico ou DMSO, respectivamente.

cultura celular

as células foram cultivadas em duas incubadoras água-revestimento com a temperatura fixada em 37 ° C e 39 ° C, respectivamente. Para garantir a precisão e estabilidade da temperatura, um termômetro foi colocado nas incubadoras para monitorar a temperatura real. As incubadoras foram fornecidos com 5% de CO

2 que foi recalibrado agora e, em seguida, para garantir a precisão. Durante a mudança de meio, as placas de cultura foram levadas a cabo por fragmentada da incubadora para minimizar o tempo à temperatura ambiente. O meio fresco foi pré-aquecido na incubadora correspondente.

Ensaio MTT

As células na fase logarítmica foram recolhidas e semeadas numa placa de 96 poços a uma densidade de 8 x 10

3 por cavidade, seguido por cultura durante a noite para permitir a ligação. Para determinar o efeito de 37 ° C e 39 ° C culturas, as células foram deixadas crescer durante 72 horas adicionais. MTT foi então adicionado ao poço e, 3 horas depois, 200 mL de DMSO foi adicionada para dissolver o formazano à temperatura ambiente durante 30 minutos. A densidade óptica de MTT reduzido foi medido utilizando um instrumento Multiskan espectro com um programa fixo para o ensaio MTT como descrito antes [35,36]. Para determinar os efeitos das drogas quimioterapêuticas, após a fixação durante a noite, as células foram tratadas com um meio contendo cisplatina, 5-FU ou o extracto de cravo na concentração indicada durante 72 horas na temperatura de 37 ° C ou 39 ° C incubadora, com solvente de referência como o controlos não tratados.

coloração violeta cristal

As células foram semeadas a um número indicado por prato e cultivadas em 37 ° C e 39 ° C incubadoras com um meio RPM-1640 contendo soro fetal bovino a 5% e estreptomicina. O meio foi trocado a cada 3-4 dias ou quando a cor virou ligeiramente amarelo. Para o tratamento de drogas, foi adicionado um meio contendo uma concentração indicada de cisplatina, 5-FU ou o extracto de cravo. Antes da coloração com violeta de cristal, o meio foi removido e a placa foi suavemente lavadas com PBS. Um fixador (metanol-ácido acético, a proporção de 3: 1) foi adicionada para fixar as células durante 30 minutos. O fixador foi descartado e a placa foi deixada a secar ao ar completamente, seguido por coloração das células com uma solução aquosa de violeta de cristal a 0,1% durante 15 minutos. Depois de violeta de cristal residual foi lavado com água deionizada, o prato foi e fotografou com uma câmera digital de ar seco.

ciclo celular análise

As células foram cultivadas em placas de 60 mm até chegarem 70 ~ 80% de confluência. As células foram colhidas com tripsina digestão suave, lavadas com PBS frio, e em seguida fixadas com etanol a 70% em PBS durante 30 minutos. As células foram classificadas usando um fluxo Becton Dickinson FACS Calibur citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA). Depois as células foram fechado na trama FSC /SSC para excluir pequenos detritos, as populações de células em diferentes fases do ciclo celular foram quantificadas utilizando um software ModFit LT (Verity Software House Inc., Topsham, ME), como descrito anteriormente [35,37,38]. Em cada experimento, cada grupo foi definido principalmente em tripleto e os dados foram expressos como a média ± DP (desvio padrão).

A análise estatística

A maioria dos dados variaram consideravelmente entre diferentes repetições das experiências e assim foram analisados ​​por meio de Wilcoxon teste da soma de classificação. Os métodos utilizados foram indicados nas figuras correspondentes.

Resultados

HT pode provocar resultados em ensaios MTT

Nós geralmente observadas menos células ou densidades celulares mais baixos sob o microscópio, e detectado menor número de colónias de células, utilizando coloração com violeta de cristal, nos pratos 39 ° C do que os seus homólogos em 37 ° C, mas muitas vezes ensaio MTT deu origem a um resultado oposto (Fig 1A). ensaio MTT determina a redução de MTT, que ocorre no citosol, mitocôndrias e mesmo núcleo [39]. Uma vez que uma temperatura mais elevada geralmente aumenta reacções químicas, que tendem a concluir que a “viabilidade celular superior” a 39 ° C detectada por um ensaio com MTT é devido a um aumento da actividade de algumas das enzimas redutoras de MTT e, assim, é um artefacto. Em apoio a esta conclusão, o meio de cultura a 39 ° C, tornou-se amarela mais rápida do que a 37 ° C e necessário para ser mudado mais frequentemente, o que indica uma maior taxa metabólica, a 39 ° C. Uma vez que outros métodos colorimétricos para a detecção de viabilidade celular realmente detectar atividades metabólicas, bem [40-42], na maioria dos casos com um sal de tetrazólio como substrato [39], actualmente ainda não temos uma abordagem fiável e viável para quantificar o efeito do HT em cultura

A:. A densidade óptica de MTT é muitas vezes maior nas células a 39 ° C do que a 37 ° C, mesmo quando menos células a 39 ° C são observadas ao microscópio, indicando que a viabilidade celular pode ser sobrestimada a 39 ° C quando é utilizado um ensaio MTT. B, C e D: Tratamento de HeLa, A549 e HCT116 células com um cisplatina uM (CDDP), 4 uM de 5-FU ou 0,05% de extracto de cravo broto etanol diminui significativamente a viabilidade celular em comparação com o controlo não tratado à mesma temperatura (

um

em C, B e D, p 0,05;.

t

teste), enquanto comparação entre 37 ° C e 39 ° C não é recomendada

as células a 39 ° C crescer ligeiramente mais lentas

utilizando um ensaio MTT em que as células a 37 ° C e 39 ° C foram semeadas em placas de 96 poços separadas, não se detectou diferença óbvia na viabilidade de Hela, A549, HCT116, H1650 e células HEK293T entre as duas temperaturas (não mostrado), em parte devido à dificuldade técnica de ensaio de MTT descrito anteriormente. No entanto, a densidade celular visualizado por coloração com violeta de cristal era realmente menor nos pratos de 39 ° C do que nos 37 ° C (Figuras 2 e 3; painéis de controlo)

As células foram então tratadas com cisplatina 1 uM. ou 2? M de 5-FU durante 3 dias e, depois de o fármaco foi retirado, continuaram com a cultura durante 3 dias adicionais, de modo que as colónias de células crescem até tamanhos visíveis. Note-se que as células de controlo tratadas com solvente também mostram uma densidade inferior a 39 ° C do que a 37 ° C

Painel superior:. Cerca de 20.000 células HCT116 foram semeadas num prato de 35 mm e deixada a crescer durante 3 dias a 37 ° C ou 39 ° C. As células foram então tratadas com agente indicada durante 3 dias, seguido por coloração das células viáveis ​​com violeta de cristal. Painel inferior: As células foram tratadas como acima mas foram deixadas a crescer durante mais 3 dias após o tratamento de 3 dias com o agente indicada foi terminada. Note-se que a diferença na densidade celular entre 37 ° C e 39 ° C foi alargado para as células tratadas com cisplatina e cravo da índia, em comparação com o homólogo no painel de topo. No entanto, este efeito de pós-tratamento não é discernido em 5-FU células tratadas a 39 ° C.

De modo a determinar um efeito a longo prazo de 39 ° C sobre o crescimento celular, foi semeado única 1000-2000 células em um prato de 35 mm para que colônias de células não se fundem. Surpreendentemente, muitos menos colônias de tamanhos visíveis foram discernido nos pratos de 39 ° C do que nos 37 ° C após 6, 9, 12 e 15 dias de cultura (Figs 4 e 5). No entanto, sob o microscópio ainda havia colónias que eram menores do que o tamanho visível nos pratos de 39 ° C, embora o número de colónias minúsculas essas foi ainda menor em comparação com os pratos de 37 ° C. Estas diferenças, que eram mais evidentes para as células HCT116 (Fig 3), indicam que nos pratos de 39 ° C muitas células tinham morrido enquanto aqueles ainda vivos tinha sido preso ao crescimento. Conclui-se que as células precisam colaborar uns com os outros para a sobrevivência e replicação, que é o chamado efeito Allee no prato, e esta colaboração é inibida a 39 ° C. No entanto, a diminuição do número de células viáveis ​​a 39 ° C, quer devido a morte celular aumentada e /ou a replicação celular inibido, é tão mínimo que não pode ser discernida nos três primeiros dias de cultura.

Observe que há menos colônias de tamanhos visíveis na C prato 39 ° do que no 37 ° C um. As células A549 formam colónias maiores do que as células HeLa nos pontos de tempo posteriores, especialmente a 37 ° C.

O crescimento é muito mais lento a 39 ° C do que a 37 ° C, mas as células estão ainda vivos, como observado sob o microscópio (setas no 6 dias prato).

sob o microscópio, células Hela replicados em três dimensões, ou seja, também pode acumular-se em conjunto, o que fez a ampliação das colônias menos pronunciada em duas dimensões. As colónias esféricas derramado facilmente desligado durante a coloração com violeta de cristal, deixando apenas uma periferia das colónias no prato (Figura 6). Em contraste, as células A549 formado colónias muito maiores, porque estas células são maiores em tamanho celular e cresceram apenas em duas dimensões, sem se acumulando em conjunto, embora eles cresceram muito mais lentamente do que as células HeLa (Fig 4)

painel da esquerda.: células Hela crescem geralmente em três dimensões no prato para formar colónias esféricas que, após o crescimento para além dos 9 dias, vertente facilmente desligado durante a coloração com violeta de cristal, deixando o prato com apenas a periferia das colónias, especialmente no C prato de 37 °, em que o colónias são muito maiores. Painel da direita: Seis dias após as células foram semeadas células individuais, semeadas a uma densidade de cerca de 20.000 células por 35 mm de prato desenvolvem para colónias maiores, em comparação com as colónias no prato, em que as células foram semeadas a uma densidade de 2000 células. Células a 37ºC desenvolver colónias maiores do que a 39 ° C.

Efeitos de agentes quimioterapêuticos são potencializados e de longa duração a 39 ° C

Em comparação com o controlo não tratado correspondente, tratamento com uma baixa concentração de cisplatina (1 uM) durante três dias diminuiu ligeiramente a viabilidade das células Hela, mas não a de células A549 e HCT116, a 37 ° C; No entanto, ocorreram reduções de todas as três linhas de células a 39 ° C, tal como detectado por ensaios MTT (Fig 1B, 1C e 1D). A coloração das células em pratos com violeta cristal revelaram que todas as três linhas de células tratadas com cisplatina apresentaram uma densidade de células diminuiu em 37 ° C e, mais pronunciadamente, a 39 ° C (Figuras 2 e 3). A observação ao microscópio também tinham a mesma descoberta (não mostrado). Colectivamente, estes resultados confirmam que a 39 ° C potencia o efeito da cisplatina.

ensaios MTT detectada uma redução da viabilidade de células HeLa e células A549 tratadas com uma concentração baixa (4 uM) de 5-FU (Fig 1B, 1C e 1D). Outros e tínhamos relatado anteriormente que o extrato etanólico de botões de cravo teve um efeito terapêutico potente sobre uma variedade de linhas celulares de cancro [34,43,44]. Quando tratados com o extrato etanólico de botões de cravo, Hela, A549 e células HCT116 todos mostraram uma redução da viabilidade conforme detectado com ensaios de MTT (Fig 1B, 1C e 1D). No entanto, a coloração com violeta de cristal exibida diminuição da densidade de HeLa, A549 e HCT116 células tratadas com 5-FU ou o extracto de etanol de cravo a 37 ° C e revelou ainda um efeito mais pronunciado em células A549, mas mostrou praticamente qualquer efeito sobre células HeLa e células HCT116, a 39 ° C (Figuras 2 e 3). Como o etanol extrai principalmente componentes hidrofóbicos, que também tratados com estas linhas celulares de um óleo essencial de botões de cravo, o que resultou no efeito de eliminação potente bem (Fig 3). Estes resultados indicam que 39 ° C, de facto potencia sensibilidade quimioterapia, mas é a potenciação da linha celular e do agente de específico.

HeLa, A549, células H1650 e HEK293T não exibir diferença óbvia na morfologia entre 37 ° C e 39 ° C. No entanto, as células HCT116 foram normalmente em uma forma irregular, a 37 ° C, mas muitos deles encolheu para uma forma esférica, a 39 ° C (Fig 7). Quando tratados com uma concentração baixa (1 uM) de cisplatina, muitas células Hela a 39 ° C, mas não a 37 ° C, fuso mudado para a forma, que ocorreu tão cedo quanto 30 minutos após o tratamento (Fig 7). A uma concentração de 0,025%, óleo de cravo causada encolhimento celular e descolamento em menos de 30 minutos, que se tornou mais pronunciado a 39 ° C duas horas após o tratamento (Fig 7). Provavelmente, essas mudanças rápidas não pode envolver cascatas de ativação do gene e inativação

Painel esquerdo:. Células HCT116 a 37 ° C geralmente apresentam forma irregular (seta), mas tornam-se esféricos a 39 ° C. O tratamento com óleo de cravo 0,025% mata muito mais células a 39 ° C do que a 37 ° C, com as células restantes encolhidas a forma esférica no prazo de 30 minutos. Painel da direita: Trinta minutos após o tratamento com 1 pM de cisplatina (CDDP), muitas células Hela foram alterados para uma forma de fuso (seta) a 39 ° C, mas permanecem inalteradas a 37 ° C. Duas horas após o tratamento com óleo de cravo 0,025%, muito mais células Hela morrer a 39 ° C do que a 37 ° C.

Curiosamente, a inibição do crescimento e morte celular continua após a cisplatina foi retirado, como manifestado diminuição adicional na densidade celular ou do número de colónias determinado por coloração com violeta de cristal e observação microscópica, especialmente a 39 ° C e, quando as células foram semeadas a uma densidade baixa (figura 8). Essas mudanças foram mais evidente manifesta em células HCT116 (Fig 3). Na verdade, há basicamente não eram viáveis ​​HeLa, A549 e células HECT116 deixou três dias após a retirada cisplatina nos pratos de 39 ° C, enquanto que havia ainda um número significativo de células viáveis ​​nos pratos de 37 ° C. potenciação óbvio também foi discernido quando um tratamento de 3 dias com cisplatina a 37 ° C foi seguido de 3 dias de cultura a 39 ° C (dados não apresentados). Estes resultados sugerem que os efeitos de 39 ° C sobre o efeito quimioterapêutico da cisplatina é de longa duração, que vai para além do tratamento. No entanto, este efeito de pós-tratamento de 39 ° C era tanto de linha de célula e agente específico, uma vez que não era óbvio no óleo tratado cravo células HCT116 (Figura 3), nem em 5-FU tratada HCT116 e células Hela (Figuras 3 e 6 ).

As células foram então tratadas com cisplatina 1 uM, 4 uM de 5-FU ou o óleo de cravo 0,025% durante 3 dias. Depois de o agente ter sido retirado, as células foram deixadas a crescer durante mais uma semana. Note-se que há praticamente quaisquer colónias nas placas de 39 ° C da HeLa e células A549 tratadas com cisplatina, ou das células A549 tratadas com óleo de cravo, apesar de mais uma semana tinha sido dada para o crescimento, sugerindo um crescimento pós-tratamento inibição. No entanto, este efeito pós-tratamento a 39 ° C não é discernido em 5-FU tratadas células A549 petróleo tratados Hela ou cravo.

39 ° C células detenções em fase G1 e, por vezes, neutraliza estímulos de crescimento de soro

permitido Hela e células A549 a crescer a 39 ° C durante duas semanas ou mais, com as passagens, de modo que as células tinham adaptado ao meio HT. As células foram então analisadas para a distribuição do ciclo celular. Uma vez que os dados variar muito entre diferentes experiências, as análises foram repetidas para muitas vezes, com a maioria dos dados apresentados na figura 9. Uma fracção maior G1 e S fracções e G2-M mutuamente mais pequenas a 39 ° C, em comparação com os seus homólogos de 37 ° C, foram constantemente observados, confirmando assim que a cultura a 39 ° C provoca a paragem em G1 (Figura 9). células HCT116 cultivadas a longo prazo foram também analisadas, embora, como os controlos para o tratamento com cisplatina, e os resultados também mostraram uma paragem em G1 a 39 ° C (Figura 10).

Os dados são apresentados como média de pratos tripleto em cada experiência, mais ou menores desvio padrão (SD). Nalgumas experiências, um ou todos os grupos contêm apenas um único prato e, portanto, os dados não podem SD. “Sincronizado” significa que as células foram privadas de soro durante 24 ou 48 horas e em seguida reabastecido com soro durante o tempo indicado antes da determinação da distribuição do ciclo celular. “Exp”: número de experimentos realizados. “Temp”: temperatura da cultura.

a

: significativamente diferente do C homólogo 39 ° (p 0,05, Wilcoxon teste rank-sum de três repetições do experimento).

b

: significativamente diferente do C homólogo 39 ° (p 0,05, Wilcoxon teste rank-sum de pratos triplete dentro da mesma experiência).

C

:. Significativamente diferentes do grupo de reabastecido-soro à mesma temperatura 4 horas mais tarde (p 0,05, teste de Wilcoxon rank-sum de pratos de tripleto dentro da mesma experiência)

Exp: número de experimentos realizados. Tratar: tratamento. Temp: temperatura. Con: controle sem tratamento. CDDP: cisplatina. S /G2 /M é a soma das fracções S e G2-M que diferem a partir de células G1 pelo seu teor de ADN duplicada.

um

: significativamente diferente das células não tratadas a 39 ° C e a partir das células tratadas com CDDP a 37 ° C (p 0,05).

b

: Significativamente diferente a partir de células tratados com CDDP a 37 ° C (p 0,05).

C

: significativamente diferente a partir de células não tratadas a 39 ° C. Foi utilizado teste de Wilcoxon rank-sum.

Para determinar se as células a 39 ° C mostram uma resposta alterada a estímulos de crescimento derivados do soro, que retirou células Hela e A549 de soro por 24 horas, que alargou a diferença na fracção G1 entre 37 ° C e 39 ° C (Figura 9). Como esperado, quatro horas após a reconstituição soro, algumas células Hela preso-G1 reentrou no ciclo celular, que se manifesta como uma diminuição da fracção de G1 e aumentou fracções S e G2-M, em comparação com os homólogos privadas de soro. Uma vez que é bem conhecido, de acordo com a nossa experiência e de muitos outros, que a sincronização das células HeLa em G1 requer uma inanição mais soro, que também privados as células de soro durante 48 horas, o que, de facto aumentou ainda mais a diferença na fracção G1 entre as células famintas e reabastecido como esperado (Fig 9). A diferença entre soro fome e -replenishment também foi alargada a 39 ° C, indicando que os efeitos da privação de soro e uma temperatura mais elevada são aditivos em prender as células em G1.

A privação de células A549 a partir do soro também paragem em G1 causado. Surpreendentemente, no entanto, quatro ou mesmo 10 horas após a reconstituição de soro, a fracção G1 de células A549 apresentaram apenas um pequeno decréscimo na temperatura de 37 ° C, embora esta pequena redução ainda alargado a diferença entre privação de soro e de reabastecimento e entre 37 ° C e 39 ° C (Figura 9). Mais surpreendentemente, a 39 ° C, até 10 horas após a reconstituição de soro, as células A549 foram ainda não libertado da G1, o que indica que a paragem em G1 de células A549 de 39 ° C não pode ser superada por estímulos de crescimento de soro.

39 ° C e cisplatina alterar a distribuição do ciclo celular de uma linha de células específica maneira

como esperado, HeLa, células A549 e HCT116 tratado apenas com o solvente mostrou a paragem em G1 a 39 ° C, que se manifesta como um aumento fracção G1 e diminuição S e frações G2-M em comparação com os 37 ° C homólogos (destacados na Figura 10). No entanto, quando tratados com uma concentração baixa (1 uM) de cisplatina, estas linhas celulares exibiram diferentes perfis de distribuição do ciclo celular. células Hela manifesta uma paragem em G2-M típico, isto é, um aumento da fracção G2-M e uma diminuição recíproco na fracção G1, tanto a 37 ° C e 39 ° C, em comparação com os animais não tratados (figura 10). As células A549 tratadas com cisplatina constantemente manifesta uma paragem em G2-M a 39 ° C, mas a paragem em G1 muitas vezes manifestada a 37 ° C. Bastante diferente, as células HCT116 tratados com cisplatina não apresentou qualquer padrão constante de alteração da distribuição do ciclo celular, quer a 37 ° C ou a 39 ° C, provavelmente porque, na ausência de cisplatina em ambas as temperaturas, as células HCT116 já tinha uma relativamente alta soma das células S /G2-M que diferem das células G1 pelo seu conteúdo DNA duplicou (Fig 10).

Discussão

Há estudos abundantes publicados sobre a terapia HT de câncer, mas a maioria deles determinar apenas os efeitos de um curto período de HT, tão curto quanto alguns minutos ou horas [45-48]. Poucos estudos foram realizados em culturas de células, a uma temperatura moderadamente febril por um período mais longo do que um ciclo de ciclo celular, o que é um ou mais dias para a maioria das linhas celulares de cancro. Por esta razão, pouca informação está disponível para avaliação dos efeitos HT crónicas no crescimento celular e distribuição do ciclo celular. Para o nosso conhecimento, o mais longo período de estudo HT em cultura de células foi realizada pelo laboratório de Heng, o que mostra que, em uma cultura de 42 ° C durante duas semanas consecutivas, COLO-357 células de cancro pancreático humano manifestar uma inibição de crescimento inicial, mas mais tarde retomar o crescimento, com o aumento da morte celular em relação aos homólogos para a cultura 37 ° C [28]. Nós estudamos a influência crónica de 39 ° C sobre o crescimento celular e sobre os efeitos de diversos agentes quimioterapêuticos, que tem relevância clínica baseada em duas lógicas: Em primeiro lugar, a febre, a esta temperatura ocorre frequentemente em pacientes com cancro e não cancerosas, e pode durar durante dias. Em segundo lugar, historicamente, os médicos induzida longa duração da febre em pacientes para tratar os seus cancros. Por exemplo, alguns dos pacientes do Coley foram repetidamente induzidas a desenvolver febre por ano [18].

Na condução deste estudo, percebemos que uma temperatura mais alta pode aumentar as atividades das enzimas MTT-redutoras, que será resultar em uma maior absorvência de MTT reduzido e, assim, uma espúria da viabilidade celular. Na verdade nós já caiu nessa armadilha porque não tinha sido bem discutido em estudos publicados de HT. Uma vez que alguns produtos químicos podem alterar a actividade das enzimas redutoras de MTT [40], é possível que alguns produtos químicos terapêuticos podem resultar em artefactos semelhantes em ensaios MTT bem. Além disso, nós também percebemos que não só falta uma técnica viável para quantificar o efeito do HT sobre o crescimento de células em placas de cultura, mas também a falta de bons modelos animais para estudar efeitos in vivo de HT. As principais dificuldades no estudo animal, para além da possível preocupação ética no protocolo animal, incluem que os efeitos in vivo envolvem, em grande parte da imunidade inata e, assim, excluir a utilização de ratinhos imunodeficientes e que não têm boas pirogénios para induzir febre desde utilizada pirogénios si mesmos, tais como endotoxinas [49,50], podem ter efeitos anti-cancerígenos.

foi conhecido há muito tempo que, geralmente, as células devem ser cultivadas a uma densidade ou nero limite de uma placa de cultura, de outra forma que não irá crescer . A explicação para este fenómeno é que as células precisam colaborar uns com os outros, a fim de sobreviver e se replicar, o que é considerado como a versão de cultura de células do efeito Allee [32,33]. Uma das nossas novas descobertas é que algumas drogas de quimioterapia tais como a cisplatina e o 5-FU afectar esse limite, porque quando as células são semeadas numa densidade baixa, por exemplo 1000-2000 células por prato de 35 mm, a diferença no número de colónias entre droga quimio tratados e não tratados pratos é muito maior, em comparação com a situação em que mais de 20.000 células foram semeadas no prato. Uma temperatura superior, tal como um tipo de tratamento também afecta este limiar ao potenciar os efeitos de cisplatina e 5-FU sobre a colaboração célula-célula.