resistência

Abstract

A insulina é o denominador comum de várias doenças, incluindo diabetes tipo 2 e câncer, e investigar os mecanismos responsáveis ​​pela deficiência de insulina sinalização é de importância primordial. Um modelo matemático da rede de sinalização da insulina (ISN) é proposto e utilizado para investigar as curvas de dose-resposta dos componentes desta rede. Dados experimentais de mioblastos C2C12 com fosfatase e tensina homólogo (PTEN) suprimido e dados de miotubos L6 com resistência à insulina induzida foram analisados ​​pelo modelo. Estamos focados principalmente na fosforilação Akt simples e dupla e apontou alterações da sinalização de insulina relacionados à resistência à insulina. Além disso, uma nova caracterização da sinalização a montante do alvo de mamífero do complexo rapamicina 2 (mTORC2) é apresentada. Como é amplamente reconhecido que as proteínas ISN tem um papel crucial também na proliferação celular e a morte, o modelo ISN foi ligado a um modelo de população de células e aplicado aos dados de uma linha de células de leucemia mielóide aguda tratada com um alvo de mamífero de inibidor de rapamicina com actividade anti-tumoral. A análise revelou simples relações entre as concentrações de proteínas ISN e os parâmetros do modelo de população de células que caracterizam a progressão do ciclo celular e morte celular

citação:. Bertuzzi A, Conte F, G Mingrone, Papa F, S Salinari , Sinisgalli C (2016) sinalização de insulina em Resistência à insulina Unidos e Câncer: Uma Análise de Modelagem. PLoS ONE 11 (5): e0154415. doi: 10.1371 /journal.pone.0154415

editor: Cong Cao, Universidade de Suzhou, China

Recebido: 14 Dezembro, 2015; Aceito: 12 de abril de 2016; Publicado em: 05 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Bertuzzi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Os dados são tomadas a partir da literatura e as fontes relacionadas são relatados no jornal

Financiamento:. FP foi apoiada por SysBioNet, italianos Roteiro Infra 2012. Federica Conte foi apoiado pelo Projeto Epigenomics Flagship (Progetto Bandiera Epigenomica), epigénio , financiado pelo Ministério Italiano de Educação, Universidade e Pesquisa (MIUR) e do Conselho Nacional de Pesquisa (CNR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a resistência à insulina representa o denominador comum de uma série de doenças, incluindo a obesidade, a diabetes do tipo 2 (DT2), síndrome metabólica e cancro. Surge a partir do comprometimento da ação da insulina, que induz, consequentemente, a hiper-secreção de insulina. As principais vias dentro da rede de sinalização da insulina (ISN) estão bem estabelecidos [1,2,3], com a serina /treonina proteína quinase Akt /PKB e os dois Alvo da Rapamicina de mamífero Complexos (mTORC1 e mTORC2) desempenhando um papel especial. Akt é fosforilada em Thr308 pela proteína dependente de fosfoinositide-quinase-1 (PDK1) e em Ser473 por mTORC2 [4], e a actividade de Akt máxima é alcançada quando a molécula é fosforilado em ambos os resíduos, o que permite a translocação da insulina regulado transportadores de glicose (GLUT-4) em músculo e tecido adiposo [5,6]. PDK1 e mTORC2 também responder à activação do factor de crescimento 1 semelhante à insulina (IGF1) [3].

A cascata da quinase por meio do receptor de insulina (IR) até mTORC1, bem como a activação por mTORC1 aminoácidos e energia, são claramente avaliados [7]. Em contraste, a regulação a montante da mTORC2 ainda não está bem caracterizada [8]. O complexo esclerose tuberosa 1/2 (TSC1 /TSC2) parece ser necessária para a ativação mTORC2 [2,9]. No entanto, essa visão foi questionada em um estudo que relatou cursos de tempo experimentais de várias proteínas do ISN sob aminoácidos e estímulo de insulina [10]. Interpretação dos dados por um modelo dinâmico da rede, argumentou-se que mTORC2 via de ativação podem ser provenientes do IR ou do receptor de insulina substrato-1 (IRS1), possivelmente através de uma variante do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) [10] . Uma vista ainda diferente emergiu a partir de experiências em ratos não diabéticos, tanto in vivo e em biópsias musculares, e em células L6 expostas a um meio enriquecido com as proteínas segregadas pelo intestino delgado de ratos diabéticos e de soro de seres humanos resistentes à insulina [11]. Este estudo mostrou que o factor de jejuno /s induzir a resistência à insulina e que estes factores activar mTORC2, como revelado por um valor aumentado de fosforilação de Akt Ser473, mesmo na ausência de estimulação de insulina. A presença de tais factores intestinais é também sugerida pela diminuição da resistência à insulina após cirurgia da obesidade [12].

O p70S6 cinase substrato mTORC1 1 (S6K1) está envolvido na regulação da síntese de proteína e o crescimento de células tamanho e S6K1 ativo inibe IRS1 em um loop de feedback negativo [3]. Além disso, a caixa de Akt proteína substrato forkhead O1 (FOXO1) está envolvido na regulação da proliferação e apoptose, pelo que a rede de sinalização de insulina tem um papel importante não só na obesidade e diabetes, mas também em cancro [3,13,14].

Na sequência dos trabalhos seminais de Wanant e Quon [15] e de Sedaghat et al. [16], vários estudos têm investigado o comportamento do ISN induzida por estímulo de insulina através do desenvolvimento de modelos matemáticos e analisar os dados experimentais. Alguns estudos concentraram-se em resposta a um aumento na concentração de insulina no passo extracelular [15,16,17,18,19,20]. Em particular, o modelo matemático proposto por Kiselyov et ai. [17] foram responsáveis ​​por ambas as áreas de alta e baixa afinidade em os dois monómeros do receptor de insulina. Brännmark et ai. [18] estudou possíveis esquemas que explicam o comportamento observado em particular a fosforilação do receptor de insulina e o substrato do receptor da insulina. modelos dinâmicos mais completos, apoiados pela análise do tempo-curso de concentrações de proteína após a estimulação de insulina, foram desenvolvidos e investigados [10,19,20]. modelos dinâmicos complexos foram utilizados para representar a sinalização através do ErbB receptores até PI3K e Akt, com o objectivo de explorar a resposta a um fármaco anticancerígeno [21], e para modelar o início induzida insulina da tradução eucariótica [22].

as curvas de dose-resposta, isto é, as concentrações de estado estacionário, a determinados níveis de insulina, foram considerados em outros estudos. Giri et ai. [23] e Wang [24] estudaram o comportamento das curvas de resposta à dose de componentes do ISN em função da concentração extracelular de insulina, para determinar as condições que produzem uma histerese nas curvas como resultado das interacções entre os laços de realimentação negativos e positivos presente no sistema. Embora o tempo-curso experimental de concentrações de proteína sob mostra a estimulação constante de insulina que algumas proteínas podem não alcançar um estado estável evidente até 2 horas [10], as curvas de dose-resposta são largamente utilizados na literatura para avaliar o comportamento dos componentes ISN em vários níveis de estímulo de insulina e para avaliar a resposta a agentes perturbadores e drogas.

Objetivo do presente estudo é investigar os fatores que afetam as concentrações de proteínas basais e as curvas dose-resposta do ISN. Usando o esquema de Michaelis-Menten de reações químicas, foi desenvolvido um modelo matemático da rede no estado estacionário, que incide sobre a fosforilação de Akt simples e dupla e a sinalização a montante da mTORC2. Com base nos dados da literatura das linhas musculares esqueléticos, mostramos como o modelo pode representar os efeitos de silenciamento do gene. Os fatores que induzem resistência à insulina são modelados de acordo com as conclusões [11]. modelação melhorada dos complexos de Akt e mTOR também é utilizado aqui para simular a resposta ISN em condições tais como o tratamento TSC2 rapamicina nula e a longo prazo. Tendo em vista a estreita relação entre a resistência à insulina e do cancro, principalmente devido a Akt e a sinalização de mTOR, combinamos a insulina modelo de sinalização com um modelo população de células, a fim de investigar os efeitos de inibidores de mTOR com actividade anti-tumoral sobre as proteínas ISN e sobre o resposta população de células.

resultados

o esquema do nosso modelo na Figura 1 é baseado na visão atual da estrutura ISN [2,3,14,25]. Desde Akt fosforilada podem ser independentemente em Ser473 por mTORC2 e em Thr308 por PDK1 [8], que incluía todos os caminhos que conduzem à activação de Akt total. mTORC2 é assumida para ser activado pelo fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3), tal como sugerido em [3,26], e por um factor de J não dependente de PI3K, que é possivelmente mediada através dos receptores de factores de crescimento [11 ]. A ativação de mTORC1 está aqui representado de uma forma bastante simples, omitindo a inibição TSC por Akt ea consequente activação mTORC1 via o homólogo Ras enriquecido no cérebro (Rheb). O esquema também contém a substratos Akt glicogênio sintase-quinase direto 3 (GSK3) e proteína caixa de forkhead O1 (FoxO1). O S6K1 activado fosforila IRS1 e Rictor na retroalimentação negativa [25]. Um loop de feedback positivo de Akt à proteína tirosina fosfatase 1B (PTP1B) também está incluído [16]. Enquanto a via de ativação para mTORC2 através TSC2 (Huang, Dibble, Matsuzaki, Manning, 2008) não foi considerado, tendo em conta os resultados em [10], o modelo atual não inclui a simplicidade alguns caminhos estabelecidos da rede, para exemplo, a piscina IR intracelular e a reciclagem do receptor, a activação promovida por TSC2 FOXO1 [27] e a activação da GSK3 S6K1 por [28].

a activação por insulina (I) do receptor de insulina (IR) catalisa tirosina fosforilação de IRS1. IRS1 fosforilada se liga a subunidade reguladora p85 de PI3K, activando a subunidade catalítica p110. PI3K medeia a fosforilação de PI (4,5) -bisphosphate (PIP2) e PI (3,4,5) -trisphoshpate (PIP3), perto da membrana plasmática (PM) e da fosfatase e tensina homólogo (PTEN) desfosforila PIP3 volta para PIP2. PIP3 recruta Akt e PDK1 a PM, onde PDK1 fosforila Akt em Thr308 (fosfatase PP2A). mTORC2 é activado por PIP3 e pelo factor de J, e catalisa a fosforilação de Akt Ser473 em (fosfatase PHLPP). Akt actividade máxima é alcançada quando a molécula é fosforilado em ambos os resíduos Ser473 e Thr308, permitindo a translocação de transportadores de glucose GLUT4 para AM. E GSK3 FOXO1 são substratos directos Akt. Akt também ativa mTORC1, que por sua vez ativa S6K1. S6K1 activado fosforila IRS1 e Rictor em loops de feedback negativo. O loop de feedback positivo de Akt para PTP1B também está incluído. loops de feedback são representados por linhas arrojadas.

As reações químicas dentro do nosso modelo ISN são na sua maioria representada pelo regime de Michaelis-Menten clássica [29,30], e são discutidos em Arquivo S1 (Texto S1) . Várias hipóteses nos permitiu simplificar o modelo. localização intracelular de proteínas (citosólica vs associada à membrana), bem como o tráfego intracelular, foram negligenciados. Os complexos de proteína (por exemplo, mTORC1 e mTORC2) foram tratados como componentes moleculares simples.

As equações cinéticas para as concentrações das proteínas, que também contêm os termos de síntese e degradação de substratos e enzimas, são relatados em Arquivo S1 (S2 texto). Como o nosso objectivo é a análise das curvas dose-resposta, então, derivado das concentrações dos produtos químicos no equilíbrio. Sob o pressuposto fundamental, tal como sugerido em [31], que a constante de velocidade de degradação de um complexo enzima-substrato é insignificante em comparação com a soma de dissociação e constantes catalíticas, as equações de equilíbrio assumir uma forma bastante simples. As equações do modelo ISN na forma normalizada utilizada para a análise das linhas de células musculares C2C12 e L6 são relatados na secção Modelos, as Equações (1) – (16). S1 Tabela dá as expressões dos parâmetros nas Equações (1) – (16) em termos dos parâmetros cinéticos das equações em Arquivo S1 (Texto S2)

C2C12 mioblastos

A experimental. dados [32] exibir os níveis de fosforilação normalizados em células mioblastos C2C12 de IR (Tyr1146), Akt (Ser473) e (Thr308), GSK3β (Ser9), S6K1 (Thr389) e AS160 (Thr642) a insulina zero e a insulina concentrações de 1, 10 e 100 nM, mais as concentrações normalizadas de PIP3 e GLUT4

pm em insulina zero e em um valor de insulina atribuído. Os autores relatam os dados para controle e células PTEN-suprimidos, onde a concentração de proteína PTEN foi reduzida até 10% do controle. Usamos esses dados, exceto os das PIP3 e AS160 que foram utilizados para a previsão, para estimar os parâmetros do modelo ISN. O loop de feedback positivo de Akt para PTP1B não foi incluído porque os dados de fosforilação IR foram semelhantes no controle e células silenciou-PTEN (Fig 2 Painel A). Como feito em [20], os dados experimentais normalizados de pAkt (Ser473) foram ajustados pela soma, dada pelas Equações (10) e (11) na secção modelos, porque o anticorpo monoclonal específico é susceptível de se ligar Akt fosforilada em Ser473 independentemente da presença do Thr308 fosforilada. Da mesma forma, os dados de pAkt (Thr308) foram ajustados por.

[32] para o controle (quadrados pretos) e (quadrados vermelhos) com supressão de PTEN células

dados (média ± SEM) traçadas novamente a partir Ref. As linhas sólidas são as curvas de dose-resposta prevista pelo modelo de controlo (preto) e células com supressão de PTEN (vermelho). (A) PIR Relativa (Tyr1146). (B, C) pAkt Relativa (Ser473) e pAkt (Thr308). (D) pGSK3β Relativa (Ser9). (E) pS6K1 Relativa (Thr389). (F) GLUT4 Relativa à PM em zero (caixa branca) e 100 nM (caixa cinza) insulina.

Figura 2 mostra os dados de células C2C12, traçadas novamente a partir Ref [32] e utilizado para o estimação dos parâmetros de equações (1) – (16), com o

PTEN

n

na Equação (6) definido para uma para controle e 0,1 para os dados silenciou-PTEN . Fig 2 também mostra as curvas de montagem ideais computadas pelo modelo e S2 tabela relata as estimativas dos parâmetros (com

I

e

, 0,5 e

S

0,5 dada em vez de

a

0 e

a

1).

I

e

, 0,5 foi encontrado igual a 44,68 nM. Como os dados experimentais são re-normalizado para ter um valor de unidade na concentração máxima de insulina no controle, calculamos as curvas de dose-resposta na figura 2 de acordo com esta restrição.

Um subconjunto de previsões do modelo é apresentada em S1 FIG. O painel A mostra a previsão, obtido pelo modelo estimado, de pAS160 (Thr642) em conjunto com os dados que não foram usadas no procedimento de estimativa. Enquanto o perfil de dados pAS160 (Thr642) foi seguido com bastante precisão, o modelo de falha de prever os dados de concentração PIP3 nas células silenciados-PTEN (painel B). Notamos que, se mTORC2 foram ativados por PI3K, em vez de PIP3, o modelo não poderia caber adequadamente os dados PAKT (Ser473) em zero e baixa de insulina em células silenciou-PTEN, nem a previsão dos dados de concentração PIP3 iria melhorar (S1 Fig, painéis C , D). O pAkt total () a 100 nM de insulina no controle é de 8,61% do total de Akt (S1 Fig painel F) e GLUT4 na membrana plasmática é de 48,3% do total de GLUT4. Estes valores concordam com os resultados do modelo relatados em [16], onde pAkt é de cerca de 9% do total Akt e GLUT4 superfície atinge 40% do GLUT4 total após 15 min 100 nM de insulina.

S2 Fig mostra a sensibilidade dos as concentrações de proteína mediante uma perturbação ± 10% dos parâmetros estimados na concentração de insulina extracelular de 44,68 nM. Como esta concentração é igual a

I

e

, 0,5, a sensibilidade à

S

0.5 está desaparecendo. O mesmo ocorre para as sensibilidades a

a

12 (abaixo de 10

-5), enquanto que e têm valores pequenos (S2 tabela). As maiores sensibilidades positivos são encontrados em

a

9 e

a

10, cujos valores foram criados iguais (ver Tabela S2) como não existem dados sobre a fosforilação de PDK1 e mTORC2 estavam disponíveis. Parâmetros que afetam diretamente as proteínas a jusante, como mTORC1 e S6K1, também afetam as proteínas a montante, como IRS1 e PI3K, por causa da sinalização através do ciclo de feedback negativo. O comportamento oposto de

IRS

1

Y Comprar e

IRS

1

S

também é conhecida.

Como esperado, PTEN exclusão aumenta a resposta à insulina e níveis basais aumentou em quase todas as proteínas, de acordo com a sensibilidade negativa

um

8 de todas as proteínas PTEN a jusante, enquanto que

IRS

1

Y Comprar e PI3K são regulados positivamente (S2 Fig). Em particular, a supressão da proteína PTEN provoca um aumento da fosforilação basal Akt Ser473, que pode fosforilar e desactivar FOXO1 com a possibilidade de aumento de sinalização para as vias que regulam a proliferação celular.

miotubos L6

Como mostrado na Figura 3, os dados em [11] dos níveis de fosforilação dar normalizados em células L6 de pAkt (Ser473) e (Thr308) a insulina zero e às concentrações de insulina de 0,1, 1, 10, e 100 nM. pGSK3β (Ser9) é relatada em zero e 100 nM de insulina. Além disso, de pAkt (Ser473) e pS6K1 (Thr389) a insulina de zero foram medidos na presença dos inibidores de rapamicina e que os objectivos PP242 ambos os complexos de mTOR [33]. Os dados foram obtidos no meio de controlo, enriquecidos por proteínas secretadas pela mucosa do jejuno de ratos não diabéticos, e em meio enriquecido por proteínas secretadas pela mucosa de ratinhos diabéticos (denotado na forma como condicionada seguinte ou meio de db /db). Com base em experiências em ratos não diabéticos, tanto in vivo e em biópsias musculares, e em células L6 expostas ao meio de db /db e de soro de seres humanos resistentes à insulina, foi levantada a hipótese que o factor de jejuno /s induzir resistência à insulina [11] . O fator J que ativa mTORC2, ver Eq (8), foi incluída no modelo para representar a ação deste fator putativo.

Os dados (média ± SD) traçadas novamente a partir Ref [11], exceto o painel D da Ref [34]. Dados (quadrados) e ajuste do modelo (linhas sólidas) plotados em preto para controle e no azul para células expostas ao meio condicionado (db /db). (A, B) de pAkt Relativa (Ser473) e de pAkt (Thr308). (C) pGSK3β Relativa (Ser9) no (caixa branca) zero e 100 nM (caixa cinza) insulina. (D) Relativa captação de 2-DG em mioblastos L6 de rato. (E) de pAkt Relativa (Ser473) a insulina zero no controlo (preto) e as células expostas à DB médio /db (vermelho), na ausência de inibição e em células tratadas com rapamicina (50 nM) e PP242 (500 nM). A cor vermelha indica que os valores experimentais não preservar o aumento de pAkt basal (Ser473) de controlo de forma db /db, na ausência de inibição, e os asteriscos salientar que estes dados não foram usadas no modelo de ajustamento. Verde (sem inibidor), amarelo (rapamicina), e rosa caixas (PP242) representam montagem do modelo. (F) pS6K1 Relativa (Thr389) a insulina de zero na ausência de inibição e em células tratadas (as caixas representam os ajustes do modelo).

ajustar os dados experimentais assumindo que J possui concentração insignificante na meio de controlo e uma maior concentração, para ser estimada, no meio de db /db. Para ajustar os dados obtidos em meio db /db, a hipótese de que a resistência à insulina também aumenta devido a um aumento da degradação IRS1 devido à valorização do mTORC2 sinalização [35]. Este feedback negativo foi representado por meio do ajuste adequadamente os parâmetros de PI3K. Figura 3 mostra os dados experimentais de células L6, traçado de novo a partir de [11] e [34], juntamente com as curvas de ajuste óptimos, e S2 Tabela relata as estimativas dos parâmetros. Observa-se que um valor elevado de pAkt (Ser473) a insulina de zero, como observado na Figura 3, painel A só pode ser obtido se mTORC2 também é activado através de um independente via de sinalização de PI3K, e se a fosforilação Thr308 Akt não é necessário para Ser473 fosforilação.

os dados fosforilação medidos nos experimentos com meio db /db estão aptos com um valor de

J

substancialmente maior em relação ao controle (0,07 vs 0,001). pAkt (Ser473) a insulina de zero é muito mais acentuada, mas a sua resposta à insulina é atenuada (Figura 3A). A resposta de pAkt (Thr 308) e de pGSK3β (Ser9) também está deprimida (painéis B e C). Os dados de absorção de 2-DG relatados na figura 3D foram adequadamente caber pelo modelo. A absorção previu 2-DG na presença de db /db meio (painel D) foi calculado assumindo-se que as constantes de velocidade que regulam GLUT4 translocação para a membrana do plasma são menores em comparação com o controle [5,6], ver Tabela S2.

os dados medidos na presença de rapamicina e PP242 são mostrados Figura 3 painéis EF. O modelo se encaixa adequadamente a inibição da basal (não insulina) pS6K1 (Thr389), tanto no controle e db /db médio (painel F). S6K1 inibição conduz, por sua vez, por causa da realimentação negativa atenuada, a um decréscimo ou um aumento na (Fig S2, pains A-D), melhorando assim a sinalização de insulina. Nos dados basais pAkt (Ser473) (Fig 3, painel E), os pobres previsão para células expostas a db médio /db é causado pela variabilidade experimental e os dados não foram utilizados para o modelo adequado. Em células tratadas com rapamicina, o feedback negativo atenuado levou a um aumento de

mTORC Página 2

n

, aumentando assim pAkt. Por outro lado, PP242 afeta a fosforilação de Akt em Ser473, então

Akt

S Comprar e

AKT

T

,

S

são fortemente reduzida. Um subconjunto de previsões do modelo é exibido no S3 Fig, onde o painel F dá uma representação em 3D dos componentes do pAkt. A 100 nM de insulina, de pAkt total é de 78,7% do total de Akt no controle. No geral, parece que o actual modelo proporciona uma montagem adequada dos dados L6.

S4 Fig mostra as sensibilidades de concentrações de proteína para os parâmetros do modelo estimados na concentração de insulina extracelular de 9,69 nM (estimada

I

e

, 0,5). O padrão geral de as sensibilidades para as células L6 de controlo e em forma de db /db é semelhante ao encontrado para células C2C12, confirmando que o modelo é capaz de representar ambos os tipos de dados. Além disso, as sensibilidades a e pequena são de acordo com os pequenos valores de estimativa que, como esperado, as sensibilidades ao aumento J factor de células expostas ao meio de db /db em comparação com o controlo. A sensibilidade à

a

12 é pequena em ambas as células C2C12 e L6, sugerindo que o ciclo de feedback negativo a partir S6K1 para mTORC2 tem um papel insignificante nessas linhas.

A célula L6 dados também foram analisados ​​na presença do feedback positivo, com a constante

a

P

na Equação (4) definida para um valor menor para as células em meio db /db em relação ao controle. Os resultados, no entanto, não pareceu melhorar os obtidos com o modelo atual.

Simulações com melhores modelos de Akt e complexos de mTOR

Três extensões possíveis dos modelos de Akt e complexos mTOR são aqui considerados:. localização sub-celular Akt, a ativação mTORC1, ea resposta mTORC2 a rapamicina

o tráfico de moléculas dentro da célula é regulada por difusão e transporte ativo, processos que exigem um tratamento matemático complexo baseado na parcial equações diferenciais [36,37]. Para dar um modelo simplificado da localização sub-celular da Akt, só ter considerado a fosforilação de Akt em Thr308. Por conseguinte, temos moléculas Akt no compartimento citosólico (Akt

cit e pAkt

cit), aqueles localizados no PM (Akt

pm e pAkt

pm), e aqueles no núcleo (pAkt

nuc). Figura 4 Painel A mostra um esquema do modelo.

(A) PIP3 recruta PDK1 e Akt para a membrana plasmática. Na PM, Akt é fosforilada por PDK1 e desfosforilado por PP2A. Transporte de ainda não fosforilada Akt da PM de volta ao citoplasma é regulada pela constante de velocidade

k

-13. Fosforilada Akt é transportado para citosol (constante de velocidade

k

mc

), onde é desfosforilado por PP2A ou importados para o núcleo (

k

cn

). Exportação de núcleo é regulada pela

k

nc

. (B) fosforilada Akt inactiva TSC2. TSC2 ativa promove Rheb ligação ao PIB e TSC2 inativação estimula a conversão de Rheb /PIB para ativo Rheb /GTP, que por sua vez ativa mTORC1. mTORC1 também é inibida por PRAS40. A caixa incluindo mTORC1 ativa e substrato Akt rica em prolina de 40 kDa (PRAS40) é responsável por reacção (3) em S1 Arquivo (Texto S3). (C) PRAS knockdown (KD:

K

mTOR

aumentou dez vezes em relação ao controle e

φ

= 0,7, caixas cor de rosa) e superexpressão (OE:

K

mTOR

metade dos valores registados para controlar e

φ

= -5/6, caixas amarelas) e efeito sobre a ativação mTORC1 a 1 nM de insulina. (D) as concentrações normalizadas Rheb /GTP e T389 S6K1 a 1 nM de insulina com PRAS knockdown (dez vezes

b

PRAS

diminuição, caixas cor de rosa), PRAS superexpressão (dupla

b

PRAS

aumento, caixas amarelas), e com os dois PRAS (dupla

b

PRAS

aumento) e Rheb (cinco vezes

b

Rheb

aumento) superexpressão (caixas de laranja). (E) concentrações de proteína normalizada em células TSC2 nulos em 1 nM de insulina. (M) Resposta a curto prazo e a rapamicina tratamento a longo prazo de mTORC1 e mTORC2, e efeito sobre a fosforilação de Akt a 10 nM de insulina. tratamentos de curto e longo prazo:

K

mTOR

na Equação (14) do arquivo S1 (Texto S3) definido para 0,1 do controle. Prazo com o tratamento longo: parâmetros e da Akt Eqs (9) – (11) definido para 0,1 do controle

As equações das concentrações Akt são dadas em S1 Arquivo (Texto S3) e show. que, no estado estacionário, as três concentrações de Akt fosforilada tendem a ser igual, desde que

k

nc

≅

k

cn

e

k

mc

≅

K

15

PP Página 2

A

.

Akt

cit

tende a ser igual a

Akt

pm

desde que equivale a

K

13

PDK

1 e

k

-13 é muito menor do que essas duas quantidades também em níveis baixos de insulina. Além disso,

k

mc

deve ser muito maior do que

K

14

PP Página 2

A

. Embora não temos dados que garantam que essas condições sejam satisfeitas, eles garantem que a maioria de Akt

cit atinge com segurança PM e é fosforilada, e que pAkt

pm é rapidamente translocados do PM para citosol, onde ele tem para fosforilar diversos substratos . Nestas condições, o modelo de Akt considerados em S1 Ficheiro (Texto S1, textos S2) e Eq (9) – (11), onde a localização sub-celular foi descartado, pode ser considerada um modelo adequado da cinética de Akt no estado estacionário . Observamos, no entanto, que a resposta transiente de concentrações de Akt a uma mudança repentina na concentração de insulina é susceptível de ser diferente se a localização sub-celular é considerada ou não.

Figura 4 painel B mostra o esquema de o modelo melhorado de activação mTORC1. Equações (12) – (15) no ficheiro S1 (Texto S3) dar as concentrações normalizadas dos componentes moleculares e os dados da literatura fornecer informações sobre a resposta a proteína Akt. nível de fosforilação TSC2 em T1462 tem um aumento de mais de 10 vezes em células HEK-293 após estimulação sérica [38]. O aumento do nível de fosforilação PRAS40 no T246 pode variar de cerca de 10 vezes a 20 vezes no músculo esquelético isolado com valores menores no coração, fígado e tecido adiposo [39]. Estes dados fornecidos restrições na estimativa dos parâmetros nas Equações (12) – (15), e singularidade das estimativas foi garantida através da criação

φ

= -0,67 (

b

PRAS

= 3

b

mTORC

1, ou seja, a taxa de síntese PRAS é três vezes maior do que o heterotr�ero mTOR, raptor, mLST8) e. Para estimar os parâmetros restantes, tomamos os perfis de e

mTORC

1

n

em função do

I

e

obtida a partir do modelo de células L6. O perfil do foi usado como a função de entrada em (12) e (15) do S1 Arquivo (Texto S3), e os valores de parâmetros para a melhor reproduzidas

mTORC

1

n

perfil foram os seguintes:

K

TSC

= 65,95,

K

Rheb

= 6,48,

K

mTORC

1 = 7,2 · 10

-3,

K

PRAS

= 16,72.

as simulações apresentadas na Figura 4, painéis CF, foi utilizado o modelo ISN completa das equações (1) – (16) com a Equação (14) do

mTORC

1

n

substituído pelas Equações (12) – (15) do ficheiro de S1 (Texto S3). A perda de expressão PRAS40 foi representado no modelo por uma redução de dez vezes de

b

PRAS

relação ao controle, com as consequentes alterações de

K

mTOR

, e

φ

em (14) – (15) do arquivo S1 (Texto S3). Fig 4C mostra a diminuição da

PRAS

40

n

eo aumento da

mTORC

1

n

nesta condição, em relação ao controle. Por outro lado, PRAS40 superexpressão com um aumento de duas vezes em

b

PRAS

inibe a ativação mTORC1. Na Figura 4D, as concentrações normalizadas de T389 S6K1 sob PRAS knockdown e superexpressão (caixas de rosa e amarelo, respectivamente) siga a resposta do

mTORC

1

n

mostrado no painel C. sob ambos PRAS e Rheb superexpressão (caixas de laranja), mTORC1 e S6K1 não é inibido em relação ao controle, porque a GTP carregado Rheb supera a inibição mTORC1 mediada por PRAS40, como apontado em [38] e previu pela equação (14) em S1 arquivo (Texto S3). Os resultados das simulações no painel D parecem concordar, qualitativamente, pelo menos, com o aumento da fosforilação T389 S6K1 mostrado pelas manchas na Figura 4E (células HEK293E) e a Fig 5E (MEFs e HT-29 do cancro do cólon células) de [40] .

(a) Esquema de modelo utilizado para a análise de dados sobre a população de células AML na ausência e na presença de AZD8055. Os blocos representam G1, células de G0 /S e G2M, com o bloco de × 2 denotando a divisão celular binário.

λ

1 é a constante de velocidade de transição G1S,

T

2 e

T

3 os tempos de trânsito nas fases S e G2M e

μ

‘a constante da taxa de perda de células. D

1-D

3 representam células perdidas dos compartimentos viáveis ​​mas ainda mensurável, e A os corpos e fragmentos apoptóticos, com

μ

” a constante de velocidade de fragmentação celular. (B) de dados, traçado de novo a partir de Ref [44], de fracções de células em diferentes fases do ciclo celular em células de controlo e tratados com 10, 100 e 1000 nM de AZD8055 (quadrados fechados), e os ajustes do modelo (linhas sólidas). O painel também exibe dados e montagem de LI normalizada para controlar, e da fração total de células mortas e fragmentos. (C) A correlação entre os dados de coloração com alaranjado de acridina em células A549, traçado de novo a partir de Ref [43], e a fracção de células mortas. (D) Relação entre a diminuição de pAkt (Ser473) (quadrados) e que de

λ

1 a concentrações crescentes de drogas. linha de montagem

y

= 1,03

x

/(0.18·10

-2+

x

), com

y

= pAkt (Ser473 ) e

x

=

λ

1. Uma função semelhante se encaixa a relação entre GSK3β (Ser9) (triângulos) e

λ

1.