Abstract

Introdução

Em estudos randomizados com EGFR TKI apenas uma pequena proporção de pacientes com NSCLC foram geneticamente perfilado biópsias. Diretrizes fornecem evidências para realizar a análise EGFR e mutação KRAS em não-escamosas NSCLC. Nós exploramos a qualidade biópsia do tumor oferecido para testes de mutação, distribuição mutações diferentes, e os resultados com EGFR TKI.

Pacientes e Métodos

Os dados clínicos a partir de 8 hospitais regionais foram estudadas para paciente e do tumor características, o tratamento e sobrevivência global. Biópsias enviadas para o laboratório central foram avaliados quanto à qualidade do DNA e subsequentemente analisados ​​para mutações nos exons 18-21 de EGFR e exão 2 de KRAS por análise da sequência bidirecional.

Resultados

Os tumores de 442 subsequente pacientes foram analisados. Para 74 pacientes (17%) tumores eram inadequados para análise de mutação. Trinta e oito pacientes (10,9%) tinham mutações EGFR com 79% mutações ativadoras conhecidos. Cento e oito pacientes (30%) tinham mutações KRAS funcionais. O espectro de mutações foi comparável à base de dados cósmica. Após o tratamento no primeiro ou no segundo linha com TKI de EGFR sobrevivência global mediana para pacientes com EGFR (n = 14), KRAS (n = 14) mutações e de tipo selvagem de EGFR /KRAS (n = 31) não foi atingido, 20 e 9 meses , respectivamente.

Conclusão

Um em cada amostras de tumores 6 era inadequado para a análise de mutação. Os pacientes com mutações EGFR activação tratados com EGFR-TKI tem a maior sobrevida

Citation:. Kerner GSMA, Schuuring E, Sietsma J, Hiltermann TJN, Pieterman RM, de Leede GPJ, et al. (2013) ordinárias e EGFR Raras e KRAS mutações em um Dutch Non-Small-Cell Lung Cancer População e sua evolução clínica. PLoS ONE 8 (7): e70346. doi: 10.1371 /journal.pone.0070346

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de março de 2013; Aceito: 17 de junho de 2013; Publicação: 29 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kerner et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo consórcio CTMM Força Aérea (https://www.ctmm.nl). CTMM paga salário de GSMAK e não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Não há outras fontes de financiamento externas para este estudo

Conflito de interesses:. O CTMM Força Aérea Consortium é um consórcio público /privado com a participação de universidades, empresas privadas e do governo. Não é uma fonte comercial de financiamento. Gerald Kerner é financiado pelo CTMM consórcio para executar o projecto de investigação (investigação de translação e de imagem no cancro do pulmão), que é uma parte de sua tese. Os autores têm o direito de publicar todo o seu trabalho e compartilhar todos os seus dados publicamente. Não consultoria, patentes ou produtos em desenvolvimento estão envolvidos. Todos juntos, isso não tem impacto para a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Todos os autores declararam não ter quaisquer interesses concorrentes.

Introdução

O efeito de inibidores da tirosina quinase de EGFR (TKI) em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas-(NSCLC) depende da mutação EGFR estado. Portanto, a seleção da amostra de tumor adequadas para análise mutacional é uma questão importante na tomada de decisões de tratamento em NSCLC. Em estudos aleatorizados anteriores comparando a terapia TKI de EGFR a quimioterapia normal, a proporção de doentes com tecido de tumor adequada para análise variou de 10 a 38% [1], [2], [3], [4], [5], [6 ]. A maioria dos estudos randomizados utilizados testes de mutação EGFR diferentes que só examinados um número muito limitado de mutações de ponto de acesso, como L858R e exão 19 eliminações [2], [7], [8], [9], [10]. O que aconteceu com mutações menos frequentes nem sempre é óbvia. Como mutações EGFR só estão presentes em NSCLC não-escamosas [11], fenotipagem histológico preciso é fundamental, a fim de tomar decisões sobre o tipo de quimioterapia e para prever a presença, a priori, de mutações. A diretriz IASLC /ATS /ERS recomenda o teste de mutação em NSCLC não-escamosas [12].

Em pacientes caucasianos com carcinoma do pulmão de células não-escamosas, a mutação KRAS é mais comum (20-30% dos casos) [13], [14], seguido em frequência por mutações no gene de EGFR (10-20% dos casos) [13], [15]. Dentro fenótipos histológicos, certas características parecem estar associados com mutações específicas, por exemplo, o aspecto micropapilar de adenocarcinoma com mutações BRAF V600 [16]. Embora seja vantajoso para pacientes com mutações de activação do EGFR para receber TKI de EGFR [2], [3], [8], [17], [18], [19], em pacientes com outros tipos de aberrações genéticas este tratamento não é eficaz. Por exemplo, num estudo em pacientes com EML4-ALK translocações uma falta de resposta do tumor a TKI EGFR foi relatada [20]. No entanto, para pacientes com NSCLC com mutações KRAS a evidência é inconclusiva. Vários estudos mostraram uma ausência total de resposta ao tratamento com um TKI de EGFR [17], [21], [22], um estudo mostrou que os doentes com NSCLC com tumores com mutações KRAS teve um resultado semelhante a um TKI de EGFR, ou quimioterapia [3] . Tumores com mutações no KRAS tem sido demonstrado que têm pior evolução em comparação com pacientes com KRAS tipo selvagem (WT), tanto quando tratados com a cirurgia [23] ou com quimioterapia [24].

O objetivo é estudar a distribuição de EGFR comum e rara e mutações KRAS enviada a partir de 8 hospitais regionais para o departamento de patologia da universidade. A qualidade das biópsias de tumores enviadas para análise mutacional foi avaliado e estado de mutação relacionada com o tratamento com o resultado EGFR TKI.

Métodos

Os pacientes

Este estudo diz respeito a toda a NSCLC amostras de tumor de oito hospitais holandeses regionais durante o período de novembro de 2008 até abril de 2011, que foram testadas para o estado mutacional por um departamento de patologia central. Dados sobre sexo, tabagismo, idade no momento do diagnóstico, o estágio no momento do diagnóstico, a localização das metástases, data de início e linhas (diferentes) de tratamento recebido foram recolhidos. amostras de tumor foram obtidos por qualquer broncoscopia, biópsias pulmonares transtorácicos e /ou a partir de ressecções pulmonares e foram enviados para o respectivo departamento de patologia para exame histológico. Histologia foi de acordo com critérios da OMS de 2004 [25]. A resposta ao tratamento foi realizado de acordo com os critérios RECIST [26].

procedimento de coleta de amostras e DNA extração

De cada e embebidos em parafina (FFPE) bloco de tecido tumoral fixado em formalina que foi enviado para o departamento de patologia 4 mm seções foram cortadas. Depois de hematoxilina e eosina, as lâminas foram avaliadas por um patologista pulmonar experiente para a presença de tecido tumoral suficiente e calculando a percentagem de células tumorais. As amostras com claramente menos do que 50 células tumorais% foram definidos como inadequados para testes de mutação EGFR /KRAS. Áreas com células tumorais 50% marcados pelo patologista no slide. Esta área foi raspada da lâmina utilizando um bisturi e dissolvido em TE-4 e 20 mg /ml de Proteinase K (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA). O DNA foi extraído por incubação durante a noite a 55 ° C, seguido por aquecimento a 100 ° C durante 5 minutos para inactivar a proteinase K e centrifugadas à temperatura ambiente a 13000 rpm. A solução aquosa foi utilizado directamente para análise por PCR ou armazenado a -20 ° C. concentração de ADN foi medida num espectrofotómetro ND1000 (Nanodrop, Wilmington, DE, EUA). Todos os isolados de DNA foram estabelecidas a 10 ng /ul em TE-4, antes de usar. Para o controlo de qualidade, o ADN genómico foi amplificado por PCR em multiplex em uma contendo um conjunto de iniciadores de controlo do gene, resultando em produtos de 100, 200, 300, 400 e 600 pb, de acordo com o protocolo BIOMED-2 [27]. Somente amostras de DNA com produtos de PCR de 300 pb e maiores foram utilizados para a análise de mutação. Todas as amostras foram testadas em ADN extraído de duas lâminas independentes (duplicados). Todas as precauções padrão foram tomadas para evitar a contaminação dos produtos de amplificação utilizando laboratórios separados para o manuseio pré e pós-PCR. Para evitar a contaminação cruzada, uma nova lâmina micrótomo foi usada cada vez que uma nova amostra foi seccionada.

De qualquer sequenciação directa ou fusão de alta resolução (HRM) com sequenciação directa confirmação foi realizada de acordo com o protocolo. Mutações idênticas em frente e reverso sequenciamento era necessária antes de um resultado positivo é relatado. O protocolo está detalhado no Apêndice S1. Os iniciadores utilizados para a sequenciação directa ou HRM estão descritos na tabela suplementar 1.

Consentimento Informado e Ética

Quando os pacientes primeiro visitou o ambulatório, o consentimento informado escrito para sangue e tecido do tumor foi obtida por análise mutacional. testes EGFR e KRAS foram realizadas como parte da abordagem de diagnóstico de rotina e os resultados desses testes foi documentada no arquivo do paciente e se comunicava com os pacientes. Porque este é um estudo retrospectivo para recolher e analisar dados clínicos do paciente, sob a lei holandesa para a investigação médica humana (OMM), sem consentimento era necessário a partir da comissão de ética médica. Os dados foram codificados e não rastreáveis ​​para o paciente individual.

Estatísticas

As estatísticas descritivas foram realizadas para paciente e do tumor características. Frequências de mutações raras e comuns foram tabulados. A frequência de mutações EGFR e KRAS foram comparados com os dados disponíveis sobre o tecido pulmonar a partir do Catálogo do Somatic mutações no banco de dados do Câncer, (Cosmic DB; https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). A relação entre a presença ou ausência de mutações e a ocorrência da maioria das metástases tumorais comuns foi determinada utilizando o teste exacto de Fisher dois lados. Para esta análise em particular os pacientes, quer com um EGFR ou uma mutação KRAS foram comparados com os doentes que foram classificados como sendo ambos o EGFR e KRAS WT. A sobrevida global (OS) foi calculado a partir da data de diagnosticar a doença IV palco até a censura ou a morte. Somente os pacientes com os dados clínicos disponíveis, que haviam progredido para o estágio IV da doença e, posteriormente, foram tratados foram incluídos para análise de sobrevivência. Todos os doentes tratados com um TKI de EGFR, independentemente do seu estado mutacional foram avaliados para a sobrevivência global.

univariada de Cox análise de regressão foi realizada com a idade covariáveis, sexo, histologia (presença de adenocarcinoma, células escamosas e carcinoma de células grandes) , KRAS e estado EGFR mutação, local metastático (cérebro, ossos, pulmão) também foram analisados. As variáveis ​​com

p

-valor menor que 0,20 foram utilizados para a análise multivariada.

Toda a análise estatística foi realizada usando SPSS versão 18.0. Nominal

P

-Valores inferior a 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

EGFR e as mutações KRAS

De novembro de 2008 até abril 2011 474 amostras de 442 pacientes foram enviados para o departamento de patologia central para análise de mutação. A classificação histológico mais comum foi o adenocarcinoma (80%), 8% das amostras vieram de subtipos histológicos não associados com mutações EGFR (Tabela 1).

Duzentos e vinte e um pacientes (60,1% de todos os pacientes testados , 50% de todos os pacientes) foram EGFR e KRAS WT. Trinta e oito doentes (10,9% de todos os pacientes testados, 8,6% de todos os pacientes) tinham uma mutação do EGFR (Tabela 2). Em 5 pacientes, 2 mutações de EGFR coincidiu diferentes no mesmo tecido de tumor, resultando em um total de 43 mutações. Trinta dos 38 pacientes com mutações EGFR (79%) eram mutações ativadoras do EGFR. Apenas um paciente teve uma mutação T790M no tumor primário. TTF-1 adenocarcinomas positivos mostraram uma mutação EGFR mais frequentemente do que aqueles que eram TTF-1 negativo (26/150 vs 1/50, teste exato de 2 faces de Fisher,

p

= 0,01).

um total de 110 de pacientes (30% de todos os pacientes testados, 24% de todos os pacientes) tinham uma mutação KRAS com G12C (41%) e G12V (18%), sendo as mutações mais frequentes e que mostra uma semelhante distribuição como no banco de dados cósmica (Tabela 3). Nós também descobrimos 1 (1%) mutação KRAS rara no códon 13, (p.G13Y). Além disso, 2 pacientes tinham mutações KRAS fora do hotspot (p.V14L e p.L19F), estes são não-funcional. Isto significa que, em um total de 108 pacientes com uma mutação KRAS funcional foi detectado no nosso coorte. A comparação dos resultados de mutações nos diferentes subtipos de NSCLC em nossa população é mostrada na tabela 4.

Qualidade de amostras de tumores para análise de mutação

Setenta e cinco amostras de tumor ( (16%) não eram adequados para a análise de mutação. no tecido 59 amostras continham células tumorais menos de 50% (principalmente por causa da extensa inflamação entrelaçamento) e em 16 a qualidade do DNA apareceu inadequados para testes de mutação. em 4 destes pacientes uma adequados amostra de tecido foi proporcionado por re-biópsia. Em 3 tumores sem posterior análise de mutações foi realizada (SCC /carcinóides). Isto significa que a partir de 74 (75 + 4/3) (17%) pacientes não houve resultados foram obtidos a partir da análise mutacional. Em um total de 345 pacientes as amostras de tumor foram adequados para ambos o EGFR e análise KRAS. uma análise KRAS ou mutação do EGFR único foi realizado em amostras de tumor de 18 e 5 pacientes, respectivamente (Figura 1).

* 2 mutações KRAS estão fora do hotspot, estes são, provavelmente, não funcional.

EGFR e KRAS mutações e metástases distribuição

Usando os dados clínicos de 303 pacientes, que foram capazes de analisar o preferência para as regiões metastáticos comuns conhecidos para os pacientes com NSCLC com estado mutacional do KRAS e EGFR. nódulos pulmonares

(p

= 0,01), vertebral (

p

= 0,03) e outra metástase óssea (

p

= 0,04) foram identificados a ser significativamente associado com mutações EGFR . Não foi encontrada associação entre mutações EGFR e pleural (

p

= 0,15), cerebral (

p

= 1,0), hepática (

p

= 0,46) ou adrenal (

p

= 0,37) localizações metastáticas. Nenhum desses sites foram associados com mutações no KRAS.

Survival análise

Na análise univariada a partir dos dados clínicos, grande histologia celular (HR 1,8; IC95%., 1,2-2,8,

p

. 0,01) e da coluna vertebral metástase óssea (HR 1.5, 95% CI, 1,0-2,2,

p

= 0,05) foram associados com pior sobrevida, enquanto a mutação EGFR (HR 0,4, 95 .% CI, 0,2-0,7,

p Art 0,01) foi associado a uma sobrevida melhor. Em um modelo multivariado, histologia (carcinoma de células grandes, HR 2.2, 95% CI, 1,4-3,4,

p

. 0,01)., Metástase óssea da coluna vertebral (HR 1,7, 95% CI, 1,2-2,6 ,

p

. 0,01), eo estado mutacional (mutação EGFR, HR 0.3, 95% CI, 0,1-0,6

p Art 0,01) foram significativamente associados com a sobrevivência. (Tabela 5).

Ao selecionar pacientes que receberam tratamento TKI EGFR na primeira ou na segunda linha, a sobrevida média geral após o início do tratamento não foi atingida em pacientes com mutação EGFR (n = 14 ), 20 meses (95% CI., 0-46, n = 14) para pacientes com mutação KRAS e 9 meses (95% CI., 0-28, n = 31) para pacientes com EGFR /KRAS WT. (Figura 2A e 2B).

EGFR Raras e KRAS mutações e resposta ao tratamento

As mutações que não foram anteriormente descritos em COSMIC DB são descritos na tabela 6. O tratamento com um EGFR TKI em pacientes com essas mutações EGFR raras não resultou em benefício clínico, exceto em um paciente que também tinha uma mutação ativadora EGFR adicional.

Discussão

EGFR é uma proteína da superfície celular que conduz à activação da proliferação e invasão por meio de diferentes vias de transdução de sinal [28]. KRAS é um alvo a jusante de EGFR. Activar ou sensibilizantes mutações causam uma activação constitutiva do domínio da tirosina quinase da proteína EGFR, por desestabilizar a conformação autoinhibiting [29]. EGFR TKI tais como gefitinib aumentaram capacidades de ligação para estas proteínas mutantes. Os rácios de este aumento da capacidade de ligação é até 100 vezes em comparação com a proteína EGFR do tipo selvagem [29].

As duas mutações mais comuns de sensibilização EGFR EGFR TKI, em exclusões de quadro de exão 19 e a mutação L858R [19], [30], [31], [32], [33] representou mais de metade de todos os pacientes de mutação EGFR. Outros sensibilizadores aberrações foram encontrados em três pacientes que têm uma mutação G719X e em outro doente de uma mutação L861R [33], [34], [35]. Observou-se 5 mutações raras ou previamente não descritas (Tabela 2) e têm caracterizado sua resposta ao tratamento TKI (Tabela 6). De nota específica é a mutação p.D770GY, que foi encontrada em dois pacientes, com uma resposta diferente. O primeiro destes pacientes tinha uma combinação de p.D770GY e uma mutação p.G719C enquanto o segundo tinha apenas uma mutação p.D770GY. O primeiro paciente respondeu a EGFR TKI e permanece livre da doença após 15 meses, enquanto o paciente sem a mutação secundária tinham doença progressiva diagnosticado em 4 semanas. Anteriormente 2 casos desta mutação foram descritas, sem informação sobre a resposta do tumor [36], [37]. Os nossos dados sugerem que a mutação p.G770GY não proporcionar benefícios para o tratamento TKI de EGFR. Além disso, demonstramos que também pacientes com um dos outros 4 mutações EGFR raros (p.K708N, p.G709_T710 M, p.L833F e p.A840T) teve nenhum benefício de EGFR-TKI

pequeno. amostras de tumores, principalmente de broncoscopia ou biópsias transtorácicos pode ser um problema para o teste de mutação adequada. Foram identificadas as causas por que a análise mutacional em nosso laboratório não foi possível em 17% dos pacientes. Este foi, quer devido a número insuficiente de células tumorais (12%) ou devido a qualidade do DNA insuficiente (4%) destacando a necessidade de adequada seleção tecido do tumor para análise mutacional. Estudos retrospectivos em que a longo prazo de parafina arquivados tecido embebido foi utilizado para determinar o status EGFR mostrou uma baixa proporção de tecido tumoral adequada disponível [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Uma maneira de obter mais células tumorais ocorre por biópsias ou cryobiopsies [38] repetidas. Novos desenvolvimentos tecnológicos são muito mais sensíveis do que anteriormente, permitindo que menos células tumorais tanto qualitativamente (%) e quantitativamente (número absoluto), necessários para a detecção de mutações. No entanto, em relação a heterogeneidade do tumor, aumento de sensibilidade abriga um aumento do risco de erros de amostragem e detecção de clones menores que podem ser menos relevantes para terapia. Um estudo mostrou que cerca de dois terços de todas as mutações somáticas parecia não ser detectável em toda a região a cada tumor [39].

mutações EGFR ocorreu sobretudo em TTF-1 adenocarcinoma positivo. Dois estudos recentes mostraram esta associação linhagem de células [40], [41]. Funcionalmente, induzida TTF-1 ROR-1 é necessário para sustentar o EGFR via em linhas de células de adenocarcinoma de pulmão [42] sinalização.

Identificamos a preferência de tumores mutantes EGFR a se espalhar para intrapulmonar e tanto para a vértebra e outras localizações ósseas. Isto contrasta com um estudo realizado por Doebele et al, que observou apenas uma preferência por metástase hepática em EGFR tumores mutantes [43] .Em contrapartida, observou-se o padrão miliar típico de tumores com EGFR exão 19 exclusão, como descrito anteriormente [44]. Nossos resultados para tumores KRAS mutante (71 pacientes) foram como descrito anteriormente por Doebele et al (49 pacientes) [43].

Em nossa população o resultado de pacientes com uma mutação KRAS respondeu de forma semelhante ao KRAS WT ambos com respeito à quimioterapia e ao EGFR TKI. Anteriormente, foi demonstrado que pacientes com KRAS tipo selvagem tem um resultado melhor do que os pacientes com mutações KRAS quando tratado com um TKI de EGFR [22]. Outros estudos mostraram a presença de mutações KRAS no câncer de pulmão a ser indicativos de pior resultado, independentemente do tratamento que receberam [45], [46]. No estudo TITAN, houve alguma evidência de um maior risco de morte em pacientes com tumores KRAS mutante tratados com erlotinib em comparação com quimioterapia, mas não houve um risco elevado de progressão do tumor [4]. Em nosso estudo, nós não reunir os pacientes positivos mutação EGFR com o EGFR /KRAS WT quando se comparam essas pacientes com pacientes KRAS mutante. Como os pacientes com mutações EGFR tendem a ter melhores resultados, em seguida, os pacientes EGFR WT, isso poderia explicar os nossos resultados.

Em conclusão, verificou-se em 10,9% e 30% de todos os pacientes testados uma EGFR ou mutação KRAS, respectivamente . Também identificamos 5 novas ou EGFR raras mutações e 2 novas mutações KRAS em nossa população. Dezassete por cento dos pacientes tinham tecido tumoral inadequada para realizar a análise de mutações, principalmente devido ao volume do tumor insuficiente e /ou porcentagem. Não houve diferença na sobrevida global após o início do EGFR-TKI em pacientes com mutação KRAS e EGFR /KRAS WT.

Informações de Apoio

Apêndice S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0070346.s001

(DOC)

Reconhecimentos

Somos gratos a Klaas Kooistra, Erik Nijhuis, Anke van de Berg por sua contribuição a análise de mutações EGFR e Roel Soesbeek para ajudar com a recolha de dados.