Abstract

Os microRNAs estão sendo explorados para o diagnóstico, prognóstico e acompanhamento do câncer e outras doenças. Sua alta especificidade de tecido e papel crítico na oncogênese fornecer novos biomarcadores para o diagnóstico e classificação de câncer, bem como os resultados dos pacientes prevendo. assinaturas microARNs foram identificados por muitos tumores humanos, incluindo o cancro colorrectal (CRC). Na maioria dos casos, a doença metastática é difícil de prever e para evitar com terapias adequadas. O objetivo do nosso estudo foi identificar uma assinatura microRNA para câncer colorretal metastático que poderiam prever e diferenciar metastático localização órgão-alvo. Foram analisados ​​os tecidos normais e de cancro de três grupos diferentes de pacientes de CRC. micromatriz de ARN e análise de arranjo de TaqMan foram realizados em 66 pacientes italianos com ou sem nódulos linfáticos e /ou recorrências fígado. Os dados obtidos com os dois ensaios foram analisadas separadamente e em seguida, se cruzaram para identificar uma assinatura metastática primária de CRC. Cinco microARNs diferencialmente expressos (HSA-miR-21, -103, -93, -31 e -566) foram validados por qRT-PCR em um segundo grupo de 16 doentes norte-americanos metastáticas.

In situ

hibridação foi realizada nos 16 doentes norte-americanos, bem como em três distintas tecidos microarray comercial (TMA) contendo cólon normal adjacente, o adenocarcinoma primário, nódulos linfáticos normais e metastáticas e fígado. HSA-miRNA-21, -93 e -103 regulação positiva juntamente com HSA-miR-566 downregulation definida a assinatura metastático CRC, enquanto

in situ

dados de hibridização identificados um perfil invasão linfonodal. Nós fornecemos a assinatura primeiras microRNAs que podem discriminar entre as recorrências colorretal para os gânglios linfáticos e do fígado e entre metástase hepática colorectal e tumor hepático primário

Citation:. Drusco A, Nuovo GJ, Zanesi N, Di Leva G, F Pichiorri , Volinia S, et al. (2014) MicroRNA Profiles discriminação entre Colon Cancer Metástase. PLoS ONE 9 (6): e96670. doi: 10.1371 /journal.pone.0096670

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha |

Recebido: 04 de janeiro de 2014; Aceito: 10 de abril de 2014; Publicação: 12 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Drusco et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant microRNAs U01 CA152785 /UCRs: biomarcadores para o risco de câncer, detecção de tumores, progressão e tratamento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A principal causa de morte em pacientes com câncer é a doença metastática [1]. Câncer células difusão tem sido considerado um evento tardio multi-passo durante o desenvolvimento do tumor. Após o crescimento do tumor primário, seleccionado geneticamente, as células malignas invadem o tecido local, para introduzir o sangue e /ou vasos linfáticos, são transportadas para locais distantes e colonizam novos tecidos de órgãos. Evidências recentes sugerem que a disseminação do tumor poderia ser um evento anterior que acabará por manifestar após vários anos de diagnóstico [2] – [5]

O câncer colorretal é a terceira neoplasia maligna mais comum no mundo desenvolvido após pulmão e mama. câncer: cerca de metade dos doentes morrem da doença metastática no prazo de 5 anos desde o diagnóstico [6]. Os primeiros locais de doença metastática do cancro colorectal são os linfonodos regionais e fígado. O exame patológico de adenocarcinoma de cólon não pode prever com precisão os pacientes que têm doença disseminada para os gânglios linfáticos locais e /ou para locais distantes. No entanto, no cólon, bem como em pacientes de cancro da mama e o melanoma, a presença ou a ausência de nódulos linfáticos invasão pode influenciar o tipo de ressecção cirúrgica ou o tipo de regime de quimioterapia [7] – [9].

Embora as metástases para o fígado muitas vezes vêm de cancros do cólon, há casos em que a metástase é o primeiro e único encontrar em pacientes com um local de tumor primário desconhecido [10], e a distinção entre lesões hepáticas primárias e metástases hepáticas a partir de diferentes locais possíveis é de valor terapêutico e prognóstico [11].

assim, há uma necessidade crescente de novos biomarcadores de diagnóstico e prognóstico, que era capaz de discriminar entre o tumor primário e as metástases de diferentes locais, bem como prever a propensão de metástase do tumor primário.

os microRNAs ou miRNAs, são pequenas (19-25 nucleotídeos) RNAs não codificantes, que regulam a expressão de genes de pós-transcricional suprimindo tradução do mRNA, e /ou causar degradação mRNA. Eles estão envolvidos na regulação da maioria dos processos fisiológicos [12], e são expressas de forma aberrante na iniciação e progressão do tumor, prevendo o estado da doença e o resultado clínico [13], [14]. Curiosamente, assinaturas microRNAs são altamente tecido específico e pode ser usada para classificar tipos de câncer, e identificar o tumor primário de uma lesão metastática de origem desconhecida [15] – [19].

O objetivo do nosso estudo foi identificar uma assinatura microRNA que pode permitir a diferenciação entre linfonodal e metástases hepáticas em pacientes com carcinoma colo-rectal.

Materiais e Métodos

amostras de tecido do paciente

Três grupos de pacientes eram considerada no estudo (Tabela 1).

embebidos em parafina tecidos provenientes de 66 pacientes diagnosticados com carcinoma do cólon foram selecionados a partir da Universidade de Roma “La Sapienza”, UOC Anatomia ed Istologia Patologica C /Cardiovascolare, banco de tecidos de acordo com o estadiamento TNM.

Dentre 66 pacientes, 18 apresentaram um tumor de cólon primário, sem metástase (Qualquer T, N0, M0), 33 tinham cancro do cólon com linfonodos única metástase (Qualquer T, qualquer N, M0) e 15 foram diagnosticados com cancro do cólon, os linfonodos e metástases hepáticas (Qualquer T, qualquer N, M1). amostras de tumor separado do tumor primário, os gânglios linfáticos metastáticos e a metástase do fígado foram coletados para cada paciente e processados ​​para microsséries de tecido e TaqMan matriz MicroRNA Cartões

.

Um segundo grupo de 16 pacientes provenientes dos arquivos do OSU Departamento de Patologia foram incluídos no estudo. Para cada paciente, tecido normal do cólon, do cólon primário adenocarcnoma, linfonodos metastáticos e metastático do fígado foram analisados, bem como os correspondentes linfonodos normais e de fígado, quando disponíveis. A TMA que foi gerado a partir destas amostras de doentes mais três conjuntos de matrizes de tecidos US Biomax (BN05014 com 24 casos, BC05118 com 50 casos, CO702 com 69 casos) foram usadas para Hibridização In Situ (ISH). casos US Biomax representam o terceiro grupo de pacientes incluídos no estudo com os tecidos normais adjacentes do cólon, adenocarcinoma de cólon primário sem linfonodo /metástases à distância e de cólon primário câncer de pacientes com nódulos linfáticos documentados e metástase hepática, e o linfonodo real e /ou metástases hepáticas

o projeto foi aprovado pelo italiano (Presidente -. Prof. Aldo Isidori, Prof. Lucio MIANO, Dott.ssa Amalia Allocca, Dott.ssa Enrica ARDUINI, Dott.ssa Maria Caporale, Prof. Luciano CAPRINO, Dott.ssa Avia CARABELLI, Prof. Francesco Cognetti, Dott.ssa Anna DALLE ORE, Prof.ssa Marzia Duse, Dott.ssa Giuseppina DI Giammarco, Dott. Domenico Antonio IENTILE, Prof. Giovanni Fabbrini, Prof.ssa Paola FRATI , Dott.ssa Maria Teresa LUPO, Prof. Franco MANDELLI, Dott. Enrico MARINELLI, Dott.ssa Boza MAURO, Prof. Paolo MENE ‘, Dott.ssa Elisabetta SIMONGINI, Prof. Pietro SERRA, Prof. Giovanni SPERA, Dott. Ettore TIBERI , Avv. Angelo TUZZA, Prof.ssa Annarita vestri, Prof. Vincenzo ZIPARO) e americanos (https://orrp.osu.edu/irb/irbforms/) Commettee Ética (Prot.1119 /13, Prot.2007E0748 respectivamente). Especificamente, ambos os Commettees, da Universidade Institucional Conselho de Pesquisa do Estado de Ohio e il Comitato Ético “La Sapienza”, nos isentos de pacientes consentimento informado uma vez que, em ambos os casos, parafina tecido embebido foram anonimamente amostras arquivadas, selecionados de acordo com o seu estadiamento TNM e os pacientes não estavam mais disponíveis.

RNA extração

o RNA total foi extraído de processamento de cinco 20 mm de espessura de cada tecido embebido em parafina, utilizando o ácido nucleico Kit RECOVERALL total isolamento (Ambion # 1975) e seguindo foram realizadas as instruções do fabricante.

rotulagem de ARN e de hibridação em chips de microarrays de miARN como previamente descrito [20]. Cinco ug de cada RNA total da amostra foi hibridizada em nosso miRNA microarray (Ohio State Comprehensive Cancer Center, versão 2.0), que contém 460 sondas de miRNAs maduros, visto em quadruplicado (235

Homo sapiens

, 222

Mus musculus

, e três

Arabidopsis thaliana

). sondas diferentes foram usadas para reconhecer cada miRNA maduro e a maioria dos precursores miRNAs. sinais de hibridização foram detectados com Estreptavidina Alexa Fluor 647 conjugados e imagens digitalizadas (Axon 4000B) foram quantificados utilizando o software GenePix 6.0 (Axon Instruments). As mesmas amostras foram também analisadas com cartões de RT-PCR (Applied Biosystems).

miARN microarray

Os microarrays foram essencialmente analisados ​​tal como descrito por Liu et al [21]. Quantis normalização e análise estatística foi realizada utilizando ArrayTools BRB desenvolvidos por Richard Simon e Amy Peng Lam [22].

miRNAs diferencialmente expressos foram identificados utilizando um teste t random-variância. O t-teste aleatório-variância é uma melhoria sobre o t-teste separado padrão, uma vez que permite o compartilhamento de informações entre os genes cerca de variação dentro da classe sem assumir que todos os genes têm a mesma variância. Genes foram considerados estatisticamente significativos se o seu P-valor foi menor que 0,05. [23].

testes de múltipla foi controlado usando a taxa de detecção falsa. miRNA nomenclatura foi estabelecido de acordo com o navegador UCSC Genome (https://genome.ucsc.edu/) eo miRBase (https://www.mirbase.org/); Em caso de discrepâncias a miRBase foi seguido.

estão disponíveis no site do GEO Os dados brutos (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350) .

TaqMan matriz MicroRNA Cartões e quantitativa PCR em Tempo real

real Time PCR foi realizada utilizando o TaqMan matriz painel MicroRNA Humano (v.1, Applied Biosystems, Foster City, CA) e 50 ng de ARN por porta para um total de 400 ng. Esta matriz contém 365 alvos miRNA, bem como controles endógenos. A normalização foi realizada com pequenos RNAs nucleares (snRNA) U44 e U48. Expressão de miARNs maduros individuais foi avaliada pela TaqMan miRNAassay (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), e normalizada para RNUB6 (Applied Biosystems). Os dados brutos estão disponíveis no site do GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350).

A hibridização in situ

a hibridação in situ foi realizada para microARNs seleccionados na sequência de um protocolo previamente descrito [24], usando Exiqon LNA-5’DIG sondas marcadas. Três microarrays de tecido USBiomax (TMA) lâminas (matriz tecido normal do cólon com 21 casos normais e 3 casos de adenocarcinoma, cancro do cólon e matriz normal anexa adaptada tecido com 25 casos, arranjo de tecido de câncer de cólon com metástase e tecido normal adjacente com 68 casos) e um foram utilizados slides com núcleos de tecido de 16 pacientes (OSU TMA). Para cada microARN seleccionado, TMA foram pontuados de acordo com a expressão relativa de cada microARN núcleo por dois patologistas como definida pela percentagem de células de tumor positivas e a intensidade do sinal nestas células cancerosas em casos positivos. As pontuações foram gerados cegos para a presença ou ausência de doença metastática e o teste de Mann-Whitney foi aplicado para comparar as classes

Resultados

Nosso estudo foi desenvolvido em quatro etapas, aproveitando.: (I) As micromatrizes de ADN, (ii) Taqman cartões de alta densidade, (III) ensaio Taqman único qRT-PCR e (IV) de hibridação in situ. Para alcançar resultados mais robustos, usamos três diferentes grupos de pacientes (Tabela 1). O primeiro grupo incluiu 66 pacientes italianos (III Clinica Chirurgica, Universita ‘di Roma “La Sapienza”, de Roma, Itália) com adenocarcinoma do cólon: 18 pacientes não têm qualquer metástase, 33 tinham afetado os gânglios linfáticos e 15 apresentaram metástases em ambos os gânglios linfáticos e fígado. Total de RNAs de 18 tumores primários do cólon (T) sem metástase, 33 tumores do cólon primários (T

N) com recidivas linfonodais e as correspondentes 33 linfonodos metastáticos (N

N), 15 tumores primários do cólon (T

L,) de pacientes com linfonodal e doença metastática hepática e as correspondentes 15 linfonodos metastáticos (N

L) e lesões hepáticas (L), foram testados na plataforma de microarray personalizado que tinha sido anteriormente utilizado para estabelecer microARN cancro assinaturas em diversos estudos [13], [14], [21], e em Taqman matriz microRNA Cards (Applied Biosystems). Os dados foram normalizados de acordo com os requisitos da plataforma e as mesmas comparações entre as classes foram aplicados em ambos os conjuntos de dados separadamente. Significativamente foram identificados miRNAs alterados e os resultados foram cruzaram. Somente com uma diferença microARNs mudança vezes maior do que 2 ou menor do que 0,5 foram considerados como os pró-metastáticos e anti-metastáticos miARNs putativos respectivamente. Doze microRNAs foram consistentemente sobre-regulada na metástase (HSA-miR-103, -155, -16, -191, -200C, -21, -24, -26, -26b, -29, -31 e 93) e apenas dois foram regulados negativamente (HSA-miR-328 e -566) (Tabela 2).

a estratégia dupla matriz nos permitiu testar as mesmas amostras com duas abordagens técnicas diferentes.

Para confirmar ainda mais a assinatura identificada “metastático”, microRNAs selecionados foram testados em dezesseis pacientes americanos com câncer de cólon metastático (OSU Patologia Dept., Columbus, OH). Para cada paciente, o RNA total de núcleos de tecido embebidos em parafina de cólon normal e maligno, nódulo linfático e do fígado, foi ensaiada por único qRT-PCR. O teste de Mann-Whitney foi aplicado para comparar os resultados da PCR entre os diferentes grupos de pacientes.

adenocarcinomas do cólon metastático mostrou uma superexpressão significativa de hsa-miR-21 (P-value = 0,0011), -31 (P -valor = 0,0003), -93 (P-valor = 0,0048), -103 (P-valor = 0,0142) e a regulação negativa do conjugado de HSA-miR-566 (P-valor = 0,0075) quando comparado com o seu tecido normal adjacente (Tabela 2 ). Além disso, o respeito ao normal, hsa-miR-21 e -93 foram significativamente upregulated na metástase do fígado com um valor P = 0,020 e P-value = 0,0002, respectivamente. HSA-miR-21 também foi overexpressed significativamente nos gânglios linfáticos metastáticos (P-valor = 0,009) (Figura 1). Estes cinco microRNAs validados não se correlacionou com o estadiamento do tumor.

tecido do cólon normal (NORM), adenocarcinomas do cólon (ADENOCA), metástase linfonodal (POSLYM) e fígado cólon (LIVERMET) para miR-21 (A), miR -31 (B), o miR-93 (C), o miR-103 (D) e miR-566 (e). Um teste de Mann-Whitney foi aplicado para comparar os grupos. Os grupos são mostrados no eixo-x dos boxplots, enquanto os valores de Ct Delta são representados no eixo dos y. Para cada caixa, a barra representam a mediana, a área de 25

th e 75

percentil e os bigodes do gráfico os maiores valores e menores. Cada barra P-valor corresponde a uma comparação: para cada miR a primeira barra inferior refere-se à norma vs comparação ADENOCA; miR-21 segundo abaixo bar P-valor corresponde ao NORM vs comparação POS linfa, enquanto a primeira barra superior de ambos miR-21 e -93 corresponde ao NORM vs comparação FÍGADO TEM.

tumores, as células inflamatórias e do estroma estão espalhadas entre as células epiteliais benignas e malignas, e variavelmente contribuir para a celularidade da lesão. É, portanto, essencial para compreender o tipo de célula expressa um microRNA específico. Para este efeito, em experiências de hibridação in situ foram realizadas em TMA com adenocarcinomas primários, linfonodos metastáticos, metástases hepáticas e tecidos normais. HSA-miR-21, -93, -103 e -566 sondas foram hibridizadas em OSU TMA e USBiomax TMA slides. Dois patologistas independentes teve cada núcleo corrediça cegos para o local da biópsia do núcleo e à história estadiamento clínico, considerando-se a intensidade de sinal de células malignas do cólon em comparação com as células epiteliais normais adjacentes e não-epiteliais (Fig.2). HSA-miR-21 (valor de P 0,0001) e -103 (P-valor = 0,0009) foi significativamente sobre-expressa em adenocarcinomas e os cancros metastáticos, quando comparados com os normais (figura 2: A, B). Um teste de Qui-quadrado revelou uma tendência linear para ambos, hsa-miR-21 (P-valor 0,0001) e HSA-miR-103 (P-valor 0,0001): eles estavam cada vez mais regulada progredindo de normal, para adenocarcinoma e metástase (Fig.3, Fig.4). No entanto, enquanto hsa-miR-103 foi significativamente sobre-expressos em metástases hepáticas quando comparado com adenocarcinomas e linfonodos positivos, hsa-miR-21 não mostraram qualquer diferença significativa entre as três classes. ISH de hsa-miR-93 confirmou a sua regulação positiva em adenocarcinomas e metástases hepáticas, mostrando uma diferença significativa entre normais e ou adenocarcinomas (P-value = 0,0345) ou metástase de fígado (P-valor = 0,007) e entre adenocarcinomas e metástase hepática (P -valor = 0,043). Nenhuma diferença significativa foi encontrada na comparação normais e adenocarcinomas contra linfonodos positivos (Fig. 2C e Fig.5). Assim, hsa-miR-93 expressão padrão poderia diferenciar cólon normal a partir de adenocarcinoma primário, e de cólon normal e adenocarcinoma primário da metástase hepática, mas não de invasão lymphnodal tumoral secundária. HSA-miR-566 foi igualmente sobre-expressa no tecido do cólon normal adjacente, as células malignas adenocarcinoma primário do fígado e células metastáticas do cólon (Fig. 2D). No entanto, os gânglios linfáticos positivos mostraram um sinal significativamente mais fraca em relação aos normais (P-valor = 0,002) e adenocarcinoma (P-valor = 0,043), sugerindo que a perda de hsa-miR-566 pode facilitar a linfa invasão nó no câncer de cólon.

com tecido normal do cólon (NORM), adenocarcinomas do cólon (ADENOCA), metástase linfonodal (POSLYM) e fígado cólon (LIVERMET) para miR-21 (a), miR-103 (B), miR-93 ( C), o miR-566 (D) e miR-200 ° C (e). Um teste de Mann-Whitney foi aplicado para comparar os grupos. Os grupos são mostrados no eixo-x dos boxplots, enquanto os valores médios de pontuação são representados no eixo dos y. Para cada caixa, a barra representam a mediana, a área de 25

th e 75

percentil e os bigodes do gráfico os maiores valores e menores. Cada barra P-valor corresponde a uma comparação: para miR-21, -103, -93, e -200C a primeira barra inferior corresponde à norma vs comparação ADENOCA; miR-21, -103 e -93 primeiras barras superiores se referem ao NORM vs comparação FÍGADO MET, enquanto que miR-566 e -200C barra superior mostra o NORM vs comparação POS linfáticos; miR-566 e miR-200c barras inferiores indicam a ADENOCA vs POS linfa e do NORM vs comparação POS LINFA respectivamente.

Como documentado na literatura, miR-21 mostrou um sinal fraco em relação normal de dois pontos para adenocarcinoma (P-valor = 0,0011) e foi altamente expressa em metástase. MiR-21 foi detectada expressão apenas no adenocarcinoma primário e células malignas metastáticas.

No cólon normal, a seta está apontando para a falta de miR-103 expressão em células epiteliais. No tumor primário a seta está apontando para o aumento da expressão de miR-103 no adenocarcinoma invasivo. A seta na recorrência fígado e as duas setas nas metástases linfáticas estão mostrando um aumento da expressão dramática de miR-103 no epitélio adenocarcinoma metastático.

Indução de epitelial-a-Mesenquimal Transição (EMT) tem sido considerado um passo importante no desenvolvimento do cancro metastático. Recentemente, tem sido demonstrado que a HSA-miR-103/107 indirectamente regula negativamente o miR-200 membros da família, e que tal padrão está associada com o fenótipo mesenquimal em linhas celulares de cancro da mama [24].

No nosso estudo, a plataforma de microarray e ensaio TaqMan, tanto isolado HSA-miR-103 e miR-HSA-200c. Queríamos entender se, como no câncer de mama metastático, estes dois miRNAs foram inversamente correlacionados no cancro metastizado do cólon. Apesar de não ser significativa por qRT-PCR, TMA foram hibridizados com a sonda hsa-miR-200c e marcou (Fig. 2E). Em comparação com os normais, uma intensidade de sinal mais elevada foi detectada em adenocarcinomas (P-value = 0,0023) e gânglios linfáticos positivos (P = 0,0006). A correlação positiva entre HSA-miR-103 e miR-HSA-200c estava presente em metástases em linfonodos (P-value = 0,0225), mas não em adenocarcinomas ou metástase hepática. Portanto, hsa-miR-103 e HSA-200c não foram inversamente correlacionados e não regulam EMT no câncer de cólon metastático

in vivo

, mas ambos foram sobre-expressos em adenocarcinomas e metástases em linfonodos. Nós não investigar hsa-miR-107 ou quaisquer outros membros da família miR-200 por causa EMT não era relevante para o objectivo do nosso estudo.

Curiosamente, hsa-miR-31 ISH (dados não mostrados) revelado um sinal muito forte nas células inflamatórias circundantes dos tumores. A coloração mais fraca foi observado em células do cólon tumorais e normais, mas apenas alguns HSA-miR-31 de linfócitos que expressam estavam presentes em gânglios linfáticos normais, sugerindo que a HSA-miR-31 supra-regulação resultou principalmente do inflamatória, em vez de a partir do componente maligno do tumor

a Tabela 1 apresenta o número de casos com estadiamento TNM que foram analisados ​​em cada etapa técnica do nosso estudo.; A Tabela 2 mostra as assinaturas de microRNA obtidos com cada procedimento técnico.

Discussão

A edição AJCC 2009 publicou um novo câncer de cólon classificação TNM, em que, subclasses foram adicionados ao (N) estadiamento da doença nodal. Outros autores propuseram-se substituir estas categorias N com o número de nódulos linfáticos positivos, e várias publicações cirúrgicos têm sugerido uma linfadenectomia mais radical a definir melhor o prognóstico, a fim de melhorar a sobrevivência do cancro do cólon pacientes [26] – [29]. invasão nodal é um passo crítico para a definição de pacientes com câncer de cólon prognóstico e terapia. No entanto, 25% dos pacientes nó-negativo linfáticos experimentam a recorrência e nem todos os pacientes com nódulos linfáticos positivos têm um prognóstico pobre [30] – [32].

Por outro lado, o tumor primário propagação para o fígado, é a principal causa da progressão da doença em doentes com cancro colorectal, com 15-30% de pacientes com lesões hepáticas apresentando síncronas no momento da cirurgia colorrectal primário, e, que mostra as recorrências após a ressecção hepática metacrônicos agressivo [33] – [35].

Assim, é essencial para identificar novos biomarcadores moleculares que, em conjunto com o sistema de estadiamento TNM, podem melhorar o diagnóstico e classificação de pacientes com câncer de cólon metastático.

o objetivo deste estudo foi identificar uma assinatura para o cancro do cólon microARN metastático que podem discriminar entre os nódulos linfáticos e metástases do fígado.

na literatura, a maior parte das assinaturas cancerosas microARNs relatados foram identificados e validados nas mesmas amostras de tecido. Para aumentar a fiabilidade dos nossos dados, com a excepção de as duas primeiras análises, cada passo de validação foi realizada com um grupo diferente de doentes.

plataformas de microarray e cartões intersectada dados identificou catorze microARNs expressos diferencialmente, dos quais cinco foram validados por qRT-PCR. HSA-miR-21, -31, -93, -103 foram regulados positivamente em tumores primários em relação ao normal, enquanto que hsa-miR-566 foi reprimidos. HSA-miR-93 e -31 foram igualmente regulada positivamente nas metástases do fígado, mas não nos nódulos linfáticos positivos para metástases, enquanto que o miR-HSA-21 sobre-expressão foi evidente em ambos, do fígado e metástases em linfonodos. Com a excepção do conjugado de HSA-miR-31, a hibridação in situ (ISH) de adenocarcinomas do cólon e o tecido adjacente normal correspondente, bem como os seus Tissue microarrays nodais e metástases do fígado, confirmou as assinaturas identificados pelas placas e analisa qRTPCR. HSA-miR-31 foi encontrado desregulada em vários tumores epiteliais primários, onde, de acordo com a localização do tumor, ele parece desencadear diferentes vias de câncer: é regulado para cima em alguns carcinomas [36] – [41], e sub-regulada em outros [42] – [45]. Tal dualidade, tem sido encontrado em tumores invasivos, bem como: em linhas celulares de cancro do cólon, invasão é promovida pela HSA-miR-31 superexpressão [46], [47], enquanto que, em linhas celulares de cancro da mama, os seus baixos níveis de promover uma comportamento mais agressivo [42], que se correlaciona com um pior prognóstico do paciente.

funções orientadas de hsa-miR-31 incluem a angiogênese, onde a sua regulação positiva aumenta de sangue, mas não vasos linfáticos brotando [48], e inflamação aguda [49]. Descobrimos que o miR-HSA-31 é em grande parte regulados positivamente em células inflamatórias peritumorais, em comparação com o cancro e as células normais. Assim, hsa-miR-31 desregulação em tumores agressivos primários é uma evidência indiscutível, mas a interação de suas funções entre o contexto inflamatório, neoangiogênicos e tumoral metastático, necessidades, ainda, a ser elucidado.

HSA-miR -21 é outro microARN multitarefa que tem sido implicado na inflamação [50] – [53], de doença imune [54] – [57], o desenvolvimento [58] – [61], a angiogénese [62], [63], e cancro metástase [18], [64] – [82]. Vários estudos têm, de fato relatado a sua sobre-expressão em diferentes tipos de tumores, incluindo carcinoma colorectal, onde os seus níveis correlacionam-se com evolução clínica, menor sobrevida e resultado terapêutico [83], [84].

De acordo com os nossos estudos anteriores e os de outros, qRT-PCR validado HSA-miR-21 supra-regulação em adenocarcinomas do cólon e metástases, quando comparado ao normal. In situ de dados de hibridização mostraram uma tendência: HSA-miR-21 níveis foram os mais baixos no tecido normal, e cada vez maior no adenocarcinoma e metástase, enquanto isso, uma expressão similar foi observado em câncer nós células e recorrências hepáticas, sugerindo que hsa-miR- 21 regulação positiva poderia prever uma doença metastática avançada.

Tal como acontece com HSA-miR-31, altos níveis de HSA-miR-21 e -93 foram descritas por outros autores em carcinoma hepatocelular [39], [85] , [86] e, por conseguinte, não podem ser considerados como uma assinatura de diagnóstico diferencial entre a metástase do fígado e carcinoma hepatocelular

os dados ISH para HSA-miR-93 sobreposta completamente os resultados qRT-PCR:. uma intensa coloração foi detectado em adenocarcinoma do cólon primários e metástases do fígado. Induzida por sobre-expressão de HSA-miR-93 foi mostrado: ser tumorigénicas in vitro e in vivo, para promover a sobrevivência, mas não a proliferação, e para melhorar a neoangiogénese [87]. Além disso, o aumento da HSA-miR-93 níveis, se correlacionam com a progressão e diminuiu pacientes sobrevivência no carcinoma do ovário seroso [88] e, pode prever o cancro da mama recaída [89].

No entanto, o microRNA validada apenas up-regulada identificados em nossa assinatura que poderiam discriminar entre metástases hepáticas do cólon e carcinoma hepatocelular primário foi hsa-miR-103. A relevância deste miRNA no câncer foi avaliada em tumores pancreáticos, bexiga, esôfago, gástrico e da mama [29], [90] – [93]. Níveis elevados de HSA-miR-103 foram correlacionados com pior sobrevida no câncer de esôfago e estão associadas com doença metastática na mama e câncer gástrico. Particularmente, hsa-miR-103 regulação positiva foi detectada em doentes com cancro gástrico rolamento linfonodos positivos. Da mesma forma, no nosso estudo, qRT-PCR detectou HSA-miR-103 sobre-expressão em tumores primários, bem como nós de metastáticos e fígado. Mais uma vez, ISH deu informações nos mais específico de células de origem: enquanto, não houve diferenças significativas entre tumores primários e linfonodos positivos, metástase hepática apresentaram os maiores níveis de hsa-miR-103 expressão

Na. nosso estudo, embora não seja validado por qRT-PCR, hsa-miR-200c foi um dos microRNA selecionados por plataformas de microarray e cartões. Recentemente, hsa-miR-103/107 foram encontrados níveis inversamente correlacionada com HSA-miR-200c na regulação da epitelial-a-Mesenquimal Transição no cancro da mama [25]. Para testar se pudéssemos estabelecer a mesma correlação no câncer de cólon, foi realizado ISH de cólon TMA com sonda de miR-200c. Não foi observada qualquer correlação inversa entre os dois miRNAs. Ambos foram sobre-expressos, mas, hsa-miR-200c foi fortemente regulado para cima em linfático metástase nodal em comparação com cólon normal, adenocarcinomas e recorrências do fígado. Isto sugere que hsa-miR-103 e miR-HSA-200c não controlam EMT no câncer de cólon, e que os níveis elevados de HSA-miR-200c são necessários para a invasão nodal.

HSA-miR-200c fígado pontuações metástase ISH mostrou alta variabilidade, cobrindo os valores médios de tecido normal, adenocarcinomas, e linfonodos positivos. Regulação negativa de HSA-miR-200 ° C tem sido proposta como uma assinatura distintiva do cancro primário do fígado (carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma intra-hepático e angiossarcoma hepática) de metástases do fígado de origem epitelial [86], [94], enquanto que a sua regulação positiva em adenocarcinoma do cólon tem sido associada a um mau prognóstico [95]. No nosso estudo, HSA-miR-200c regulação positiva na metástase nodal foi confirmada por ISH, mas não foi validado por qRT-PCR. Este achado é principalmente devido a procedimentos experimentais e técnicas. Em primeiro lugar, nós usamos diferentes grupos de pacientes para validação, que, embora fornecendo dados final mais confiável, introduzidas maior variabilidade no procedimento experimental. Em segundo lugar, os ARN provenientes dos nossos primeiros microarrays grupo de pacientes, não foram extraídos a partir de tecidos embebidos em parafina microdissecadas e continham proporções variáveis ​​de cancro e tecido circundante benigno, enquanto que os ARN e os tecidos analisados ​​no qRT-PCR e ISH foram tecido microdissecado núcleos com um grande componente do cancro. No entanto, qRT-PCR não pode diferenciar a partir de células cancerosas benignos e /ou não, ao passo que ISH pode discriminar entre os diferentes tipos de células. Outros autores validado seus dados nos mesmos pacientes, e o ARN foi extraído a partir de todo o tecido. Além disso, com o melhor de nosso conhecimento, na literatura não há nenhum estudo relatando uma escala tão grande de microRNA ISH. Nós demonstramos que ISH pode fornecer informações específicas de células muito útil, sugerindo microRNAs adicionais

in vivo

funções para futuras investigações.

Uma novidade importante da nossa assinatura era hsa-miR-566. Aparentemente sub-regulada apenas em adenocarcinomas no que diz respeito ao controlo e tecidos do cólon metastáticos por qRT-PCR, HSA-miR-566 digoxigenina sonda marcada, foi fracamente detectada em gânglios positivos células cancerosas, e igualmente expressos em cólon normal, bem como adenocarcinomas e metástase hepática, apoiando a noção de que ISH pode nos dar detalhes mais informativa do que microarrays ou qRT-PCR. Infelizmente, na literatura, não há nenhum estudo relatando envolvimento hsa-miR-566 em câncer, ou descrevendo suas funções biológicas, que poderiam ajudar a discussão de nossos dados.