Abstract

Fundo

A cisplatina é uma droga anticâncer potente, mas a sua aplicação clínica tem sido limitada devido às suas características físico-químicas indesejáveis ​​e os efeitos secundários graves. formulações melhores drogas para cisplatina são altamente desejado.

Metodologia /Principais Achados

Aqui, nós desenvolvemos uma formulação de nanopartículas para a cisplatina com alta eficiência de encapsulação e reduzida toxicidade usando reticulado por cisplatina carboximetilcelulose ( nanopartículas CMC) núcleo feito a partir de poli (lactido-co-glicolido) -monomethoxy-poli (polietileno glicol) copolímeros (PLGA-mPEG). As nanopartículas têm um diâmetro médio de cerca de 80 nm medido por microscópio electrónico de transmissão (TEM). A eficiência de encapsulação da cisplatina nas nanopartículas é de até 72%. Por outro lado, também foram observadas uma libertação controlada de cisplatina de uma forma sustentada e a eficácia do tratamento dependente da dose de nanoparticulas carregadas com cisplatina contra células IGROV1-CP. Além disso, a dose letal mediana (LD

50) das nanoparticulas carregadas com cisplatina foi mais do que 100 mg /kg por administração intravenosa, que foi muito mais elevada do que a da cisplatina livre.

Conclusão

Este nanopartículas carregadas com cisplatina desenvolveram uma formulação é promissora para a administração de cisplatina, a qual será um regime terapêutico eficaz do cancro do ovário, sem efeitos colaterais graves e toxicidade cumulativa

citação:. Cheng L, C Jin , Lv W, Ding Q, Han X (2011) Desenvolvimento de um Altamente Estável PLGA-mPEG nanopartículas carregadas com cisplatina, para quimioterapia do cancro do ovário. PLoS ONE 6 (9): e25433. doi: 10.1371 /journal.pone.0025433

editor: Martin W. Brechbiel, National Institutes of Health, dos Estados Unidos da América

Recebido: 28 de abril de 2011; Aceito: 05 de setembro de 2011; Publicação: 26 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Cheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores reconhecer o apoio da Fundação Internacional da China Ciência e Tecnologia de Cooperação (2007DFC30306, https://www.cistc.gov.cn/), ea Fundação Projeto de Tecnologia Província de Zhejiang (2009C11122, https://www.zjkjt.gov.cn/html /index.htm). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

esquemas terapêuticos baseados em cisplatina foram estabelecidas como a quimioterapia padrão de primeira linha para pacientes com câncer de ovário desde meados da década de 1980 [1] – [3]. No entanto, a sua aplicação tem sido limitada devido a efeitos colaterais graves e toxicidade cumulativa nos principais órgãos, como fígado, rim, coração e sistema nervoso pela administração intravenosa [4] – [7]. Nos últimos anos, numerosos veículos de fármacos de tamanho nano têm sido desenvolvidos para minimizar os efeitos secundários da cisplatina e melhorar a sua eficácia anti-tumor através das formas de micelas tais como poli (ácido aspártico) -poli (etileno-glicol) micelas, lipossomas, tais como lipossomas peguilados e nanopartículas de lípidos sólidas durante a terapia do cancro [8] – [13]. conjugados de fármaco-polímero solúvel também foram desenvolvidos para aumentar a solubilidade da cisplatina. Tais conjugados incluem complexos de cisplatina com policarboxilatos, poli (amidoaminas), dendrímeros de poliamidoamina e cadeias poliacrílicos. Estes sistemas podem reduzir a toxicidade e eficácia alcançar ideal de quimioterapia [14] – [16].

O poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) micropartículas também têm sido utilizados para aprisionamento cisplatina, devido à sua e biocompatível propriedades biodegradáveis ​​[17], [18]. Avgoustakis K et al. demonstraram que a administração intravenosa de nanopartículas de PLGA-PEG carregados com cisplatina resulta num prolongamento significativo da cisplatina presença no sangue de ratos [19]. No entanto, a eficiência de encapsulação de cisplatina continua a ser insuficiente durante a preparação de nanopartículas de PLGA-PEG carregados com cisplatina. Gryparis CE et al. [20] descobriram que a aplicação de nanopartículas tem a possibilidade de manter as concentrações adequadas ou mais de cisplatina para 2 semanas, mas relativamente baixo teor de PEG de PLGA-MPEG pode induzir o aumento do tamanho das nanopartículas. Além disso, é desejável para obter uma libertação sustentável e concentração suficiente de cisplatina em contextos clínicos porque a administração de dose baixa contínua de cisplatina é mais eficiente na indução da apoptose do que uma exposição simples de alta dose de cisplatina [21], [22].

o principal objetivo do presente trabalho é desenvolver uma nanopartícula inovadora, com uma alta eficiência de encapsulamento e liberação sustentável da cisplatina. Neste sistema de fornecimento de nanopartículas, d-alfa-tocoferil polietilenoglicol 1000 (TPGS), como um novo agente emulsionante eficiente benéfico para a saúde humana e tem sido utilizado o copolimero biodegradável nanopartículas de PLGA-mPEG com núcleos de CMC foram desenvolvidos. Por outro lado, foram também determinados a carga e a eficiência de encapsulação de cisplatina. Além disso, foi avaliada a eficácia antitumoral de nanopartículas carregadas com cisplatina no rato modelo de cancro do ovário. Em conclusão, o sistema de entrega de cisplatina melhorado fornece um projeto racional para potencial aplicação terapêutica da cisplatina no câncer de ovário.

Resultados

O projeto racional de CMC e TPGS para preparar nanopartículas PLGA-MPEG com cisplatina

é um desafio para preparar nanopartículas carregadas com cisplatina usando copolímeros PLGA-mPEG devido às suas propriedades físico-químicas e condições de preparação. Neste estudo, foi conduzido um desenho racional de nanopartículas contendo cisplatina mediante a adaptação das composições, tamanho e forma. Em primeiro lugar, copolímeros PLGA-PEG foram sintetizados a partir de lactido e glicolido, na presença de mPEG

5000, cujo grupo hidroxilo pode iniciar a polimerização de lactido e glicolido de abertura de anel. A estrutura do copolímero sintetizado foi detectada pelo

1H RMN em CDCl

3, como mostrado na Figura 1. Os picos a 1,65 e 5,10 ppm pertencia aos protões do metino (CH) e metilo (-CH

3) grupos de segmentos de PLGA, ao passo que os picos de protões meteno (-CH

2-) nos segmentos de PEG localizados em 3,65 ppm, e os picos dos protões meteno (-COCH

2 O-) situada no 4,78 ppm foram a representação dos segmentos conjugados de mPEG PLGA e de modo que não há outros picos foram detectados. O único pico no espectro de GPC (Figura 2) revelou a síntese bem sucedida de copolímeros de PALG-PEG com elevado grau de pureza. O índice de polidispersibilidade (PI) como uma medida da largura da distribuição de pesos moleculares foi de 1,78. Com base na cromatografia de permeação em gel (GPC) e a proporção de

áreas 1H pico entre 5,10 e 3,65 ppm, o peso molecular médio dos copolímeros sintetizados foi calculada como sendo 37062, como se mostra na Figura 2. A percentagem em peso de mPEG foi de 13,5%.

os picos em 1,65 e 5,10 ppm pertencia aos prótons de metino (CH) e metil (-CH

3) grupos de segmentos de PLGA, os picos de prótons meteno (CH

2) nos segmentos de PEG localizados em 3,65 ppm, e os picos de prótons meteno (-COCH

2 O-) localizados em 4,78 ppm representada segmentos conjugados de PLGA e mPEG.

o pico representado o peso molecular médio dos copolímeros sintetizados foi calculada como sendo de 37062.

por outro lado, um método de evaporação de solvente modificado baseado em orgânico-água-água (fase W /o /W), emulsões múltiplas incluindo um processo de preparação relativamente simples foi utilizado para melhorar a eficiência de encapsulação de cisplatina em nanopartículas. As características observadas de nanopartículas podem variar largamente em função da concentração de CMC, TPGS concentração e os processos de variáveis, incluindo o interruptor de fim de adição de solvente. A fim de se atingir a concentração óptima para CMC alta eficiência de encapsulação, de adição de quantidades diferentes de CMC na fase aquosa interna do sistema de emulsão dupla foram exploradas. O encapsulamento eficaz de cisplatina em nanopartículas foi maior do que nenhuma quantidade de CMC, que revelou a taxa de carga e eficiência de encapsulação de cisplatina foram 3,88 e 70,9% (w /w), respectivamente, como se mostra na Tabela 1. Totalmente 1,7 mg combinada com CMC 4 mg de cisplatina foram seleccionados como a fase aquosa interna óptima e a concentração óptima para TPGS foi peneirado para ser 0,035% (w /v).

como se mostra na Tabela 2, o tamanho médio de nanopartículas preparadas carregados com cisplatina variou 180-210 nm, e a taxa de carregamento de cisplatina foi de 3,5-4,2% (w /w). O PI foi determinada como sendo cerca de 0,3, que exibiu uma distribuição homogénea de diâmetro. CMC e polímeros de PLGA-PEG-conferido um ζ potencial negativo com um valor médio de -10,1 e -9,5 mV em nanopartículas em branco e nanoparticulas carregadas com cisplatina, respectivamente. Não se observou qualquer diferença significativa no tamanho e ζ-potencial das nanopartículas com ou sem cisplatina. Figura 3 mostraram as imagens representativas da estrutura externa de nanopartículas examinados por TEM. A maioria das nanopartículas foram forma esférica com diâmetros menores do que os diâmetros determinado por dispersão de luz dinâmica. A morfologia das nanopartículas com ou sem cisplatina revelou estruturas indistinguíveis ou similares

(A) nanopartículas em branco.; (B) nanoparticulas carregadas com cisplatina. As amostras foram coradas com ácido fosfotúngstico a 1% (50.000 ×).

Finalmente, o perfil de libertação cumulativa de cisplatina a partir de nanopartículas foi medida por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), como mostrado na figura 4. Este método de ensaio foi suficientemente sensível para medir a cisplatina em uma vasta gama de concentrações, com um limite de detecção de 0,31 ng /mL. A curva de calibração foi estabelecida em cada experimento. As cinéticas de libertação de cisplatina a partir de nanopartículas revelou uma taxa constante de libertação controlada como a função de tempo. No entanto, a sua versão estável pode ser afetada por conjugação CMC-cisplatina e copolímeros PLGA-MPEG biodegradáveis. Do mesmo modo, como mostrado na Figura 4, a armadilha de cisplatina em nanopartículas pode retardar significativamente a taxa de libertação de cisplatina e, por conseguinte, levar a uma libertação razoavelmente constante ao longo do tempo.

Cisplatina libertado a partir das nanopartículas, em função do tempo de incubação em solução de cloreto de sódio /L 100 mmol, a 37 ° C.

toxicidade aguda de nanopartículas núcleo CMC

de modo a avaliar a citotoxicidade das nanopartículas sem carregamento de drogas, a citotoxicidade de nanopartículas nas doses de 0,005, 0,02, 0,04 e 0,08 mg /mL foram testadas utilizando microplacas de 96 poços com células semeadas a uma densidade de 3000 células /poço. As curvas de crescimento das células de controle e grupos tratados com nanopartículas foram semelhantes, sugerindo que as nanopartículas e as concentrações testadas não exibem toxicidade óbvia em células, como mostrado na Figura 5 (a). Além disso, a quantidade máxima de nanopartículas (0,08 mg /mL) e a densidade de 3000 células /poço foram também as condições óptimas para avaliar o efeito de nanoparticulas carregadas com cisplatina sobre o crescimento de células

In vitro

.

(a) a viabilidade celular relativa de células CP-IGROV1 expostos a nanopartículas em branco durante 72 horas com diversas doses. inibição do crescimento (B) celular após exposição a cisplatina livre (histograma cinzento) e nanoparticulas carregadas com cisplatina (histograma preto) durante 72 horas. Os dados representados como média ± SD.

A atividade anticancerígena da cisplatina livre e nanoparticulas carregadas com cisplatina em células IGROV1-CP

in vitro

foi determinada. Como mostrado na Figura 5 (B), não foi observada nenhuma diferença significativa na citotoxicidade entre nanoparticulas carregadas com cisplatina livre e a cisplatina nas concentrações testadas (

P

0,05). A citotoxicidade de ambos a cisplatina livre e nanoparticulas carregadas com cisplatina foi dependente da dose. Portanto, as nanopartículas de PLGA-PEG pode contribuir para a velocidade de libertação controlada de cisplatina, embora preservando a eficácia anticancerígena de cisplatina.

De modo a avaliar os potenciais riscos de toxicidade, os ratinhos ICR foram injectados intravenosamente com nanoparticulas carregadas com cisplatina a várias doses ea mudança na taxa de sobrevivência dos ratos foi examinada. Em todas as doses testadas, as taxas de mortalidade entre os grupos revelou uma diferença significativa durante um período de espera de 2 semanas (

p Art 0,05). A mortalidade de nanoparticulas carregadas com cisplatina, na dose de 100 mg /kg (com base em cisplatina) foi de 40,0%, mas a taxa de morte no grupo de 10 mg kg /tratamento com cisplatina atingiu até 62,5%. Não foi observada deterioração da saúde em ratinhos tratados com nanopartículas em branco durante o período de observação, e o comportamento geral dos ratinhos tratados com nanoparticulas carregadas com cisplatina ou nanopartículas em branco não exibiram uma diferença óbvia. O LD

50 foi de 8,6 mg /kg para a cisplatina livre e 103,4 mg /kg para nanoparticulas carregadas com cisplatina, como se mostra na Tabela 3. Por conseguinte, em comparação com a cisplatina livre, as nanoparticulas carregadas com cisplatina pode proporcionar mais segurança na aplicação clínica .

perfil de segurança de nanopartículas núcleo CMC em IGROV1-CP ratos nus xenoenxertados

a fim de observar a toxicidade de órgão atrasados ​​na ratos dentro de um determinado período de tratamento, os principais órgãos, incluindo coração , fígado, pulmão, rim e baço de ratinhos nus BALB /c administrado com cisplatina livre e nanoparticulas carregadas com cisplatina foram seccionados e corados com HE. Nenhuma mudança foi observada histopatológico óbvio no coração, pulmão e baço de nanoparticulas carregadas com cisplatina ratinhos tratados, como mostrado na Figura 6. No entanto, observaram-se necrose hepática e atrofia patológica de rim em ratos tratados com cisplatina livre. Do mesmo modo, a administração de nanoparticulas carregadas com cisplatina até 3 mg /kg por 5 doses consecutivas não causar uma diferença patológica significativa no fígado e no rim.

ratinhos atímicos nus portadores de xenotransplantes de IGROV1-CP foram tratados com solução salina ( controle), as nanopartículas em branco (PN em branco), cisplatina e cisplatina carregada nanopartículas (NPs-CP) nos cinco doses a cada 4 dias. Os órgãos, incluindo o coração, pulmão, baço, fígado e rim de ratos tratados com solução salina foram mostrado na primeira linha. Os órgãos dos ratinhos tratados com nanopartículas em branco foram mostrado na segunda linha. Os órgãos dos ratinhos tratados com cisplatina livre foram mostradas na terceira linha. Os órgãos dos ratinhos tratados com nanoparticulas carregadas com cisplatina foram mostrados na quarta linha.

De modo a avaliar o efeito de nanoparticulas carregadas com cisplatina na apoptose, secções de tecido de tumor foram coradas com TÚNEL para avaliar fragmentação do ADN. Enumeração de núcleos apoptóticos (cerca de 200 células foram contadas) foi feita em lâminas pegou aleatoriamente por dois experimentadores independentes. Um conjunto de corpos apoptóticos foram dados como uma única contagem, e as contagens de apoptose em diferentes grupos de tratamento foram mostradas na Figura 7 (A). Os xenoenxertos tratados com nanoparticulas carregadas com cisplatina revelou níveis apoptóticos mais elevados do que os controlos (solução salina e em branco nanopartículas,

P

0,05). Embora as contagens totais de células apoptóticas em tumores tratados com nanoparticulas carregadas com cisplatina eram ligeiramente mais elevados do que os tumores tratados com cisplatina convencional, não foi observada nenhuma diferença significativa na contagem total de células apoptóticas em ambos os grupos de tratamento, como mostrado na Figura 7 (B) (

p Art 0,05)

(A) A avaliação microscópica da apoptose do tumor por coloração TUNEL.. ratinhos atímicos portadores de xenoenxertos IGROV1-CP foram tratados com solução salina (controle), as nanopartículas em branco (PN em branco), cisplatina e cisplatina carregada nanopartículas (NPs-CP) nos cinco doses. (B) A contagem de células apoptóticas médios foram calculados com base na coloração TUNEL. ratinhos atímicos portadores de xenoenxertos IGROV1-CP foram tratados como descrito em (A).

Tratamento eficácia

in vivo

estudos

A eficácia do tratamento de nanopartículas carregadas com cisplatina para xenotransplante celular IGROV1-CP em BALB /c foi avaliado ratinhos nus. Depois de o volume médio dos tumores foi de até 100-130 mm

3, os ratinhos portadores de tumor foram divididos em quatro grupos (N = 8) com diferença mínima no peso e tamanho dos tumores entre grupos. Além disso, os ratinhos foram tratados com solução salina incluindo esquemas seguintes, as nanopartículas sem cisplatina, cisplatina livre, e nanoparticulas carregadas com cisplatina a cada quatro dias. A dose de tratamentos baseados em cisplatina foi de 3 mg /kg de peso corporal.

O tamanho do tumor, peso corporal e sobrevida dos ratos foram então monitorizados durante 21 dias após o início do tratamento. O volume de tumor médio no final do período de tratamento foi de 209 ± 25 mm

3 no grupo tratado com solução salina, e 213 ± 19 mm

3 no grupo tratado com nanopartículas em branco, como mostrado na Figura 8 (a) . No entanto, no grupo tratado com cisplatina, o volume tumoral médio final foi de 166 ± 16 milímetros

3, que foi significativamente menor do que nos grupos tratados com solução salina por análise de variância, com intervalo de confiança de 95%. Em comparação com o grupo tratado com cisplatina, uma ligeira redução do volume do tumor em nanoparticulas carregadas com cisplatina grupo tratado com o tamanho de tumor médio de 146 ± 19 milímetros

3 no final do período de tratamento. Uma possível razão era que a entrega intracelular subsequente de cisplatina pode ser dificultada pela modificação de mPEG de nanopartículas, que não exibem uma contribuição significativa para a redução do tumor. No final do período de tratamento (dia 21), as taxas de sobrevivência dos ratinhos no grupo de nanopartículas Tratada-carregadas com cisplatina, grupo tratado com cisplatina, grupo tratado com nanopartículas em branco e o grupo tratado com solução salina foram 87,5, 62,5, 75 e 75 %, respectivamente, como mostrado na Figura 8 (B). A diferença nas taxas de sobrevivência de quatro grupos sugeriram que as nanopartículas carregadas com cisplatina eram muito mais seguro do que a cisplatina livre. Os pesos corporais dos ratinhos exibiu uma diminuição gradual a partir da segunda dose, embora não se observou nenhuma diferença significativa em quatro grupos, como mostrado na Figura 8 (C).

(A) Efeito da cisplatina livre (3 mg /kg) e nanoparticulas carregadas com cisplatina (NPS-cp, 3 mg /kg na base de cisplatina) sobre o crescimento de tumores em ratinhos atímicos portadores de xenoenxertos de células com IGROV1-CP. Os ratinhos foram administrados com formulações preparadas em intervalos de 4 dias no período de tratamento total de 21 dias. solução salina foi usada como grupo controle, eo efeito de nanopartículas em branco (PN em branco) também foi confirmada. Os dados foram apresentados como a média ± DP (n = 8 no início da experiência). (B) A taxa de sobrevivência de ratinhos atímicos portadores de tumor tratados com cisplatina (3 mg /kg), o NPS-CP (3 mg /kg na base de cisplatina), o NPS em branco e solução salina (controlo). alteração de peso (C) do corpo, como o tempo de tratamento de ratinhos portadores de tumor IGROV1-CP. Bares indicados os desvios-padrão.

Discussão

características físico-químicas de cisplatina, como a baixa solubilidade em água (1 mg /mL), alta afinidade de ligação às proteínas plasmáticas e degradabilidade, podem limitar a eficácia terapêutica da cisplatina. obstáculos à base de cisplatina sobre a sua aplicação clínica pode ser resolvido mediante a utilização de nanopartículas poliméricas biodisponíveis. Actualmente, alguns tipos de nanopartículas preparadas a partir de poli (lactido) -monomethoxy-poli (etilenoglicol) copolímeros (PLA-PEG) e PLGA-PEG têm sido cada vez mais a atenção. A lógica deste estudo é o de aumentar a carga e a eficiência de encapsulação de cisplatina por nanopartículas, melhorando assim a estabilidade da cisplatina. TPGS pode também proporcionar uma alternativa segura de álcool polivinílico (PVA) ou outros aditivos para melhorar a preparação de nanopartículas uniforme de lote para lote.

Usando modificado W O /W método de emulsão /dupla desenvolvido por Gryparis CE et ai . [20], temos desenvolvido um novo conceito de “core-CMC-cisplatina-reticulação” que pode aumentar grandemente a eficiência de carga de cisplatina. Durante a reticulação de CMC, de iões cloreto em cisplatina pode trocar iões de hidrogénio com CMC em água para formar um complexo. Devido à retenção do complexo na fase de emulsão primária, a cisplatina pode ser carregado para as nanopartículas de PLGA feitas hidrofóbico com cadeias de polietilenoglicol metoxi hidrofílico. A eficiência de carga de cisplatina melhorou para 3,9 ± 0,3% (w /w), e a eficiência de encapsulação é de até 70,9 ± 2,6%. Além disso, não há relatos relacionados com a aplicação de polímeros CMC como uma estratégia para melhorar a eficiência de carga de cisplatina. Portanto, nanoparticulas carregadas com cisplatina devem ser os portadores de entrega de medicamentos eficazes para a cisplatina

in vivo

estudo.

A alta eficiência de encapsulação de cisplatina é também, em parte devido à aplicação de TPGS emulsionante em coordination- formação de nanopartículas induzida. TPGS é diferente do PVA previamente relatado, o colato de sódio ou outros emulsionantes [17], [20]. TPGS, um derivado solúvel em água de vitamina E natural, é normalmente utilizado em formulações farmacêuticas e nutracêuticos. Neste estudo, temos gerado com sucesso nanopartículas homogêneas com o auxílio de TPGS. Nenhuma detritos e agregação nas nanopartículas homogéneas foram observadas por TEM. monodispersas gotículas de emulsão favorece a coalescência sem TPGS, e as nanopartículas são difíceis de formar. Aqui, TPGS é usado com uma esperança para deslocar emulsionantes acima mencionadas e evitar a sua dificuldade de remoção.

Durante a avaliação da viabilidade das células e a eficácia do tratamento de nanoparticulas carregadas com cisplatina preparados, a viabilidade das células IGROV1 CP-incubadas com cisplatina livre na gama de concentrações de 8-24 uM durante três dias apresentaram uma diminuição de 79,6% para 14,8%, enquanto que a viabilidade das células tratadas com cisplatina encapsulada em nanopartículas revelou uma redução de 76,9% para 10,8%. Além disso, as nanoparticulas carregadas com cisplatina inibiu eficazmente o crescimento do tumor em ratos sem pêlo quando comparado com a cisplatina livre na mesma dose, o que sugere que as nanopartículas não interrompeu a eficácia anticancerígena de cisplatina

In vivo

. ensaio TUNEL também confirmou a eficácia melhorada de nanoparticulas carregadas com cisplatina sobre a inibição de tumor. Enquanto isso, o exame histopatológico revelou necrose hepática e atrofia no rim no grupo tratado com cisplatina livre, mas estes tipos de alterações histopatológicas não foram observados nos grupos tratados com nanoparticulas carregadas com cisplatina. Além disso, outros órgãos importantes, tais como o coração, baço e pulmão não revelou anormalidades ou. Assim, as nanopartículas de núcleo-CMC-cisplatina reticulados deve ser muito mais seguro e mais elevada do que a cisplatina livre eficácia durante o tratamento do cancro.

De modo a melhor compreender os efeitos colaterais de nanoparticulas carregadas com cisplatina, a toxicidade aguda potencial de cisplatina nanopartículas -loaded também foi avaliada. murganhos ICR foram injectados por via intravenosa com 0,8 mL de nanoparticulas carregadas com cisplatina na concentração de cisplatina de 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0 mg /ml, respectivamente, e a taxa de sobrevivência dos ratinhos foi examinado. Como esperado, o LD

50 de nanoparticulas carregadas com cisplatina revelou 12 vezes maior do que a da cisplatina livre. Comparando a taxa de sobrevida global, camundongos BALB /c mostraram mais tolerância para nanoparticulas carregadas com cisplatina do que a cisplatina livre, o que indica que as nanopartículas carregadas com cisplatina teve mais segurança do que a cisplatina livre na condição de dose relativamente alta administração.

em geral, as nanopartículas carregadas com cisplatina foram concebidos e preparados com sucesso. As partículas esféricas e estreita distribuição de tamanhos foram caracterizados. de libertação prolongada de cisplatina ao longo de cinco dias a partir de nanopartículas PLGA-MPEG

in vitro

foi observada. Portanto, podemos concluir que as nanopartículas têm uma contribuição significativa para a liberação controlada de cisplatina e não danificar a eficácia do tratamento de cisplatina. Nossos resultados fornecem uma avaliação mais aprofundada das nanopartículas carregadas com cisplatina, como terapia do cancro romance. No entanto, a fim de maximizar o efeito antitumoral de nanoparticulas carregadas com cisplatina, que é necessário para optimizar ainda mais a dose de administração e do regime de injecção.

estratégias actuais, em especial para a realização dessas nanopartículas, a preparação de vários passos envolvidos. Como resultado, o processo é um sistema inerentemente ineficiente, o que pode não ser facilmente escaláveis ​​e podem resultar em variações de lote para lote. No nosso laboratório, temos desenvolvido um novo método para a preparação de nanopartículas com a uniformidade de lote para lote. É um sistema simples, escalonável, eficiente e controlável utilizando nossa estratégia de formulação bem concebida. Nossa prova-de-conceito

in vitro

e

in vivo

avaliação mostra que a formulação de nanopartículas de PLGA-MPEG é um sistema de entrega de cisplatina potencial para o tratamento de cancro do ovário.

Materiais e métodos

Materiais

A cisplatina foi comprado de Shandong boyuan Chemical Co. Ltd. (Jinan, China). CMC foi comprado de Aladdin Reagente Co. Ltd. (Xangai, China). mPEG (H

W 5 kDa) e TPGS foram obtidos a partir de Jiangsu Xixin vitamina Co. Ltd. A coluna de fase inversa (ZORBAX-NH

2, 250 x 4,6 mm, 5 um) foi adquirido a partir da Agilent Technologies Co . Ltd. (EUA). Toda a água do reagente usado no laboratório foi pré-tratada com o sistema Milli-Q Além disso (Millipore Corporation, EUA). Todas as amostras foram mPEG desidratada por destilação azeotrópica com tolueno, e, em seguida, seco sob vácuo a 50 ° C durante 12 h antes da utilização. células IGROV1-CP foram gentilmente cedidas pelo Dr. Stephen Collins na UCSD (CA, EUA).

Animais

Todos os experimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética animal Institucional (IACE) do Centro de Pesquisa do Laboratório de Zootecnia da Zhejiang Chinese University Medical (Hangzhou, China). Os números de licenciamento são Syxk (zhe) 2008-0115. murganhos ICR e ratos BALB /c (4-6 semanas de idade e pesando 18-22 g) foram mantidos no centro do animal. nanoparticulas carregadas com cisplatina foram administradas com injecção intravenosa. No final de períodos de tratamento, tecidos do fígado, rim, coração, baço e pulmão foram coletadas de acordo com a aprovação do AICE.

Síntese e caracterização de PLGA-mPEG copolímero

PLGA-mPEG copolímeros foram preparados por um processo de polimerização de massa fundida sob vácuo usando estanoso-2-etil-hexanoato como catalisador [23]. O PLGA (30) -mPEG (5) foi sintetizado com composição LA:GA:EO = 03:01:01, Mw (peso molecular médio em peso) = 3,7 × 10

4, PI = 1,8 (Los Angeles, GA e eO repousar durante ácido láctico, ácido glicólico e os componentes de óxido de etileno, respectivamente). O copolímero foi caracterizado com

.

Preparação e caracterização de nanopartículas carregadas com cisplatina

PLGA-mPEG nanopartículas carregadas com cisplatina foram preparadas com W /O /W emulsão 1H-RMN e GPC método de evaporação de solvente desenvolvido por Gryparis CE [20], com modificações específicas. Resumidamente, 5,71 mg /mL de cisplatina dissolvida em solução aquosa 30 mM de CMC foi emulsionada em uma fase orgânica, utilizando ultra-sons (bioruptor, modelo UCD-200-TM EX), a 100 W durante 45 segundos. A fase orgânica foi composta principalmente de clorofórmio e acetona contendo 50 mg de PLGA-MPEG. Água-em-fase orgânica da emulsão foi adicionada a uma solução aquosa de TPGS (0,035%, w /v).

O resultante W /O /W emulsão foi então microfludized com uma pressão mínima de 12.000 PSI, e agitada por um agitador magnético durante 3 h à temperatura ambiente até completa evaporação do clorofórmio e acetona. Finalmente, a suspensão de nanopartículas foi liofilizada e armazenada a 4 ° C até uso futuro. A fim de aumentar a retenção de cisplatina em nanopartículas, de CMC na fase aquosa interna W /O /W foi conjugado a cisplatina, em 1 mL de água durante 3 horas com agitação suave contínua. nanopartículas em branco também foram preparadas com o mesmo método, sem cisplatina.

O tamanho das partículas e potencial zeta foram medidos usando instrumento Malvern Zetasizer (13 corridas por exemplo, NETASIZER NANO S90). O exame morfológico das nanopartículas foi observado sob MET (JEM-1230, JEOL, Japão). Uma gota de suspensão de nanopartículas foi colocada numa grelha de cobre coberto com membrana de nitrocelulose e secou-se ao ar livre antes de coloração negativa com uma solução de sódio fosfotúngstico (1% w /v).

Determinação da eficiência de carga e

in vitro da velocidade de libertação de cisplatina

A eficiência de carga de cisplatina em nanopartículas foi determinada usando um procedimento directo [24]. Totalmente 5 mg de nanopartículas liofilizado foi dissolvido em 1 ml de NaOH (0,1 N) durante a noite e agitada com um agitador magnético, à temperatura ambiente. A suspensão foi centrifugada a 18000 g durante 10 min, e 90 ul de sobrenadante foi utilizado para quantificar o conteúdo de cisplatina por HPLC. A eficiência de encapsulação foi calculada como a quantidade de cisplatina recuperado a partir de nanopartículas em relação à quantidade inicial de cisplatina utilizada para cada preparação. Além disso, a fim de quantificar a cinética de libertação de cisplatina a partir de nanopartículas, nanoparticulas carregadas com cisplatina (5 mg) foram suspensos em 10 mL de fosfato salino tamponado (PBS). A suspensão foi colocada num tubo de microcentrífuga e, em seguida, colocar num banho de água agitação orbital a 120 rpm a 37 ° C. Os tubos foram centrifugados a intervalos de tempo designados. Após centrifugação, os sobrenadantes foram recolhidos para a determinação da cisplatina. Depois de provar as nossas sobrenadantes, o meio de incubação foi substituída por PBS fresco e os tubos foram colocados de volta na incubadora. O teor de cisplatina destas soluções foi determinada através da medição da absorvância a 310 nm, com uma fase móvel não gradiente que consiste em 0,9% de NaCl e metanol (v /v, 25/75), a uma taxa de fluxo constante de 1,0 mL /min.

In vitro

citotoxicidade estudo

o ensaio de MTT foi utilizado para avaliar a toxicidade das nanopartículas em branco, nanoparticulas carregadas com cisplatina e cisplatina livre contra células cancerígenas de ovário IGROV1-CP [25 ]. As células foram semeadas em placas de 96 poços de plástico de 3 × 10

3 células por poço. Vinte e quatro horas após o plaqueamento, cisplatina, nanopartículas em branco e nanoparticulas carregadas com cisplatina (ambos suspensos em meio de cultura) em várias concentrações foram adicionados aos poços. Um total de 50 ul de solução de MTT (5 mg /ml em PBS, pH 7,4) foi adicionado a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 3 horas. A solução foi retirada, e, em seguida, 200 mL de isopropanol acidificado (0,33 mL de HCl em 100 ml de isopropanol) foi adicionado e agitou-se cuidadosamente para dissolver os cristais de formazano. A solução foi imediatamente lida num leitor de microplacas (TECAN INFINIT M200, EUA) a um comprimento de onda de 490 nm. As experiências foram realizadas três vezes, independentemente. A citotoxicidade foi expressa como percentagem de inibição da viabilidade celular.

Avaliação in vivo da toxicidade aguda

murganhos ICR foram usadas para avaliar a toxicidade relativa após a administração intravenosa de nanoparticulas carregadas com cisplatina .