Abstract

meprina-α é uma metaloprotease sobre-expressos em células cancerosas, levando ao acúmulo desse protease em um subconjunto de tumores colo-rectais. O impacto do aumento dos níveis de meprina-a sobre a progressão do tumor não é conhecido. Nós investigamos o efeito desta protease sobre a migração celular e angiogênese

in vitro

e estudou a expressão de meprina α-mRNA, proteínas e atividade proteolítica em tumores primários em estágios progressivos e em metástases hepáticas de pacientes com câncer colorretal, bem como a actividade inibidora para com meprina-α no soro de doente de cancro, em comparação com controlos saudáveis. Descobrimos que o fator de crescimento de hepatócitos (HGF) – induziu uma resposta migratória das células epiteliais transfectadas-meprina foi aumentado em comparação com células do tipo selvagem na presença de plasminogênio, e que a resposta angiogênico em explantes de aorta de ratos de órgãos-cultura foi reforçada no presença de meprina exógena-α humano. Em pacientes, meprina α-ARNm foi expressa em adenomas do cólon, tumores primários UICC (International Union Against Câncer) fase I, II, III e IV, bem como nas metástases do fígado. Em contraste, a proteína correspondente acumulada apenas em tumores primários e metástases do fígado, mas não nos adenomas. No entanto, as metástases do fígado faltava actividade meprina-α apesar do aumento da expressão da proteína correspondente, o que se correlacionou com a activação do zimogénio ineficiente. Soros de pacientes com câncer apresentou diminuição da inibição meprina-α em comparação com controles saudáveis. Em conclusão, a atividade meprina-α é regulado de forma diferente em tumores primários e metástases, levando a alta actividade proteolítica em tumores primários e baixa atividade em metástases hepáticas. Em virtude da sua pró-migratória e atividade pró-angiogênico, meprina-α pode promover a progressão do tumor no câncer colorretal

Citation:. Lottaz D, Maurer CA, Noël A, Blacher S, Huguenin M, Nievergelt A, et ai. (2011) aumento da atividade de meprina-α, a Pro-Migratórias e Pro-angiogénicos Protease, no cancro colorectal. PLoS ONE 6 (11): e26450. doi: 10.1371 /journal.pone.0026450

editor: Pendure Thi Thu Nguyen, da Universidade Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de setembro de 2010; Aceito: 27 de setembro de 2011; Publicação: 11 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Lottaz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Fundação Nacional da Suíça (www.snf.ch, conceda # 3100A0-100772 a EES), o cancro da Liga Bernese (www.bernischekrebsliga.ch, conceder aos DL) ea Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de, DFG BE 4086 /1-1 a CB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

eventos proteolíticos extracelulares concertadas podem promover a progressão do tumor por perturbar barreiras físicas, tais como a membrana basal e pelo processamento de matriz extracelulares, factores de crescimento e citoquinas no estroma do tumor. As proteases afectar a adesão celular e o crescimento celular, bem como migração de células individual e colectiva [1], [2]. Os efeitos profundos de proteases são controladas pela regulação da actividade de protease em múltiplos níveis, incluindo os níveis de expressão, activação de formas de zimogênio, inibidor níveis, e inativação.

Nós previamente identificados meprina-α, uma protease metzincin do astacina família [3], como um novo componente da rede de protease em cancro colo-rectal [4]. Existem duas isoformas homólogas de meprina: meprina-α, codificados por

MEP1A

no cromossoma 6, e meprina-β, codificados por

MEP1B

no cromossoma 18 [5]. Meprina-α e meprina-β são co-expressas no intestino delgado, enquanto que apenas meprina-α é expresso no cólon [6]. Meprina-β se acumula na superfície da célula apical nos enterócitos do intestino delgado, enquanto que meprina-α é segregada, a menos que seja retido na superfície da célula através da associação não-covalente com meprina-β [6]. As cadeias polipeptídicas simples não são estáveis, ambas as isoformas formar complexos de proteína de dímeros meprina-β, meprina-ct e tetrâmeros meprina-p, ou de complexos multiméricos de até dez subunidades meprina-α [7], [8]. Meprina-α é expressa nas células epiteliais da mucosa do cólon saudáveis, bem como no cancro colo-rectal [6]. No entanto, em contraste com as células epiteliais intestinais normais, os quais libertam a protease para o lúmen intestinal, as células cancerígenas segregam a protease de uma forma não-polarizada, que conduz à sua acumulação e activação do estroma tumoral [4]. cliva meprina-a uma gama de substratos diferentes

in vitro

[9], incluindo componentes de matriz extracelular de membranas basais [9], [10], mas alguns substratos foram descritos

in vivo

[ ,,,0],11], [12], [13], [14], [15]. Três inibidores endógenos meprina são descritos, lectina de ligação a manana (MBL) [16], de fetuína-A e a cistatina C [17].

meprina-α é secretada a partir de células epiteliais como um zimogénio [18].

In vitro

, o pró-péptido pode ser removido utilizando tripsina, produzindo o enzima activo. Tripsina, portanto, pode ativar meprina-α na luz intestinal

in vivo

. Um sistema de activação alternativo foi identificada em co-culturas de linha celular de carcinoma do cólon de Caco-2 e fibroblastos intestinais. derivada de fibroblastos de tipo uroquinase activador de plasminogénio (uPA) converte plasminogénio em plasmina, que por sua vez gera meprina-α activa [19]. Na pele da peptidase relacionadas com a calicreína 5 poderia ser identificado como um promeprin-α enzima conversora [20].

Aqui nós fornecemos evidências de uma atividade pró-angiogénicos e pró-migratória de meprina-α e investigar a expressão , ativação e inibição desta protease em tumores primários, metástases hepáticas e corrente sanguínea em pacientes com câncer colorretal. Nossos resultados mostram um padrão complexo de regulamento, que está de acordo com a protease sendo implicada na disseminação de células cancerosas de sítios primários.

Resultados

meprina-α promove a migração celular e angiogênese

in vitro

o efeito de meprina-α sobre a migração de células foi investigada por meio da resposta de dispersão bem caracterizada de células de Madin-Darby de rim canino (MDCK) em resposta ao factor de crescimento de hepatócitos (HGF ) [21]. A resposta de células transfectadas com meprina e células MDCK parentais foi registado utilizando lapso de tempo videomicroscopia e quantificados como descrito anteriormente (Fig. 1A) [22]. Comparamos a migração de células MDCK parentais com células MDCK transfectadas com meprina-α sozinho, meprina-β sozinho, ou co-transfectadas com ambos meprina-α e meprina-β. células MDCK parentais e transf-meprina não tratados não migram e crescer como grupo de células que, eventualmente, formar uma monocamada de células. Uma resposta pró-migratório foi induzida através da adição de HGF. As células transfectadas com meprina e MDCK controle migrado de modo semelhante na presença do HGF sozinho. Apenas após a adição de plasminogénio como fonte para gerar plasmina, que por sua vez activa meprina-α [19], a velocidade de migração de células co-transfectadas /p meprina-a foi aumentada em aproximadamente 50% quando comparado com células de tipo selvagem. Esta diferença foi abolida pela adição do inibidor actinonina meprina. Notavelmente, amarras de meprina-α para a superfície celular através de meprina-β é essencial para reforçar esta resposta pró-migratória na presença de HGF e plasminogénio, como as células MDCK transfectadas com meprina-α ou meprina-β sozinho migrado de modo semelhante ao dos pais células.

MDCK parental células do tipo selvagem (a) (em peso, colunas a branco) e células MDCK co-transfectadas com meprina-α e meprina-β (αβ, painel esquerdo, preenchido colunas pretas) ou transfectadas com quer meprina-α (α) ou meprina-β (β) sozinho (painel da direita, cheia colunas cinzentas) foram cultivadas em placas de laminina 1-revestidas e expostas à de HGF (20 nM) para induzir migração na ausência ou na presença de plasminogénio como indicado. migração induzida por HGF foi monitorado por 3-4 h usando videomicroscopia. É mostrada a velocidade média de migração (+/- SEM) de células transfectadas com meprina em relação ao tratado de forma idêntica as células do tipo selvagem. Os resultados são a média de três a quatro experiências independentes para cada condição. Na presença de plasminogénio (100 nM), a migração de células co-transfectadas /p meprina-ct induzida por HGF foi significativamente melhorada. Este efeito foi revertido na presença do inibidor de meprina actinonina (100 nM). A migração de células transfectadas apenas com um ou outro meprina subunidade não era diferente a partir de células de tipo selvagem. (B) meprina-α promove a angiogénese. Purificada meprina-α activa humana recombinante foi suplementada ao meio de cultura (0,7 ug /ml) no ensaio do anel de aorta de rato e crescimento de vasos no gel de colagénio foi quantificada usando análise de imagem (ver materiais e métodos). N

v: número de navios, N

b: número de ramificações, L

max: comprimento máximo de navios. * P 0,05 comparada com a cultura de órgão não tratado. Os resultados são de três experimentos independentes com triplicatas para cada condição.

purificada recombinante meprina-α humana ativa promoveu a resposta angiogénica no ensaio anel aórtico de ratos [23] (Fig. 1B). análise de imagem assistida por computador de explantes aórticos de ratos em três dimensões cultura em gel de colagénio indicou que meprina-α reforçado o crescimento de capilares, em comparação com culturas de controlo em termos de comprimento (aumento de 44%, p 0,05) e o número de ramificações (aumento de 3 vezes, p 0,05)

expressão meprina-α no câncer colorretal em estágios progressivos de tumor

níveis variáveis ​​de um mRNA meprina-α única de 3,5 kb foram detectados em. amostras de pacientes em todas as fases, incluindo adenomas, que não se correlacionam significativamente com estágios de tumor (Fig. 2 a, B). splicing alternativo de meprina-β no cancro foi relatada anteriormente [24]. Nenhuma evidência de uma isoforma de splicing alternativo de ARNm de meprina-α foi encontrada em tumores. Em imunotransfer�cias proteína meprina-α foi apenas fracamente detectável ou ausente em adenomas, enquanto um subconjunto de amostras de cancro, incluindo estágios de tumor primário I a IV metástases e do fígado, continha grandes quantidades de proteína meprina-α (Fig. 2C). Purificados membranas de borda em escova de intestino delgado humano, que contém ambos meprina-α e meprina-β, foram analisados ​​como um controlo positivo. Tal como descrito anteriormente [4], as espécies moleculares de meprina-α em tumores eram de 10 a 25 kDa, mais pequena do que a proteína de 100 kDa predominante a partir de membranas de borda em escova. Imunocoloração para meprina-α em tumores e metástases hepáticas primária revelou aglomerados de células cancerosas com sinais fortes adjacentes às células cancerosas negativas (Fig. 3). Todos os adenomas mas um marcado o valor mínimo de 1 (Fig. 4A), ao passo que os tumores primários e de metástases do fígado foi maior (p 0,025 para tumores primários fases I a IV, em comparação com metástases do fígado e adenomas).

(A ) Northern blot Representante para meprina-α em RNA total (12 ug) extraído de amostras tumorais de pacientes com diferentes estágios de tumor (adenoma, tumores primários estágios UICC I a IV UICC, M metástases hepáticas). RNA controlo normal da mucosa do cólon saudável também é mostrado (pista C). Diferentes níveis de uma única espécie de ARNm de 3,5 kb foram detectados. A quantidade de ARN carregado foi avaliada por reprobing a mancha de ARN 7S. (B) Quantificação dos níveis de meprina α-ARNm em relação ao ARN 7S. representação caixa de lote de valores densitométricos obtidos a partir de manchas de Northern. Caixa inclui quartil inferior, mediana e quartil superior, suiças 5-95 indicam gama percentil (N = 12 em cada grupo). Não houve diferenças significativas entre os diferentes grupos. (C) Western blot Representante para meprina-α em extractos de proteínas de amostras de tumores (40 mg). Como um controlo, as membranas de borda em escova humanos purificados a partir de intestino delgado (20 ug) foram também analisadas (BBM), onde meprina-α está associada com transmembranar meprina-β em complexos proteína heterodimérica. Meprina-α foi detectado num subconjunto dos tumores. A fim de revelar sinais fracos, a membrana foi superexposta com respeito a amostras de tumores que exibiram forte expressão.

imunocoloração para meprina-α em secções de tecido de-fixados em formalina e amostras de tecidos colorretais embebidos em parafina usando um anticorpo policlonal de coelho primária em conjunto com um anticorpo secundário acoplado a peroxidase e diaminobenzidina como substrato cromogénico. mancha Contador: hematoxilina. ampliação da objetiva: 40 ×. Barra = 50 uM. (A) Em condições normais de cólon mucosa meprina-α é praticamente indetectável. Ocasionalmente, foram detectados sinais na base das regiões das criptas no citosol de células com núcleos apicalmente localizadas (asteriscos). A especificidade destes sinais e a identidade das células não foi adicionalmente investigada. (B) amostra representativa de uma meprina-α estágio do tumor primário positivo III. Tumores exibem um padrão de expressão mosaico. Em cachos de células de cancro, células com sinais fortes para meprina-α (setas) são misturadas com células que mostram sinais fracos ou ausência de sinal em todos os. As células do estroma não expressam meprina-α (C) amostra representativa de meprina-α fase IV positiva tumor primário que mostra agrupamentos de meprina-a células cancerosas positivas (setas). células (D) O câncer de expressar meprina-α (setas) em metástases hepáticas (MET). O tecido hepático normal circundante (HEP) é apenas fracamente coradas.

(A) avaliação semi-quantitativa de expressão meprina-α no carcinoma colorretal utilizando uma pontuação de imuno-histoquímica (pontuação mínima 1, pontuação máxima 16) . + = Valores medianos. (B) Aumento da actividade proteolítica de meprina-α em tumores primários fases I a IV, em comparação com adenomas e metástases. A actividade proteolítica de meprina-α foi medida utilizando o substrato artificial de N-benzoil-L-tirosil-p-amino benzóico (PABA-péptido). O valor de limiar de proteína /h /g 2,5 umol corresponde a dois desvios padrão acima do valor médio no grupo de adenoma. Um aumento de actividades proteolíticas acima do limiar foi encontrada em 36%, 40%, 44% e 33% das amostras de tumor primário em fases UICC I, II, III e IV, respectivamente, mas não nas metástases do fígado. A análise estatística foi realizada entre os tumores primários estágios I a IV UICC como um grupo e adenomas, ou metástases (one-sided Wilcoxon rank sum de amostras independentes). + = Valores medianos.

actividade meprina-α, a activação e inibição de zimogénio

actividade

meprina-α foi especificamente medidos em extractos de proteína a partir das amostras de tecido, na presença de uma ampla variedade inibidor da protease alvo todas as classes de proteases, exceto metaloproteases. actividade meprina-α foi baixa em adenomas, ao passo que a actividade significativamente melhorada foi medida em um subconjunto (33 a 44%) dos tumores primários das fases I a IV (Figura 4B, p. 0,01 para as fases I a IV em comparação com adenomas). Em metástases hepáticas, inesperadamente, os níveis de actividade meprina-alfa foram tão baixas como aqueles nos adenomas, apesar expressão significativa da proteína (P 0,01 comparado com etapas de tumores primários I a IV)

A discrepância aparente entre o baixo. níveis de actividade e os níveis de proteína de alta meprina-α em metástases do fígado (Fig. 2C e 3) pode ser devido a falta de activação de zimogénio meprina-α, ou um inibidor especificamente presentes em metástases do fígado. Para determinar a extensão da activação do zimogénio em amostras de tumor foram primeiro imunoprecipitadas zimogénio e formas activas de meprina-α e actividade medida directamente sobre os grânulos. Este valor, que representa a piscina protease endogenamente activada, foi comparada com a actividade em imunoprecipitados após a activação máxima zimogénio por tratamento com tripsina limitada [18]. A forma de zimogénio do meprina-α predominou em todas as amostras. No entanto, a activação endógena de meprina-α foi significativamente maior do que nos tumores primários metástases do fígado (Fig. 5a). Em tumores primários I-IV, tanto quanto 20% do total meprina-α foi activado endogenamente, e todos menos um amostra indicada activação endógena acima de 5%. Por outro lado, a ativação endógena foi inferior a 5% em todos, mas duas amostras de metástases hepáticas. Em conclusão, o aumento da activação de zimogénio pode contribuir para o aumento da actividade meprina-α nos locais de tumores primários em comparação com metástases no fígado.

meprina-α foi imunoprecipitada a partir de amostras de tumores, dividido em duas alíquotas de derivar e endógena actividade total, como descrito em Materiais e Métodos. (A) índice de actividade meprina-α endógeno em relação à actividade total de tumores primários (P, N = 7) e metástases do fígado (m, n = 10). activação de zimogénio é significativamente aumentada nos tumores primários comparada com metástases hepáticas. amostras (B) de soro de pacientes com câncer colorretal apresentam actividades inibitórias inferiores contra meprina-α. A actividade proteolítica de meprina-α recombinante humana purificada (800 ng /ml) foi ensaiada na presença de 20% de soro humano. As actividades são apresentadas em relação ao ensaio de referência com 20% de tampão fosfato pH 7,3 solução salina (= 1). N: Controlos saudáveis ​​normais (N = 19), NC: Grupo pacientes não-cancerosas, que inclui amostras de 22 inviduals com doenças inflamatórias do intestino, CRCI-III: pacientes com câncer colorretal (N = 15) estágios I-III. CRCIV: pacientes com câncer colorretal (N = 9) estágio IV. Reduziu significativamente a inibição da meprina-α no soro de pacientes com câncer colorretal.

inibição reduzida de meprina-α no soro de pacientes com câncer colorretal

Circulação células cancerosas podem encontrar fatores no sangue que modulam a actividade meprina-α. Com efeito, num ensaio de actividade de meprina-α recombinante na presença de 20% de soro humano a partir de controlos saudáveis ​​e um grupo de pacientes com doenças inflamatórias intestinais indicada a inibição de 35% (intervalo de 5-50%) e 22% (intervalo de 0-59 %), respectivamente. Em contraste, soros de pacientes com cancro colorectal (estágios I-IV) inibiu meprina-α a uma significativamente menor grau (12% em média, 0-37%, p = 2,8 * 10

-6 comparação com controlos saudáveis, p = 0,013 em comparação com os pacientes com doenças inflamatórias) (Fig. 5B). Os soros de pacientes com estágios I-III mostrou uma capacidade inibidora reduzida em comparação com pacientes normais, que não foi significativamente diferente dos pacientes na fase IV. A inibição no soro era independente da MBL, tal como as concentrações séricas de MBL não diferiu significativamente entre os grupos de estudo e também não se correlacionou com a inibição meprina-α (não mostrado). Além disso, a MBL recombinante não inibiu a humana, de ratinho e de rato meprina no ensaio de N-benzoil-L-tirosil-p-amino benzóico (PABA-péptido) (Tabela S1).

Em resumo, há é um padrão de regulação dinâmico e complexo para exercer a actividade de meprina-α no cancro colo-rectal. Aumento da ativação zymogen pode contribuir para o aumento da actividade proteolítica em estágios tumores primários I a IV, ea atividade inibitória contra meprina-α é reduzida no sangue em pacientes com câncer colorretal.

Discussão

Este estudo implica que meprina-α é activa na transição do crescimento benigno (adenoma) com tumores malignos primários. atividade Paba-peptídeo no tecido canceroso é específico para meprina em nosso ensaio, como nós teve o cuidado de impedir qualquer actividade inespecífica, completando o ensaio com uma ampla mistura de inibidores de protease gama. Notavelmente, as proteases tipo quimotripsina, que são as enzimas conhecidas apenas capazes de clivar PABA-péptido para além de meprina [25], são inibida sob estas condições. proteína meprina-α e atividade aumentou no último grupo, embora não houve diferença significativa de níveis de mRNA correspondente entre os diferentes grupos. Os adenomas, por definição, são caracterizadas por um aumento da taxa de crescimento das células com a diferenciação normal e a polarização de células [26]. Por conseguinte, semelhante à de cólon normal da mucosa, meprina-α pode ser segregado e subsequentemente perdido para o lúmen do intestino, enquanto que a protease é retida dentro do tecido de tumor no cancro colo-rectal devido a secreção não-polarizada aberrante, um mecanismo por nós descrito anteriormente [ ,,,0],4]. Além disso, há evidências de regulamento pós-transcricional de meprina-α a partir de um estudo anterior, como mRNA meprina-α foi detectável por

in situ

hibridação em ambas as regiões cripta e das vilosidades, enquanto que a proteína como detectado por imunocoloração foi apenas presente em enterócitos das vilosidades [6].

no cancro colorectal, os tumores primários continham aumento da atividade meprina-α e freqüentemente abrigava uma subpopulação de células cancerosas com a expressão da proteína forte meprina-α, em especial a UICC estágios III e IV, isto é, após a progressão para metástase para os nódulos linfáticos e locais distantes (Fig. 2 e 3). A disseminação de células cancerosas se correlaciona, assim, com o aumento da proteína meprina-α e atividade. No entanto, notamos que a correlação entre os sinais de immunoblot, partituras imunocoloração e níveis-α-atividade meprina nos grupos de tumores primários não é apertado. A pontuação imunocoloração se considera frequência e intensidade dos sinais meprina-a entre as células cancerosas apenas dentro de uma área restrita no local da amostra, enquanto que o sinal immunoblot é uma média de toda a amostra incluindo secretado meprina-α acumulando no estroma tumoral [4] . O nível de actividade meprina-α é adicionalmente afectada pela activação do zimogénio e a presença de inibidores.

Os soros de pacientes com cancro colo-rectal apresentou actividade inibidora significativamente menor no sentido de meprina-α de controlos saudáveis ​​e pacientes com doenças inflamatórias intestinais, indicando que a emigração de circulação de meprina-α expressando células de cancro fora dos vasos sanguíneos pode ser facilitada. A actividade inibidora no soro não foi devido a mannan-ligação à lectina, um inibidor endógeno meprina relatados anteriormente [16], e, portanto, é uma contribuição de um ou vários inibidor adicional (s). Em um relatório recente, fetu�a-A e cistatina C têm sido relatados como esses inibidores meprina endógenos [17]. De fato, usando MBL humana recombinante, não encontramos nenhuma inibição da meprina (Tabela S1). Este resultado está em contraste com o relatório por Hirano et al. [16]. No entanto, nossos dados estão de acordo com a falta de uma correlação entre a inibição por soro do paciente e concentração MBL. Em segundo lugar, como Hirano et al. usados ​​MBL purificada a partir de soro humano para os ensaios de inibição de meprina, especula-se que a discrepância entre os nossos e os seus dados é devido a factores de contaminantes a partir do soro humano, como fetuína-A e /ou cistatina C.

Há é um padrão de regulação dinâmico e complexo da actividade de meprina-α no cancro colo-rectal. O aumento da activação de zimogénio contribui para o aumento da actividade proteolítica em tumores primários fases I a IV (Fig. 5A), e a actividade inibidora contra meprina-α é reduzida no sangue em doentes com cancro colorectal (Fig. 5B). A activação ineficiente nas metástases do fígado é de acordo com a observação prévia de que a uPA-sistema, um activador de meprina-α, é inactivo em metástases do fígado, devido à falta de activação de uPA e da expressão ao longo do inibidor do activador de plasminogénio [27] , [28]. Embora sejam conhecidos muitos metaloproteases de matriz (MMPs) para ser aumentada em tumores primários invasivos em cancro colorrectal [29], existem poucas análises que incluem metástases hepáticas. Num desses estudos, MMP-9 foi demonstrado que ser aumentada nos tumores primários mas não metástases no fígado [30]. Esse estudo e o nosso ponto de dados para diferenças significativas entre as redes de protease em tumores e metástases do fígado primário, o que é relevante para as abordagens terapêuticas que utilizam inibidores de protease.

estudada a migração celular em células MDCK que expressa meprina-α na superfície da célula ligados em complexos proteína heterodimérica com transmembranar meprina-β [31]. células que expressam meprina migrou significativamente mais rápido em laminina-1 placas revestidas na presença de plasminogénio e HGF. Meprina-α pode ser activada na superfície da célula pela plasmina, produzida a partir de plasminogénio através da actividade do activador de tipo uroquinase de plasminogénio (uPA) ligada ao seu receptor (RAP-u), que ambos são conhecidos por serem sobre-regulada por HGF em células MDCK [32]. Este sistema provavelmente também contribui para a ativação de meprina-α em tumores

in vivo

, como u-PA e u-PAR são regulados positivamente em cancro colo-rectal [33], [34], [35] , [36]. No nosso ensaio de migração, o efeito pró-migratório é, de facto, devido à meprina-α, como a plasmina activa meprina-α mas não meprina-β [7] e porque actinonina, que reverte o efeito pró-migratória, inibe meprina-α com aproximadamente 100 vezes maior potência (K

i 2 * 10

-8 M) do que meprina-β (K

i 2 * 10

-6 M) [10].

Ambos laminina-1 e laminina-5 são clivados por meprina-α

in vitro

[37], e especula-se que meprina-α pode expor epítopos crípticos pró-migratórias de uma forma semelhante tal como foi previamente mostrado com laminina-5 e laminina-1 para MT1-MMP [38] e elastase [39], respectivamente. O sistema de uPA-plasminogênio também é crucialmente importante na angiogênese [23], [40], e plasmina, por sua vez pode ativar meprina-α como um efetor angiogênico jusante no cancro colorectal. De acordo com os nossos dados, um efeito pró-angiogénico de meprina-α também foi observada em um knockdown morfolino em peixes-zebra [14].

A actividade pró-angiogênicas foi evidente com extracelular meprina-α solúvel, enquanto seu efeito pró-migratória era evidente em células com meprina-α na sua superfície celular. Portanto, o efeito pró-angiogênicas de meprina-α liberada pelas células cancerosas podem ser promovida pela sua actividade proteolítica fora e distante de células pró-angiogénicos /vasculogênicos. Secretado meprina-α pode assim condicionar o ambiente tumoral para promover a angiogénese aumentada em conjunto com outros factores pró-angiogénicos, enquanto meprina-α amarrado à superfície da célula, podem promover a migração das próprias células cancerosas. espera-se que ambos os processos dependentes de meprina para promover conjuntamente a progressão do tumor.

Em conclusão, este estudo revela um padrão de regulação complexa e dinâmica para meprina-α na progressão tumoral. A transição de fases malignas em tumores colorrectais correlaciona-se com o aumento da actividade meprinα nos locais de tumores primários, consistentes com um papel na invasão e disseminação metastática de células cancerosas. Um papel para meprina-α no presente processo é ainda apoiada pela sua actividade pró-angiogénico e pró-migratório. Os nossos dados também mostram que a promoção da migração depende da expressão simultanous de meprina-β amarrar meprina-α sobre a superfície da célula. A falta de ARNm meprina-β detectável em todo o tumor não exclui a sua indução numa subpopulação de células cancerosas. Nossos dados estão de acordo com a visão de que as células cancerosas meprina-α /β co-expressam são susceptíveis de migrar para longe da massa tumoral. Nós anteriormente descrito que meprina-β enfraquece junções intercelulares [41]. Estudos futuros deverão centrar-se na análise do papel da meprins da emigração destas células cancerosas. A actividade inibitória para com meprina-α é menor no soro de pacientes com cancro colo-rectal, o que pode facilitar a difusão de células cancerosas que expressam meprina. As abordagens terapêuticas com inibidores de protease de segmentação meprina-α em tumores primários e na corrente sanguínea pode contrariar a progressão do tumor. Por outro lado, a actividade meprina-α é baixa em metástases do fígado, e, portanto, a inibição desta protease neste local não é esperado ser um tratamento eficaz.

Materiais e Métodos

humano recombinante meprina

recombinante meprina-α activo e meprina-β foi purificada a partir de células de insecto, tal como descrito anteriormente [7], [42]. Nenhuma actividade de tripsina residual foi detectável nas meprins recombinantes purificadas.

A migração celular ensaio

células

Madin-Darby do rim de canino (MDCK) foram cultivadas em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 5% de FCS , 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (meio de cultura de células e suplementos de Invitrogen, Basileia, Suíça). As células transfectadas com meprina MDCK [31] e do tipo selvagem parental células MDCK foram semeadas em placas de 12 poços revestidas de laminina-1 a uma densidade de 10’000 células /poço (placas de 12 cavidades de Costar, Cambridge, MA, EUA, purificada laminina-1 a partir de sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm, Sigma, St. Louis, MO, EUA a) e incubadas durante a noite em MEM com 5% de FCS. Após uma pré-incubação de 48 h em meio isento de soro (DMEM avançada, Invitrogen) contendo 20 nM de factor de crescimento de hepatócitos (HGF), as células que migram foram registados utilizando videomicroscopia de lapso de tempo de 3-4 h. O plasminogénio (American Diagnostica, Pfungstadt, Alemanha) e actinonina (Sigma) foram adicionados ambos a 100 nM. Faixas de migração foram avaliadas como descrito anteriormente [22]. HGF migração induzida de células MDCK a velocidades entre 27 e 84 uM /h. Na ausência de HGF, as células MDCK crescem em cachos e não migram. Devido à limitação da técnica da montagem experimental utilizada, várias experiências de migração tinha que ser levadas a cabo sequencialmente em dias diferentes. Como as velocidades médias de migração variaram substancialmente entre as sessões experimentais, independentemente das condições avaliadas. as medições foram normalizadas para a migração de células do tipo selvagem observados em cada sessão experimental.

A angiogénese ensaio (ensaio do anel aórtico)

anéis de aorta torácica de ratos (1 mm de comprimento) foram cultivadas em geles de colagénio tridimensionais (3 de rato cauda gel de colagénio intersticial, 1,5 mg /ml, Serva, Heidelberg, Alemanha) [23]. As culturas foram mantidas durante 9 dias a 37 ° C em 6 ml de MCDB 131 (Invitrogen) com NaHCO3 a 25 mM, 1% de glutamina, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina na presença ou ausência de 0,7 ug /ml purificada recombinante meprina-α humano ativo. A resposta angiogénica foi quantificada usando análise de imagem com o software Afélio 3,2 (Adcis) em três experiências independentes (cada um em triplicado). foram determinados seguintes parâmetros geométricos e morfológicas:. número de microvasos (NV), comprimento de microvasos máxima (Lmax) eo número total de sucursais em microvasos (Nb) [43]

Os pacientes

Recolha de espécimes tumorais durante intervenções cirúrgicas foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Berna, Suíça. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. Carcinomas foram encenadas de acordo com a UICC nomenclatura. O estudo incluiu 72 pacientes (49/23 masculino /feminino, média de 64,5 anos, intervalo 20-90 anos), com 12 pacientes em cada um dos seis grupos seguintes: Os adenomas (5/7 m /f, mediana de 68,5 anos, faixa de 20 -89 anos), tumores primários estágio I (7/5 m /f, mediana de 72,5 anos, intervalo 60-90 anos), fase II (7/5 m /f, mediana 73 anos, intervalo 50-82 anos), estágio III (10/2 masculino /feminino, a mediana de 64 anos, intervalo 48-84 anos), estágio IV (9/3 m /f, mediana de 60,5 anos, intervalo 43-84 anos) e metástases hepáticas (11/1 m /f , mediana de 57,5 ​​anos, variam 31-84 anos). As amostras deste grupo de estudo foram analisados ​​por transferência de Northern e Western, imuno-histoquímica e submetido a ensaios de atividade meprina. As experiências mostradas na Fig. 5A /B incluiu mais oito amostras de metástases hepáticas (6/2 m /f, mediana 68 anos, intervalo 37-82 anos).