Abstract
Fundo
A base molecular e as características dos não-familial cancro medular da tiróide são mal compreendidos. Neste estudo, foi realizada microRNA profiling (miRNA) de amostras de tumores de câncer de tireóide papilar familiares e esporádicas.
Metodologia /Principais Achados
Genome ampla profiling miRNA de câncer de tireóide papilar esporádica e familial foi realizada . miARNs expressos diferencialmente foram validados por RT-PCR quantitativo. A expressão ectópica de miR-886-3p em linhas de cancro da tiróide foi realizada para identificar as vias visados pela miARN, bem como, para determinar o seu efeito sobre a biologia de células tumorais. Encontramos quatro miRNAs diferencialmente expressos entre amostras de familiares e esporádicos papilar da tiróide tumor de câncer. MiR-886-3p e miR-20a foram validados para ser expresso diferencialmente por 3- e 4 vezes, respectivamente. análise de caminho de dados de expressão do genoma nas células com superexpressão análise de miR-886-3p e previsão alvo mostrou genes envolvidos na replicação do DNA e as vias de adesão focal foram regulados pelo miR-886-3p. Superexpressão de miR-886-3p em linhas celulares de cancro da tiróide proliferação celular inibiu significativamente, o número eo tamanho dos esferóides e migração celular. Além disso, a sobre-expressão de miR-886-3p aumentou o número de células em fase S.
Conclusões /Significado
Nossas descobertas pela primeira vez sugerem que miR-886-3p desempenha um papel importante na biologia de células tumorais do câncer de tireóide e regula genes envolvidos na replicação do DNA e de adesão focal. Assim, miR-886-3p pode desempenhar um papel na iniciação e ou progressão do câncer de tireóide papilar
Citation:. Xiong Y, Zhang L, Holloway AK, Wu X, Su L, Kebebew E (2011) Mir-886-3p regula a proliferação e migração celular, e está desregulado em Familial não-medular do cancro de tiróide. PLoS ONE 6 (10): e24717. doi: 10.1371 /journal.pone.0024717
editor: Marian Ludgate, da Universidade Cardiff, Reino Unido
Recebido: 10 de junho de 2011; Aceito: 17 de agosto de 2011; Publicação: 05 de outubro de 2011
Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0
Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de tireóide é uma das mais rápido crescimento diagnósticos de câncer nos Estados Unidos com mais de 44.000 novos casos estimados para ocorrer em 2011 [1]. cancro da tiróide não medular familiar (FNMTC) pode ocorrer como um componente menor de câncer hereditário (, doença de Cowden, Carney complexa tipo 1, síndrome de Werner, McCune-Albright Síndrome de Gardner) ou como a característica predominante [2]. A maioria dos casos de FNMTC são o cancro papilar da tiróide e têm um padrão autossômico dominante de herança com penetrância incompleta. contas FNMTC para até 8% de todos os casos de cancro da tiróide [2], [3], [4], [5], [6]. Nos câncer hereditário mencionados acima, os pacientes apresentam lesões extratireoidiana distintas e os genes de susceptibilidade responsáveis por essas síndromes são conhecidos. No entanto, a maioria ( 95%) dos casos FNMTC ocorrer como familiar isolado casos de cancro da tiróide papilífero ou folicular para a qual o gene (s) susceptibilidade é desconhecida
FNMTC é definido como quando dois ou mais parentes de primeiro grau. são afetados com câncer de tireóide não-medular. A base genética da FNMTC é mal compreendida. Em estudos de ligação, vários grupos identificaram loci cromossómica associada FNMTC: 1q21, 2q21, 6q22, 8p23.1-p22, e 19p13.2 [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. análise de mutação mostrou que famílias com FNMTC não têm mutações germinativas em
BRAF
,
RAS
, e
/PTC
genes RET que são comumente mutados somaticamente em cancros da tiróide de origem das células foliculares [2]. Além disso, a análise de mutações somáticas (
BRAF
,
RAS
, e
RET /PTC
) em amostras papilares esporádica e familiar de tumor de câncer de tireóide não mostrou diferença na tarifa e tipo de mutações nestes histologias [2], [6], [14]. Assim, não se sabe se o perfil molecular de esporádicos contra o cancro da tiróide familiar é diferente. Além disso, também se sabe se existe uma base molecular para a idade precoce do aparecimento e comportamento mais agressivo doença observada em FNMTC comparação com doença esporádica [6], [15], [16].
MicroRNAs ( miARNs) são pequenos (~21 nucleótidos de comprimento) não codificante ARN que regulam a expressão do gene e desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a tumorigénese [1] – [2]. Um miARN específico pode funcionar quer como um oncogene ou como um supressor de tumor, através da regulação da expressão do oncogene alvo (s) e o gene (s) supressor de tumor, respectivamente. Na maioria dos casos, miARNs se ligam a regiões 3 ‘não traduzida (3’-UTRs) de mRNAs alvo, levando a degradação do mRNA ou a repressão da tradução. No cancro da tiróide, um polimorfismo de nucleotídeo único comum em pré-miR-146a foi relatado para inibir a expressão de miRNA maduro e aumentar o risco de desenvolver câncer de tireóide papilar [17]. Para nosso conhecimento, não foram realizados estudos comparando os perfis de miRNA de cancros familiares e esporádicas em geral e especificamente para o câncer de tireóide.
Neste estudo, foi realizada profiling miRNA de amostras de familiares e esporádicos papilar da tiróide tumor de câncer. Descobrimos que miR-886-3p foi regulada negativamente no câncer de tireóide papilar, em comparação ao normal e diferencialmente expressos em câncer de tireóide papilar familiar em relação ao câncer de tireóide papilar esporádica. análise de caminho de dados de expressão do genoma em células que sobre-expressam análise miR-886-3p e predição alvo mostrou genes envolvidos na via de replicação de ADN e de adesão focal foram regulados pelo miR-886-3p. Na verdade, a sobre-expressão de miR-886-3p em linhas celulares de cancro da tiróide inibiu significativamente a proliferação celular, o número eo tamanho dos esferóides e migração.
Materiais e Métodos
amostras de tecido tiróide
amostras de tecido da tiróide foram congeladas rapidamente em azoto líquido na altura da tireoidectomia. O conselho de revisão National Cancer Institute aprovou este protocolo de pesquisa, após consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. Todas as amostras de tecido foram submetidos a avaliação histológica adicional por um patologista endócrino para confirmar o diagnóstico e identificar amostras com células de tumor maior do que 80%. Foram utilizados 28 amostras convencionais papilares do tumor cancro da tiróide (21 esporádica, 7 familiares) e 10 amostras de tecido da tireóide normais para a matriz de perfis miRNA. Um questionário história familiar foi usada para determinar se os tumores deverão ser classificados como esporádicos ou familiares. FNMTC foi definido quando 2 ou mais parentes de primeiro grau foram afetados com câncer de tireóide de origem das células foliculares. Casos de câncer de tireóide foram confirmados em membros da família afetados. Todas as amostras de tumor FNMTC eram de famílias diferentes. Em 5 de 7 amostras de tumores de FNMTC havia três parentes de primeiro grau afetados e, em 2 de 7 havia dois parentes de primeiro grau afetados. As amostras de tumor foram pareados por idade (+/- 2 anos), sexo e estádio TNM de câncer (em uma proporção de casos esporádicos-to-familial 03:01).
Mirna microarray
um total de 28 microarrays (Exiqon ™) foram executados comparando os dois tipos de câncer papilar de tireóide familiares e esporádicas a um pool de tecido tireoidiano normal. O log
2 relação entre o Cy5 para Cy3 sinais de intensidade foi calculada para cada miRNA em cada array (sem subtração de fundo) e os dados foram normalizados por impressão ponta loess normalização [18], [19]. Desde miARNs individuais foram representadas por quatro sondas sobre a matriz, o log médio normalizado
2 rácio das sondas em replicado (para aqueles com mais do que uma sonda não sinalizado) foi utilizada como o valor para o miARN. O log resumido
2 rácios para cada experimento foram então usados em estatísticas t moderados e cálculo de valor-p utilizando o pacote limma no R /Bioconductor [20], [21] com ajuste para taxa de detecção falsa usando o Benjamini-Hochberg método de [22]. dados de microarranjos Mirna, que é Miame complacente, foi depositado no banco de dados GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
linhas de células e condições de cultura
linhas celulares de cancro da tiróide humana FTC-133 (carcinoma folicular) e TPC-1 (câncer de tireóide papilar) foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) com 4.500 mg /L D-glucose, L-glutamina e 110 mg /l de piruvato de sódio) enriquecido com 10% de soro, hormona estimulante da tiróide (TSH) (10 mU /mL), penicilina (10000 U /ml), estreptomicina (10.000 U /mL), Fungizona (250 mg /mL) e insulina ( linhas de 10 (ig /ml) numa incubadora humidificada padrão, a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO
2 e 95% de O
2 atmosfera. Ambas as linhas celulares são estabelecidas e autenticados tiróide celulares de cancro [23], [ ,,,0],24], [25], [26]. A linha de células TPC-1 foi fornecido pelo Dr. Nabuo Satoh (Japão) e linha celular de FTC-133 foi fornecido pelo Dr. Peter Goretzki (Alemanha). meio livre de soro (DMEM- F12) suplementado com 4 hormonas (insulina [10 ug /ml], somatostatina [10 ng /mL], transferrina [5 ug /mL], e a hidrocortisona foi utilizado [0,36 ng /ml]) para os estudos funcionais.
miARN Transfecção
miARN maduro precursor (pré-miR-886-3p, Applied Biosystems, Foster City, CA) foi transfectado em células utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante . Uma sequência aleatória pré-miR (Controlo pré-miR-negativa) (Applied Biosystems) foi utilizado como controlo negativo (miR-NC).
Isolamento de ARN e quantitativo em tempo real de RT-PCR
o RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. TaqMan Mirna Ensaios (Applied Biosystems) foram usadas para medir o nível de expressão de miRNA. O ARN total foi transcrito de forma inversa com um iniciador específico do miARN, seguido por PCR em tempo real com sondas TaqMan. U6 foi utilizado como o controle endógeno. A quantidade relativa de ARNm foi determinada utilizando TaqMan Ensaio (Applied Biosystems) em um sistema HT 7900 da ABI, utilizando GAPDH como um controlo humano endógeno. O método ΔΔ Ct foi usado para calcular os níveis de expressão.
ensaio de proliferação
A proliferação celular foi determinada utilizando o Ensaio de Proliferação celular CyQUANT (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. A intensidade de fluorescência foi medida utilizando um leitor de fluorescência de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
ensaio de migração
A capacidade migratória das células cancerosas da tiróide foi avaliada pelo ensaio de ferida zero em células cultivadas em monocamada. Aproximadamente 150 mil células foram transfectadas com pré-miR-886-3p (25 nM) ou o miR-NC (25 nM) e depois plaqueadas em placas de 6 poços e deixadas a aderir e crescer durante 44 horas. Em seguida, três feridas verticais foram feitas com uma ponta de pipeta 10 ul estéril e uma linha horizontal foi feita entre os três linhas para permitir a observação de células no mesmo ponto. As células foram inspecionados a cada 6 horas e medidas tomadas até 22 horas do ferimento inicial.
Genome-wide expressão de mRNA microarray
células TPC-1 foram transfectadas com pré-miR-886- 3p e pré-miR-NC. Setenta e duas horas após a transfecção, as células foram lavadas três vezes com PBS. O ARN total foi preparado a partir de culturas de células em triplicado usando o kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. ARN qualidade foi assegurada, antes da marcação, utilizando o ARN Agilent 6000 Nano kit e o Bioanalyzer 2100. Uma cento e cinquenta ng de ARN total foi usado para realizar de cDNA de transcrição reversa, a síntese, a amplificação, a fragmentação e a rotulagem do terminal com a rotulagem GeneChip WT sentido alvo e Controle de Reagentes (Affymetrix, Santa Clara, CA). Aproximadamente 25 ng /mL de cDNA foi hibridado com o gene humano Affymetrix GeneChip 1,0 ST matriz. As matrizes foram lavadas e coradas utilizando o protocolo fluídica FS450_0007 procedimento em uma estação Fluidics Affymetrix 450. As intensidades de sonda foram digitalizados pelo scanner GeneChip 3000. Os dados brutos foi normalizada e analisados utilizando Partek Genomic Suite (Partek Inc., St Louis, MO , EUA). A análise da variância foi usada para determinar os conjuntos de sondas significativamente diferentes entre os dois grupos. A lista gene foi filtrada com um ponto de corte de dobra-mudança de 2. Isto resultou na produção de lista de genes com genes que têm expressão diferencial significativa na p≤0.001 e diferenças de 2 vezes ou mais. análise de caminho foi realizada utilizando os recursos de bioinformática Davi.
fluxo do ciclo celular por citometria análise
Os efeitos da sobre-expressão de miR-886-3p na progressão do ciclo celular foram avaliados através de iodeto de propídio citometria de fluxo. Resumidamente, as células TPC-1 e FTC-133 foram transfectadas com pré-miR-886-3p ou pré-miR-CN durante 72 horas a 120 horas. As células foram lavadas com PBS, colhidas e fixadas em etanol a 70%. Em seguida, as células foram tratadas com (500 U /mL) de ARNase isenta de ADNase e coradas com iodeto de propídio. Amostras de células foram analisadas num FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA), e G
0G
1, S e G
fracções de fase 2M foram determinadas usando o software ModFitLT (Topsham, ME).
fluxo apoptose análise de citometria de
Os efeitos da sobre-expressão de miR-886-3p sobre a morte celular foram avaliadas por anexina V- FITC e fluxo de iodeto de propídio citometria usando ApoAlert anexina V kit (Clontech, mountain View, CA). TPC-1 e células FTC-133 foram transfectadas com pré-miR-886-3p ou pré-miR-CN durante 72 horas a 120 horas. As células foram colhidas e coradas com anexina V-FITC e iodeto de propidio de acordo com o protocolo do fabricante. amostras de células foram analisadas num FACSCalibur e frações apoptóticos foram determinados.
luciferase Reporter Assay
O par 1,160 base de 3′-UTR de
CDC6
foi clonado no vazio luciferase repórter vector pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), gerando um tipo selvagem
CDC6
construção repórter de luciferase UTR (pEZX-WT-UTR). Mutações no 3′-UTR de
CDC6
foram concebidos para os primeiros quatro nucleótidos (a CACC GTGG) ou os últimos três nucleótidos (CGC GCG) da região da semente 7-mero de o sítio de ligação putativo do miR-886-3p, gerando dois mutantes denominados como pEZX-Mut-UTR-01 e pEZX-Mut-UTR-02, respectivamente. Todas as construções foram verificadas-sequência por sequenciação de ADN. Para o ensaio da luciferase dupla, células TPC-1 foram plaqueadas em triplicado em placas de 12 poços e co-transfectadas com 0,25 ug da construção repórter e 15 pmol de pré-miR-886-3p ou pré-miR-NC utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Às 24 horas, as células foram lisadas e ensaiadas para tanto do pirilampo e da luciferase da Renilla usando Luc-Par ™ miR Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD) num leitor de microplacas SpectraMax M5E (Molecular Device, Sunnyvale, CA) de acordo com os fabricantes ‘instruções.
Análise de dados
os dados são apresentados como a média ± erro padrão da média. Para determinar a significância estatística, foi utilizado o teste, o teste t de Mann-Whitney U e análise de variância, conforme apropriado. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.
Resultados
profiling Mirna de câncer de tireóide papilar esporádica e familial
Nós comparamos o perfil de expressão de miRNA de câncer de tireóide papilar familial e esporádica amostras de tumores usando todo o genoma análise de miRNA microarray. As amostras foram pareados com base na idade e sexo dos pacientes, eo estágio do tumor TNM. miARN expressão em amostras de tumores foi comparada com amostras de tecido da tiróide normais. Havia 232 miRNAs em esporádica e 135 miRNAs em câncer de tireóide papilar familiar que foram desregulados em comparação com amostras de tecido normal da tireóide (Figura 1A) (p 0,05). Cem nove dos miARNs desreguladas eram únicos para esporádica, 13 foram únicas para familiar e quatro miARNs foram significativamente expresso diferencialmente entre o cancro papilar da tiróide familiar e esporádica (Figura 1A e 1B). Dois dos quatro miRNAs foram validados a ser significativamente diferencialmente expressos entre familial e câncer de tireóide papilar esporádica pelo quantitativo em tempo real RT-PCR (Figura 2). Tanto miR-20a e miR-886-3p também foram significativamente reprimidos no cancro papilar da tiróide esporádicos em comparação com tecido tireoidiano normal (p = 0,032 e p = 0,0032, respectivamente) (Figura 1B).
A) Comparação de miRNAs diferencialmente expressos em câncer de tireóide papilar esporádica e familial em comparação com o tecido normal da tireóide. O círculo esporádica indica comparação deste grupo com o tecido normal da tireóide, o círculo familiar indica comparação deste grupo com o tecido normal da tireóide, e o círculo familiar-esporádica indica comparação entre tumores familiares e esporádicas. B) por cento Relativa miRNA diferença na expressão entre tumores familiares e esporádicas normalizados para amostras de tecidos normais. * Valor de p . 0,05
miR-20a foi de 4 vezes e miR-886-3p foi 3 vezes maior no câncer de tireóide papilar familiar, em comparação com esporádica (p = 0,025 para miR-20a , p = 0,028 para o miR-886-3p, p = 0,37 para o miR-195, P = 0,46 para miR-29c). Os valores são mais expressão média e menos o erro padrão da média. O eixo Y representa a relação entre miRNA e U6 RNA usando 2
-ΔΔCt método, e o menor valor da amostra foi definida de 1,0.
genes-alvo e vias de miR-886- 3p tiróide em células cancerosas
Dada a função de miR-886-3p na biologia de células de tumor é desconhecida, fomos os primeiros interessado na determinação do gene alvo (s) e via (s) que podem ser regulados por miR -886-3p. Foram utilizadas duas abordagens para determinar alvos de miR-886-3p: previsão miARN alvo e análise de expressão de ARNm do genoma em células que sobre-expressam o miR-886-3p (Figura 3). Encontramos 730 previu genes-alvo para miR-866-3p usando bancos de dados de previsão de destino (Miranda, miRBase, varreduras alvo). Através da realização de análise de caminho KEGG sobre os mRNAs desregulados em menos de miR-886-3p sob células expressas, encontramos genes envolvidos na replicação de ADN e vias de adesão focal foram misexpressed sobre a superexpressão de miR-886-3p em linhas celulares de cancro da tiróide. Integração destas bioinformática abordagens identificou seis genes em comum entre as análises. Estes genes são, portanto, previsto para ser alvos de miR-886-3p.
Para aprofundar esta hipótese, foram selecionados quatro destes genes para validação sobre a sobre-expressão de miR-886-3p. Encontrámos regulação negativa significativa de todos os quatro genes sobre a superexpressão de miR-886-3p por RT-PCR quantitativo (figura 4). Desses genes, que estavam particularmente interessados em
CDC6
uma vez que este gene codifica um regulador potente da replicação de DNA e oncogênese [27]. Curiosamente, a análise western blot mostrou regulação baixa de
CDC6
expressão da proteína dentro de 72 horas de sobre-expressão de miR-886-3p (Figura 5). Para avaliar ainda mais se
CDC6
é um alvo direto da regulação miR-886-3p, transfecção do 3’UTR
CDC6
selvagem vector tipo em células de cancro da tiróide com superexpressão de miR-886-3p mostraram regulação negativa significativa da actividade de luciferase sugerindo que
CDC6
era um alvo directo de miR-886-3p (Figura 6). As mutações na região de semente previsto para miR-886-3p na 3’UTR de
CDC6
aboliu este efeito, sugerindo ainda que o miR-886-3p regula directamente
expressão CDC6
(Figura 6 ).
a transfecção de pré-miR-886-3p diminuiu significativamente os níveis de mRNA de quatro genes-alvo (
CDC6
,
PIP5K1C
,
PXN
,
ZYX
) em a) linha de células TPC-1 e B) linha celular de FTC-133 (* p 0,05; ** p 0,01). O eixo Y representa a relação entre o gene-alvo específico e GAPDH utilizando 2
-ΔΔCt método, e o valor do grupo de miR-NC foi ajustado a 1,0 para permitir a comparação de diferenças de dobragem entre as diferentes linhas celulares e genes.
a) Representante imagem western blot de
CDC6
expressão da proteína em 72 horas após a transfecção com pré-miR-886-3p em relação ao controle negativo (miR-NC). B) Banda densitometria quantificação de
CDC6
expressão da proteína. O ImageJ software (Maryland, EUA) foi utilizado para a análise de densitometria de Western blot.
A) vector pEZX-WT-UTR tanto com Renilla luciferase (hRLuc) foi utilizado como um controlo interno e luciferase de vaga-lume (hLuc) era a montante da construção de 3′-UTR. B) sítio de ligação putativo do miR-886-3p no
CDC6
UTR 3 ‘juntamente com as mutações na região da semente previsto. C) esquerdo da figura mostra a actividade da luciferase de pEZX-WT-UTR em células TPC-1 quando co-transfectado com pré-miR-886-3p ou pré-miR-NC, p 0,05. figuras meio e direita showluciferase actividade de pEZX-Mut-UTR-01 e pEZX-Mut-UTR-02 em células TPC-1 quando co-transfectado com pré-miR-886-3p ou pré-miR-NC, respectivamente. Todas as medições de luciferase foram feitas em triplicado e as leituras foram realizadas às 24 horas pós-transfecção.
miR-886-3p regula ciclo celular e a proliferação, e a formação de esferóides e migração
Como encontramos miR-886-3p regula os genes envolvidos na replicação do DNA e nas vias de adesão focal, estávamos interessados na determinação do papel de miR-886-3p no ciclo celular e proliferação celular, bem como, a formação de esferóides e migração. Em primeiro lugar, determinou-se a expressão basal de miR-886-3p em quatro bem caracterizada e autenticado linhas celulares de cancro da tiróide e verificou que FTC-133 e TPC-1 tinham mais alto e mais baixo nível de expressão de miR-886-3p, respectivamente (Figura 7A ). Utilizou-se essas linhas de células para analisar o efeito de miR-886-3p sobre a proliferação celular. A sobre-expressão de 886-3p miR-proliferação celular significativamente inibida por 79% em células de FTC-133 a 144 horas (p 0,001) e 77% de células TPC-1 a 120 horas (p 0,001), em comparação com pré-miR- NC (Figura 7B).
a) expressão da linha de base de miR-886-3p em quatro linhas de cancro da tiróide. B) Efeito da superexpressão de miR-886-3p sobre a proliferação de células de câncer de tireóide. Pré-miR-886-3p inibiu significativamente a proliferação de células de câncer de tireóide. As barras de erro representam o erro padrão da média. * P≤0.001.
Dado o profundo efeito da superexpressão de miR-886-3p sobre a proliferação celular, que queríamos para explorar próxima do mecanismo de inibição de crescimento miR-886-3p mediada. Nós, assim, realizada ensaios de citometria de fluxo e anexina V para determinar o efeito de miR-886-3p na progressão do ciclo celular e apoptose, respectivamente. A sobre-expressão de miR-886-3p aumentou significativamente o número de células em fase S (12-16%), enquanto que a diminuição do número de células em G
0 /L
1 (11-22%) (p 0,001 ). Nós, no entanto, não encontrou qualquer aumento significativo no número de células em apoptose com e sem sobre-expressão de miR-886-3p. Estes dados indicam que miR-886-3p regula ciclo celular e proliferação consistente com a nossa via de miR-886-3p e alvo previsão analisa.
Porque via miR-886-3p e meta análises mostraram genes que regulam a adesão focal foram misexpressed, nós também determinado o efeito da superexpressão de miR-886-3p na formação esferóide linha de células de cancro da tiróide e migração celular. A linha celular de FTC-133 forma esferóides quando cultivadas em balões de cultura aderentes ultrabaixo no prazo de 72 horas. Coerente com o efeito de sobre-expressão de miR-886-3p em monocamada de células, observou-se um decréscimo no número e tamanho dos esferóides na linha celular de cancro da tiróide FTC-133, que foi mantida durante até 2 semanas em cultura (Figura 8). Além disso, a sobre-expressão de miR-886-3p diminuiu as estruturas ramo semelhante celulares múltiplos observados em células de controlo negativo. Nós próxima determinado o efeito da superexpressão de miR-886-3p na migração celular utilizando o ensaio de zero ferida. A sobre-expressão de miR-886-3p inibiu significativamente a migração do TPC-1 linha celular (p 0,001) (Figura 9)
Pré-miR-886-3p diminuiu o tamanho e número de esferóides no FTC. -133 linha celular. A) Imagem representativa de esferóides em cultura com superexpressão de miR-886-3p. B) Quantificação da diferença esferóide com sobre-expressão de miR-886-3p. A área total ocupada pelos esferóides dentro de uma imagem foi medida por que circunscreve o perímetro de cada esferóide, marcação toda a área, e calculando o número de pixels, utilizando o software ImageJ (Maryland, EUA). As experiências foram repetidas três vezes, e foram observados resultados semelhantes. (*** Indica p 0,001).
Pré-miR-886-3p diminuiu significativamente a migração de células em 22 horas (p 0,001). A) Imagem representativa de ensaio ferida no tempo 0 e 22 horas após o início. B) Quantificação da largura de fecho de feridas com a sobre-expressão de miR-886-3p. Seis locais diferentes foram visualizadas e fotografadas sob um microscópio de contraste de fase invertida (10 x de ampliação) em cada placa em diferentes pontos de tempo, e três placas foram utilizadas para cada grupo. A largura da ferida nos 10 × imagens foi medido utilizando um compasso de calibre padrão. As experiências foram repetidas três vezes, e foram observados resultados semelhantes. (*** Indica p 0,001).
Discussão
Neste estudo, foi realizada profiling miRNA de amostras de familiares e esporádicos papilar da tiróide tumor de câncer. Encontrámos quatro miARNs são diferencialmente expressos entre estes grupos, dois dos quais, o miR-886-3p e miR-20a, foram validadas a ser expresso diferencialmente por 3- e 4 vezes, respectivamente. Ambos os miRNAs foram reprimidos no câncer de tireóide papilar, em comparação com o tecido normal da tireóide por 3,5-4 vezes. via de expressão do gene de todo o genoma e predição alvo análises demonstraram genes envolvidos na replicação do DNA e nas vias de adesão focal foram alvo de miR-886-3p. Superexpressão de miR-886-3p em linhas celulares de cancro da tiróide significativamente inibiu a proliferação celular, o número eo tamanho de esferóides, e migração celular. Além disso, a sobre-expressão de miR-886-3p aumentou o número de células em fase S e diminuiu o número de células em G
0G
1 fase, sem qualquer efeito sobre a apoptose.
Não temos conhecimento de quaisquer outros estudos que compararam o perfil de miRNA de tumores associados a síndromes de cancro familiares com os seus homólogos que ocorrem esporadicamente. Tal análise fornece informações importantes sobre as vias genéticas que podem ser diferentes em tumores histologicamente semelhantes, os alvos importantes de alterações genéticas de predisposição, e, no caso de FNMTC, a base molecular. Embora a maioria dos investigadores têm sugerido que FNMTC é uma desordem hereditária distinta, argumentos contra esta incluir que, 1) o mesmo gene de susceptibilidade (s) e ou loci não foram observadas em vários estudos de ligação, 2) tumores da tiróide não malignas são comuns e, assim, uma diagnóstico de câncer de tireóide pode ser um efeito fundador ou descobertos incidentalmente, e 3) a expressividade é variável [2]. Por outro lado, vários estudos apoiar FNMTC como sendo uma síndrome hereditária distinta, pois, 1) várias famílias foram relatados para ter ocorrência de várias gerações de FNMTC, 2) há uma maior taxa de câncer de tireóide em homens e crianças dentro de pedigrees FNMTC, 3 ) existe uma idade mais adiantada da apresentação, e 4) não há homem-a-homem transmissão. Por último, estudos epidemiológicos demonstram que o risco de câncer de tireóide em um parente de primeiro grau de um paciente diagnosticado com câncer de tireóide é 5 vezes superior [28]. Dada esta controvérsia, partimos para determinar se os perfis de câncer de tireóide papilar familial e esporádica de expressão eram diferentes. Um grande número de miRNAs foram desregulada, tanto o câncer de tireóide papilar familial e esporádica em comparação com o tecido normal da tireóide. Foi realizada a caracterização miRNA em amostras de tumores de pacientes que foram pareados por idade, sexo e estágio do câncer TNM. Tal abordagem foi utilizada para minimizar os fatores de confusão que pode resultar em perfil de expressão miRNA diferente devido a diferentes extensão da doença, subtipos histológicos de tumor e status diferenciação de tumor [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Portanto, acreditamos que nosso projeto cuidadoso estudo e análise de fornecer factos que, pela primeira vez, suportam uma diferença molecular em câncer de tireóide papilar familial e esporádica.
Entre os miRNAs diferencialmente expressos entre o câncer de tireóide papilar familial e esporádica, dois miARNs foram validados para ser expresso diferencialmente por RT-PCR quantitativo. Tanto miR-20a (13q31.3) e miR-886-3p (5q31.2) não estão localizados em loci cromossómico previamente identificado como loci susceptibilidade por estudos de ligação em famílias com FNMTC. Dadas as pequenas distâncias de nucleotídeos de miRNAs, não é de estranhar que as alterações genéticas no cromossômica loci codificação de miR-20a e miR-886-3p podem ter sido perdidas nestes estudos, mesmo com o uso de matrizes SNP de alta resolução [13]. No futuro, a análise de sequência de linha germinal pode ser utilizado para determinar se estes genes de susceptibilidade miARNs são candidatos para FNMTC. Além disso, será importante para determinar em estudos futuros o mecanismo de regulação negativa miR-886-3p geral no câncer de tireóide é devido ao copiar número variação, inativação de mutações ou eliminação.
Estávamos interessados em estudar o papel de miR-886-3p na carcinogénese da tiróide, por diversas razões. Principalmente, a função de miR-886-3p é desconhecida, a localização cromossómica do gene de miR-886 em 5q31 é partilhada com a transformação β1 factor de crescimento, um regulador importante na carcinogénese epitelial, e o nível de expressão de miR-diferença entre 886-3p familiar e câncer de tireóide papilar esporádica foi grande, (3 vezes). Consistente com nossos achados, um estudo recente mostrou miR-886-3p foi regulada negativamente no cancro do pulmão de células escamosas em comparação com o tecido pulmonar normal, sugerindo um papel potencial supressor tumoral para este miRNA [5]. Utilizando duas linhas celulares de cancro da tiróide bem caracterizados com diferentes níveis de expressão de miR-866-3p basal, foi demonstrado que o miR-886-3p desempenha um papel crítico na proliferação celular e migração, e regula os genes envolvidos na replicação de ADN e de adesão focal vias. Foram selecionados
CDC6, um regulador potente da replicação de DNA e oncogênese [27], para posterior análise e descobriu que
CDC6
era um alvo direto de miR-886-3p. Embora nossos estudos funcionais foram feitas em linhas de cancro da tiróide, nossos dados sugerem que miR-886-3p é um importante regulador da biologia das células de tumor em carcinoma da tiróide [26].
A superexpressão de miR-886-3p causada dramática mudanças na expressão de genes que regulam a replicação do ADN e de adesão focal.