Abstract

quinase de adesão focal (FAK) é uma tirosina quinase citoplasmática que é elevada em uma variedade de cancros humanos. Enquanto FAK está implicada em diversos processos celulares que são perturbadas no cancro, incluindo a proliferação, a actina e a dinâmica de adesão, invasão e polarização, há apenas alguns informação limitada sobre o papel da FAK na sobrevivência de radiação. Nós avaliamos se FAK é um objectivo geral de sensibilização rádio, como foi sugerido por relatórios anteriores. Foi utilizado um sistema genético limpa, nos quais FAK foi suprimida a partir de células de carcinoma de células escamosas do mouse (SCC) (FAK – /-), e reconstituído com tipo selvagem FAK exógena (wt). Surpreendentemente, a ausência de FAK foi associado com o aumento da rádio-resistência em células SCC avançada. FAK re-expressão de p53 mediada inibida transcricional-regulação de p21, e um sub-conjunto de outros genes alvo p53 envolvidos na reparação do ADN, após o tratamento com radiação ionizante. Além disso, a depleção de p21 rádio-promovido sensibilização, o que implica que a inibição mediada por FAK por indução de p21 é responsável pela rádio-sensibilidade relativa de células SCC-FAK proficiente. O nosso trabalho acrescenta a um corpo crescente de evidências de que existe uma estreita relação funcional entre a integrina sinalização /FAK e da via p53 /p21, mas demonstra que o papel da FAK na sobrevivência após o estresse é dependente do contexto, pelo menos em células cancerosas. Sugerimos que deve haver cuidado ao considerar inibir FAK em combinação com radiação, pois isso pode nem sempre ser clinicamente vantajosa

Citation:. Graham K, Moran-Jones K, Sansom JO, Brunton VG, Moldura MC ( 2011) FAK Supressão Promove a indução mediada por p53 de p21, respostas DNA de danos e uma Rádio-Resistência em células cancerosas escamosas avançado. PLoS ONE 6 (12): e27806. doi: 10.1371 /journal.pone.0027806

Edição: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasil

Recebido: 27 de junho de 2011; Aceite: 25 de outubro de 2011; Publicação: 14 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Graham et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Cancer Research UK Grant Program (C157 /A9148). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a radioterapia é um dos pilares da terapia do câncer em múltiplos contextos de doença, mas o tratamento nem sempre é curativa. Uma grande quantidade de esforço é dirigido não só a melhorar a entrega de radioterapia por métodos espaciais e de dosimetria cada vez mais sofisticados, e também para identificar estratégias de combinação para melhorar as respostas de radiação. No que diz respeito do último radiação ionizante pode promover a activação do receptor e não receptoras tirosina quinases (TK), e modulação de influências citoprotectores, tais como o aumento da reparação de ADN, proliferação e apoptose reduzida [1], [2], [3] , [4], [5], [6], [7]. Uma vez que estas respostas contribuem para radio-resistência celular, o que, obviamente, pode limitar a eficácia da radioterapia no tratamento do câncer, a compreensão da contribuição de TKs pode fornecer novos alvos moleculares para o rádio-sensibilização, e, potencialmente, melhorar as respostas tumorais. Um exemplo é o receptor de Factor de Crescimento Epidérmico (EGFR), o qual é a corrente de TK mais extensivamente estudados no presente contexto. evidências pré-clínicas forte implica uma capacidade de inibição de EGFR para melhorar os efeitos anti-tumorais de radiação ionizante, e isso se traduziu em ambiente clínico com base em resultados de um ensaio de Fase III em câncer de cabeça e pescoço [8], [9]. Isto demonstra a importância de estratégias de intervenção robustos para determinar se determinado TKs contribuir para a rádio-sensibilidade celular, ou a radio-resistência.

Em contraste com a evidência emergente para o EGFR, o papel de outras TK, especialmente não- TKs receptor, é menos clara. Quinase de adesão focal (FAK) é localizado em locais de adesão da integrina, de onde transduz sinais para células que controlam as várias propriedades associadas a cancro, incluindo adesão e de actina dinâmica, migração, invasão, angiogénese, a protecção das células contra a morte celular induzida por suspensão ( às vezes chamado anoikis) e proliferação em 3-dimensões [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. FAK é frequentemente sobre-expressa em cancro humano [18], [19], [20], [21], e desempenha um papel na tumorigénese, tal como demonstrado em vários tipos de tecidos in

in vivo

[22], [23], [24], [25], [26], [27], [28]. Nós já mostrou que FAK eliminação inibe o desenvolvimento de câncer de pele do rato e progressão maligna, e que FAK eliminação promove a morte por apoptose de queratinócitos da pele normal na cultura [25]. Mais recentemente, temos também fez uso da K14-Cre-ER

T2 /f

lox

sistema rato -FAK para derivar células cancerosas espinocelular (CEC) de tumores quimicamente induzidos [29], [ ,,,0],30]. FAK exclusão provoca múltiplos defeitos, incluindo polarização e respostas para direcional pistas, tais como invasão quimiotática, bem como o crescimento prejudicada em 3 dimensões (embora o crescimento em 2-D de plástico não é afetada) e atraso no crescimento como xenoenxertos

in vivo prejudicada

[29], [30].

FAK funções pró-mediadas sobrevivência estão pensados ​​para desempenhar um papel importante na sobrevivência de células de cancro, e que isso provavelmente envolve a via p53 [31]. Além disso, o promotor de FAK contém elementos responsivos p53 e pode ser regulada negativamente pela DNA-prejuízos de uma maneira dependente de p53, enquanto que a expressão de FAK correlaciona-se com o mutante p53 no cancro da mama [32], [33], [34]. Há também

in vitro

e

in vivo

provas que demonstrem que FAK knock-down pode sensibilizar células à quimioterapia citotóxica [2], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39], [40], [41]. Em contraste, existem relativamente poucos estudos sobre o papel da FAK na sensibilidade à radiação. FAK fosforilação é induzida após a exposição a radiações ionizantes

in vitro

[42], embora isso só pode ter sido uma resposta ao estresse transiente como o papel da FAK não foi explorar. No entanto, existe um relatório que siRNA mediada FAK knock-down promove radio-sensibilização de células de cancro pancreático [43], embora o mecanismo subjacente não é clara. Além disso, a sobre-expressão de FAK em células HL-60 confere resistência marcada a uma variedade de estímulos apoptóticos, incluindo a radiação ionizante [44], toda sugerindo que a inibição da sinalização através da FAK é susceptível de promover a rádio-sensibilidade. Aqui nós usamos um sistema genético exclusão /reconstituição limpa para testar o papel da FAK em resposta a radiação de celular

in vitro

e

in vivo

, especificamente nas células SCC FAK com deficiência (e sua FAK-expressando homólogos), e começar a dissecar o mecanismo subjacente.

resultados

Nós derivados de células SCC de células cancerígenas escamosas quimicamente induzidos em ratos que expressaram um

floxed

forma de o exão de codificação de ligação de ATP de

FAK

sob o controlo de específicas de pele (K14)

Cre recombinase

fundido com o receptor de estrogénio [25]. Excisão de

floxed

–

FAK

em cima de um único tratamento com 4-hidroxi-tamoxifeno (4-OHT) resultou na completa deficiência de proteína FAK [29], [30] (ver também a fig. 1C e 2B), que poderia reverter por re-expressando peso FAK, o que nos permite estudar como as células cancerosas lidar com perturbação grave da via integrina /sinalização FAK. Para avaliar rádio-sensibilidade, um ensaio clonogénico de diluição limitante foi realizado comparando a FAK – /- com células wt FAK em doses crescentes de radiação até 10 Gy. Este revelou que a completa ausência da FAK nestas células foi associado com o aumento da rádio-resistência

In vitro

(Fig. 1A). A diferença estatisticamente significativa na fracção sobrevivente foi visto em doses de 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy e 10 Gy (valores de p de 0,0136, 0,0097, 0,0045 e 0,0036, respectivamente, analisados ​​pelo teste t não emparelhado do aluno, n = 9).

(a) populações subconfluentes de FAK – /- e wt FAK células foram tripsinizadas e diluídas em meio de crescimento para uma concentração final que iria permitir o crescimento de colónias únicas. 100 ul desta suspensão foi adicionado a cada poço de uma placa de 96 poços. Após incubação durante 6 horas para permitir a fixação das células, as placas foram irradiadas com 0, 2, 4, 6, 8 ou 10 Gy. As células foram analisadas em triplicado para cada dose de radiação. Após 7 dias, o número de colónias por placa foi contado e a fracção sobrevivente calculada. A representação gráfica mostrado representa a média ± SEM de três experiências separadas. Sobreviventes fracções em cada dose de radiação foram comparadas com células irradiadas com un pelo teste t não emparelhado de Student, n = 9. (B) 2 × 10

5 FAK – /- células e FAK wt foram injectados por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus do sexo feminino. Xenoenxertos foram autorizados a atingir cerca de 150 milímetros

3. Os animais foram então irradiados com 5 Gy toda irradiação de corpo ou irradiado simulado. Após 7 dias, os enxertos foram medidos e os murganhos foram sacrificados. Os volumes médios ± SEM de xenoenxerto antes da radiação (painéis superiores) e depois da radiação (painéis inferiores) são mostrados. A análise estatística dos simulada irradiadas versus volumes do irradiados aos 7 dias foi avaliada pelo teste t não emparelhado de Student, * indica P 0,05, n = 10. (C) Os extractos de proteína foram preparados a partir de xenoenxertos, separadas por SDS-PAGE, transferidos para nitrocelulose , e colocados a hibridar com anticorpos anti-β-actina (inferior) anti-FAK (superior) e. Uma amostra de cinco extratos distintos de cada grupo é mostrado. Um controlo positivo (extracto celular em peso FAK) foi adicionada à pista final da FAK – /-. As amostras de xenoenxerto

(A) FAK – /- e wt FAK células foram irradiados com 5 Gy em 70% de confluência e os lisados ​​preparados nos pontos de tempo indicados. A imunotransferência foi então realizada com anticorpo anti-p21 (painel superior), e anti-β-actina (painel inferior). (B) Os extractos de proteína foram preparados a partir subconfluentes FAK – e populações de células da FAK em peso, separadas por SDS-PAGE, transferidos para nitrocelulose, e colocados a hibridar com anti-FAK (painel superior), anti-p21 (painel do meio) e anti – /β-actina (painel inferior) anticorpos. (C) ARN foi extraído a partir de subconfluentes FAK – /- e as células de FAK em peso, a PCR e o produto analisado. carregamento de p-actina é também mostrada (painel inferior). (D) Os extractos de proteína foram preparados a partir de FAK – /- e as populações de células de FAK em peso no nível de confluência indicado. Immunoblotting foi então realizada com anti-p21 (painel superior) e anti-β-actina (painel inferior) anticorpos.

Nós também testamos se FAK influenciado radio-sensibilidade

in vivo

, comparando FAK – /- e xenoenxertos de FAK em peso SCC. 2 × 10

5 células foram injectadas subcutaneamente no flanco direito de ratinhos nus do sexo feminino e os animais foram ou irradiados com 5 Gy (na forma de irradiação de corpo inteiro) ou falsamente irradiadas, quando os xenoenxertos atingiu cerca de 150 mm

3. Esse tamanho foi selecionada como a FAK – /- tumores havia superado um atraso inicial no seu crescimento

in vivo

, e sua taxa de proliferação neste momento não diferiram significativamente dos seus homólogos FAK wt. Estudos anteriores demonstraram que a estirpe CD1 de ratos pelados poderia tolerar a dose corporal total 5 Gy durante 10-14 dias. Após 7 dias, os enxertos foram medidos e os animais foram sacrificados. os volumes de tumor foram calculados antes e depois de 5 Gy irradiação ou irradiação simulada, e analisados ​​pelo teste t desemparelhado do estudante. Observou-se uma redução estatisticamente significativa no volume do tumor nos xenoenxertos wt FAK irradiados em comparação com os controlos falsamente irradiadas (p = 0,0030, n = 10), mas este não foi replicado nas FAK – /- xenoenxertos (p = 0,3300, n = 10) (Fig. 1B). Extractos proteicos foram preparados a partir de 5 ratinhos em cada grupo e submetidas a transferência de Western para confirmar o nível de expressão de FAK FAK em – /- e wt FAK tumores (Fig. 1C). Os baixos níveis de FAK presente de FAK – /- material derivado de tumor é provável a partir da pequena quantidade de estroma ou infiltrado imunológico (Fig 1C.)

As células SCC usamos aqui expressas tipo selvagem p53 (confirmado. por sequenciação (não mostrada)), e identificou-se uma diferença dependente da FAK na indução do gene alvo da p53, p21, após a irradiação (Figura 2;. ver também mais tarde). Especificamente, a indução de p21 era evidente por 2 horas após o tratamento de FAK – /- células com 5 Gy de irradiação; Em contrapartida, p21 não foi induzida quando FAK estava presente (Fig. 2A). Curiosamente, níveis basais de proteína p21 e ARNm em populações sub-confluentes de ambas as FAK – /- células e FAK wt foram semelhantes (Figura 2B e 2C, respectivamente.), Enquanto os níveis de p21 foram elevados em ambas as linhas celulares com o aumento da confluência (Fig . 2D). Isso foi em consonância com o papel amplamente aceito para p21 na parada do ciclo celular induzida por contato (Fig. 2D), e demonstrou que um estímulo diferente foi capaz de aumentar os níveis de p21, independentemente do status de FAK. Para garantir a discrepância na indução de p21 após exposição a radiação ionizante, não foi relacionado a diferenças na densidade das células, houve o cuidado em todos os experimentos para assegurar que as células foram irradiadas a confluência comparável, normalmente 70%.

A FAK -dependence de regulação p21 foi reproduzida

in vivo

. Especificamente, os ratinhos nus foram injectados subcutaneamente com 2,5 × 10

5 FAK – /- células ou wt FAK, xenoenxertos foram deixados a estabelecer, e os animais foram então irradiados com 5 Gy de irradiação, quando os tumores atingiram aproximadamente 500 milímetros

3 em volume. Os ratinhos foram sacrificados nos tempos 0, 2 horas, 6 horas, e 24 horas após a irradiação (n = 3 por grupo) e os níveis de p21 foram avaliadas tanto por transferência de Western de lisados ​​de tumor e imuno-histoquímica (IHQ) de coloração de tecido embebido em parafina. Os FAK – /- xenoenxertos exibiram um aumento nos níveis de proteína p21 tão cedo quanto 2 horas após a irradiação (Fig 3A, painéis esquerdos.); os níveis de p21 apareceu máxima em torno deste tempo. O aumento da p21 também estava visível por IHC (Fig. 3A, painéis direitos). A média de positividade p21 (com base na pontuação de 20 campos) foi analisado através de todos os pontos de tempo e este demonstrou uma diferença significativa nos níveis de p21 nos tumores de irradiado

relação

animais irradiados-un (Kruskal-Wallis, p = 0,038, n = 3). Além disso, a comparação individual dos pontos de tempo separados ilustrado um aumento estatisticamente significativo na pontuação de p21 em comparação com os níveis de linha de base (teste de Mann Whitney, p = 0,0404, n = 3). Em contraste, os xenoenxertos wt FAK não demonstrou qualquer aumento consistente nos níveis de p21 em qualquer um dos pontos de tempo examinados. Western blotting de lisados ​​de FAK tumorais que expressam WT confirmou a presença de FAK, mas não houve nenhum aumento apreciável nos níveis de proteína p21 (Fig. 3B). Uma análise mais aprofundada de IHC (Fig. 3B, painéis à direita) confirmou que não houve aumento significativo na expressão de p21 em 2 horas (p = 0,6625), 6 horas (p = 0,6625), ou 24 horas (p = 0,3827) (Mann Whitney, . n = 3), quando comparados com os controles

(a) FAK – /- células SCC ou B) FAK peso células SCC (, foram injectados por via subcutânea no flanco direito de ratos nus femininos. Quando xenoenxertos atingiu cerca de 500 milímetros

3, os ratinhos foram irradiados com 5 Gy e sacrificados às 0, 2 horas, 6 horas, e 24 horas (n = 3 por grupo). Metade do xenoenxerto foi fixado em formalina, em seguida, embebidas em parafina e a outra metade foi congelado rapidamente em azoto líquido. Extractos proteicos foram preparados a partir de secções congeladas, separados por SDS-PAGE, transferidos para nitrocelulose, e colocados a hibridar com anti-FAK (painel superior blot), anti-p21 (painel blot meio), e anti-β-actina (painel inferior blot ). As seções embebidos em parafina foram coradas com p21 e as células p21-positivas visualizados por IHC (painéis da direita). Representativos imagens de campo claro de tecido manchado p21 a 0, 2 horas, 6 horas e 24 horas após a radiação são mostradas (barra de escala, 0,1 mm).

Foram extraídos RNA a partir de populações sub-confluentes de FAK – /- e as células de FAK wt em vários pontos de tempo a seguir a 5 Gy de irradiação, e qRT-PCR foi realizado utilizando os iniciadores para a p21 endógena. Houve um aumento bifásico em níveis de ARNm de p21, atingindo um máximo de 2 horas e 6 horas após a irradiação na FAK – /- células; O p21 contraste níveis de ARNm não foram induzidas na linha celular de FAK em peso após irradiação (Fig. 4A). ARN também foi extraído a partir de ambas as linhas de células de 2 horas depois de uma gama de doses de radiação (0, 2, 5, 10, 20, e 30 Gy) e analisados ​​por qRT-PCR. Descobrimos que os níveis de ARNm de p21 em FAK aumentou – /- SCC células de uma forma dependente da dose (intervalo de 2 Gy e 10 Gy); ainda mais o aumento da dose não resultou em mais aumento de ARNm de p21. O aumento dependente da dose na transcrição de p21 foi atenuada com a re-expressão de FAK em peso nas células SCC-FAK deficiente (Fig. 4B). Em experiências paralelas, verificou-se que o aumento dos níveis de estado estacionário da proteína p21 foram evidentes após irradiação a diferentes doses em FAK – /- células SCC, e que este foi atenuada quando a expressão de FAK foi restaurado (Fig. 4C, comparar os painéis esquerdo e direito) . Para complementar a deleção genética da FAK, foi também utilizado um inibidor de quinase de FAK (PF-562271; [45]) a uma dose de 0,5 um (o que é óptimo para a inibição da actividade da FAK quinase nestas células (não representado)) para 2 horas antes da irradiação, e lisados ​​de proteína coletados para immunoblotting a 0, 2, 4 e 6 horas após 5 Gy. os níveis de p21 foram visivelmente aumentada por 2 horas depois da radiação em 0,5 uM PF-562271 tratada FAK em peso de células quando comparada com células não tratadas (Fig 4D).

(A) ARN foi extraído a partir de subconfluentes FAK -. /- e FAK wt populações de células em vários pontos de tempo após 5 Gy de irradiação. análise de qRT-PCR foi então realizada em triplicado. vezes de aumento nos níveis de ARNm de p21 foi calculada usando o método de ddC (t) com β-actina como um controlo de carga. Representação gráfica de média ± SEM combinados de três experiências é demonstrada. (B) ARN foi extraído a partir de FAK sub-confluentes – /- e as populações de células de FAK em peso de 2 horas após 0, 2, 5, 10, 20 e 30 Gy de irradiação. O ADNc foi, em seguida, gerado e qRT-PCR para p21 realizada como descrito acima. (C) Os extractos de proteína foram preparados a partir de FAK – /- populações de células e a FAK wt 2,5 horas após a exposição a várias doses de radiação. Os extractos foram separados por SDS-PAGE, transferidos para nitrocelulose, e colocados a hibridar com anti-p21 (painéis superiores) e anti-β-actina (painéis inferiores). (D) As células wt FAK foram incubadas durante 2 horas quer com o inibidor de FAK PF-562271 a 0,5 uM, ou apenas 0,1% de DMSO, em seguida, irradiada com 5 Gy. Extractos proteicos foram preparados a 0, 2, 4, e 6 horas e imunotransferências sondadas com anti-p21 (painéis superiores), e anti-β-actina (painéis inferiores). imunotransfer�cias representativas de 0,1% DMSO (à esquerda) e 0,5 mM de drogas tratada (à direita) populações de células são mostrados.

Como esperado, os níveis de p21 no estado de equilíbrio nas células SCC foram pelo menos parcialmente dependente da p53, e p21 induzida por radiação nas células SCC foi inibida por knock-down de p53 utilizando siRNA (Fig. 5A-C). No entanto, também notar-se que a indução de p53 após a irradiação não foi particularmente forte e foi semelhante em ambos FAK – /- e wt FAK células SCC (Figura 5D.), Indicando que a presença de FAK foi levando a algum desacoplamento da indução de p53 e p21 , e sensibilidade à radiação nestas células cancerígenas. Densitometria foi realizado para quantificar as mudanças vezes nos níveis de p21 e p53 após a irradiação de células SCC FAK-proficientes e FAK deficiente (Figura S1). Estes resultados implicam que, substancialmente, aumento da transcrição e da expressão da proteína p21 ocorre na FAK – /- células após doses clinicamente relevantes das radiações ionizantes, e que esta resposta é atenuada pela presença da FAK. Assim, as funções de FAK nestas células cancerosas avançadas para reprimir a transcrição dependente de p53 de p21 após a irradiação. Este não é visivelmente ligado ao diferencial de indução de paragem do ciclo celular (Figura S3 (determinada como descrito nos Métodos S1)) ou a apoptose, o que é difícil de detectar após a irradiação das células de CEC como julgado pela falta de teor de ADN sub-G1 (não mostrado) . Isto é, apesar regulação diferencial de expressão do gene alvo PUMA p53 (Figura S4) que pode ser associada com apoptose

(A) FAK -. /- Células foram transfectadas com 100 nM de ARNsi (quer piscina ou p53 mexidos siARN) a 50% de confluência. Após 24 horas, os extractos de proteína foram preparados e imunotransferências sondadas com anticorpo anti-p53 (painel superior), anti-p21 (painel do meio) e anti-β-actina (painel inferior). (B) A densitometria comparando os níveis de p21 no FAK – /- tratados com extractos de proteína, quer uma piscina mexidos de siRNA ou ARNsi de p53 foi realizada. Os níveis de proteína p21 foram normalizados para a p-actina e os resultados apresentados são representativos de uma das três experiências separadas. (C) FAK – /- células em 50% de confluência foram transfectados com 100 nM de ARNsi ou 100 nM de p53 siRNA, incubou-se durante 24 horas, e depois irradiados com 5 Gy mexidos. Os lisados ​​foram recolhidos a pontos de tempo indicados e imunotransferências sondadas com anticorpo anti-p53 (painel superior), anti-p21 (painel do meio) e anti-β-actina (painel inferior). (D) Os extractos de proteína foram preparados a partir de FAK – /- e wt células FAK 2 horas após a exposição a várias doses de radiação (0-30 Gy). Os extractos foram separados por SDS-PAGE e imunoblots sondadas com anticorpo anti-p53 (painéis superiores) e anti-β-actina (painéis inferiores). A faixa da direita em cada gel contém extratos de proteína de FAK – /- células ou wt FAK expostos ao tratamento durante a noite com 0,1 M de actinomicina D.

trabalhos anteriores estabeleceu ligações claras entre FAK e p53, que promove sobrevivência após a sinalização induzida por stress (em células que carecem de p21),

através de ligação do domínio de FAK FERM para p53 no núcleo, facilitar a degradação de p53 e sobrevivência [46]. Portanto, imunoprecipitada a partir de lisados ​​de FAK FAK em peso SCC células antes e após 5 Gy de irradiação, e imunotransferidas para p53 e para Src (como um controlo positivo). Como esperado, Src foi ligada a FAK, e este foi inalterada pela irradiação (Figura S2A (determinada como descrito nos Métodos S1)). No entanto, descobrimos que a FAK não interagem com p53 (Fig. S2A). Os lisados ​​foram sondados para FAK, Src e p53 para assegurar a igualdade de carga (Fig. S2B). Nós também descobrimos que a p53 foi eficientemente translocado para o núcleo, em ambas as FAK – /-. As células e FAK wt após a irradiação (não mostrado)

Desde p21 tem sido associada com ambos resistência e sensibilidade a agentes danificadores do ADN, incluindo radiação ionizante, o próximo empobrecido p21 usando siRNA. Conseguimos cerca de 90% knock-down de p21 em células SCC (Fig. 6A e 6B). Clonogenicidade foi então avaliada a 0, 4, e 8 Gy e comparação feita entre populações de células transfectadas com ARNsi de p21, mexidos ou ARNsi de controlo de células populações que tinham sido transfectadas simulada. Encontrámos uma diferença significativa na fracção sobrevivente a 8 Gy (p = 0,0129) entre a siRNA- mexidos e células tratadas com ARNsi de p21, de modo a que a p21 rádio-promovido resistência nas células SCC (Fig. 5C). Há, portanto, uma forte ligação entre p21 induzida por radiação em células FAK deficiente (mas não em suas contrapartes expressando FAK) e a constatação de que a perda de FAK induz radio-resistência em que p21 tem um papel causal nas células SCC.

(a) FAK – /- SCC células foram transfectadas com 100 nM de siARN (uma piscina mexidos ou p21 siARN) a 50% de confluência. A seguir à incubação durante 24 horas, extractos de proteínas foram imunotransferidas e pesquisadas com anti-p21 (painel superior) e anti-β-actina (painel inferior). (B) A densitometria comparando os níveis de p21 no FAK – /- tratados com extractos de proteína, quer uma piscina mexidos de siRNA ou ARNsi de p21 foi realizada. Os níveis de proteína p21 foram normalizados para o nível de p-actina e os resultados apresentados são representativos de uma das três experiências separadas. (C) FAK – /- células foram falsamente transfectadas ou transfectadas com 100 nM de um pool siARN mexidos ou ARNsi de p21 em 50% de confluência. Após 24 horas, as populações de células foram tripsinizadas e diluídas em meio de crescimento para uma concentração final que iria permitir o crescimento de colónias únicas. 100 ul desta suspensão foi então adicionada a cada poço de uma placa de 96 poços. Após incubação durante 6 horas para permitir a fixação das células, as placas foram irradiadas com 0, 4, ou 8 Gy. As placas foram criadas em triplicado para cada dose de radiação. Após 7 dias o número de colónias por placa foi contado e a fracção sobrevivente calculada. O gráfico apresenta a média ± SEM de três experiências separadas. fracções sobreviventes de células tratadas p21 siRNA foram comparados com mexidos células tratadas siRNA em cada dose de radiação e significância estatística avaliada pelo teste t não emparelhado do aluno, * significa p 0,05, n = 9.

Finalmente , avaliou-se a deficiência de FAK afetados características mais gerais associadas a danos no DNA. Descobrimos que os níveis de mRNA de uma série de genes alvo p53, que estão envolvidos na reparação seguintes radiação ionizante, ou seja,

GADD45,

p53R2

e

ddb2

, e são conhecidos para ser sub-regulada por c-Myc [47], foram estimuladas in FAK – /- células SCC, mas consistentemente menos nas suas contrapartes expressando-FAK (Fig. 7). Isso foi particularmente verdadeiro para

ddb2

no ponto de tempo de 2 horas, para

GADD45

em momentos posteriores, e pela

p53R2

longo das 0-24 horas após a irradiação ( A Fig. 7A, B e C). Uma vez que mostrou que a FAK é necessária para c-Myc a sobre-regulação de jusante

Apc

deleção no intestino do rato [22], pode ser que a FAK prejudica a expressão induzida por radiação dos genes de manutenção da integridade do genoma em células SCC

via

repressão c-Myc-mediada. No entanto, notou-se que BRCA1 fornece um exemplo de um gene responsivo de DNA-danos que só é minimamente afectada pela perda de FAK; De facto, a expressão de BRCA1 é suprimida pela deficiência de FAK em momentos posteriores após irradiação (Fig. 7D). Assim, conclui-se que a transcrição induzida por radiação de um sub-conjunto de genes p53-sensível é modulada pela presença ou ausência de FAK, e assim não é simplesmente devido à disfunção geral p53.

O ARN foi extraído a partir de subconfluentes FAK – e populações de células da FAK em peso, em vários pontos de tempo após 5 Gy de irradiação – /. análise de qRT-PCR foi realizado utilizando os iniciadores dirigidos contra Ddb2 (A), GADD45 (B), p53R2 (C) e de BRCA1 (D), e estes foram todos normalizado para p-actina.

Como mencionado, não houve paragem do ciclo celular ou apoptose diferencial facilmente detectável que pode ser atribuído ao estado da FAK. Por isso, o próximo examinou fosforilação na serina 139 de histona γH2AX que ocorre em resposta à radiação [48] ionizante e é considerado como um substituto confiável de dupla reparação vertente pausa. A quantificação da percentagem de núcleos contendo 5 ou ≥5 focos γH2AX mostrou que ambas as FAK – /- e as populações de FAK wt tinham ≥5 γH2AX focos em praticamente todas as células 1 hora após a irradiação com 5 Gy (Fig 8A.). No entanto, os FAK – /- células começaram a limpar estes focos dentro de 6 horas e estas voltaram ao nível de base no prazo de 24 horas; Em contraste FAK re-expressão nas células da FAK wt causou uma focos taxa de depuração mais lenta (comparar 6 e 24 pontos de tempo de horas, (Fig 8A) Isto é consistente com a actividade de reparação de DNA mais eficiente nas FAK -.. /- células, e um ritmo mais lento do reparo quando FAK está presente imagens representativas de γH2AX imunofluorescência em FAK -. /- células (antes e 1 hora depois de 5 de irradiação Gy) são mostrados (Fig 8B). Nós também descobrimos que FAK -. /- células SCC apareceu ter geralmente níveis mais elevados de γH2AX focos sob condições de controlo (0 horas) do que as suas contrapartes expressando-FAK (imagens não mostrado), com mais de FAK – /- células que exibem vários focos e cerca de 10-15% visualizadas ≥5 focos (Fig. . 8A, 0 horas) o que sugere que as células SCC FAK deficientes podem ter uma maior instabilidade genética do que os seus homólogos wt FAK; pelo menos, parece que a FAK – /- células SCC têm geralmente melhorado as funções de reparação de ADN e isto correlaciona-se com rádio-resistência . Curiosamente, não foi encontrada nenhuma diferença na regulação dependente da FAK da fosforilação induzida por radiação de qualquer p53 ou Chk2 (Fig. S5)

() FAK A -. /- E as células de FAK wt foram plaqueadas a baixa densidade em lamelas de vidro, incubou-se durante 24 horas e irradiados com 5 Gy. Em vários pontos de tempo, as células foram fixadas, permeabilizadas, corados com anti-fosfo-γH2AX (serina 139) e visualizada utilizando microscopia confocal. O número de focos por núcleo ( 5 focos ou ≥5 focos) foi documentada em pelo menos 100 células. Os resultados apresentados são representativos de uma das duas experiências separadas. (B) Imagens representativas demonstram un irradiado e irradiado FAK – /- células em 1 hora após 5 Gy são mostrados, verde – fosfo-γH2AX e azul – DAPI (barra de escala, 20 mm), a seta na parte superior da caixa à direita mostra a um núcleo com 5. focos e flecha quebrado na caixa do lado direito inferior apontando para um núcleo com ≥ 5 focos

Discussão

Nós aqui mostram que, em contraste com a relatório anterior, em que a FAK knock-down sensibilizados células de cancro pancreático à radiação [43], FAK deleção (e um inibidor de FAK quinase) ionizante pode suprimir a indução de sinalização induzida por radiação, mediada por p53 de p21, e este é ligado à radio- resistência em células SCC avançada. Achamos que é importante registrar que o papel da FAK em respostas celulares à radiação, e talvez pró-sobrevivência sinalização em geral ionizante, pode ser dependente do contexto, e que é preciso haver cuidado ao considerar combinações terapêuticas de inibidores de FAK e radioterapia, pois isso pode nem sempre ser clinicamente benéficas.

no trabalho aqui descrito, mostra-se que a exclusão de FAK (ou inibir a sua actividade de quinase) pode libertar constrangimentos locais de FAK na sinalização de p53 para a indução de vários genes alvo, ou seja, p21 e, pelo menos, um sub-conjunto de genes regulados por p53 envolvidos na reparação do ADN em células SCC. Além disso, a FAK – /- células SCC parecem ser mais eficientes na reparação após danos no ADN induzidos por radiação. No entanto, nestas células não encontramos qualquer efeito significativo da FAK eliminação na estabilidade da proteína p53 (seja em resposta a irradiação ou drogas DNA danificando), fosforilação p53 ou a capacidade de p53 em translocar para o núcleo, e não foi possível encontrar provas de um complexo FAK /p53 que tem sido relatado para operar em outros contextos. Assim, o nosso trabalho acrescenta a um corpo crescente de evidências de que não é funcional cross-talk entre as vias de sinalização FAK e p53, mas demonstra que há outras maneiras em que isso pode ocorrer. Apesar de não entender completamente o mecanismo, descobrimos que nas células SCC do que se possa excluir FAK por recombinação genética, as funções de FAK para suprimir as funções de reparo do DNA induzidos por radiação de p53 bloqueando a indução de p21, e que isso está ligado