Abstract

Migração e invasão de células malignas são pré-requisitos para a progressão e metástase do câncer. A família Bcl-2 de proteínas consiste em cerca de 25 membros e tem sido extensivamente estudado no contexto da apoptose. Apesar do facto de as pequenas moléculas de direccionamento proteínas Bcl-2 já entraram em ensaios clínicos, muito poucos estudos investigaram o papel de proteínas Bcl-2 anti-apoptóticos lado morte celular no contexto de metástases. O objetivo deste estudo foi o de dissecar um papel potencial dos anti-apoptóticos Bcl-2 proteínas MCL-1, Bcl-2 e Bcl-x

L sobre migração e invasão de células de câncer colorretal, independentemente da sua função de controle de morte celular. Foram utilizados ensaios de migração e invasão, bem como três culturas celulares tridimensionais para analisar linhas celulares de cancro colorrectal (HT29, SW480 e) após siRNA knockdown mediada ou sobre-expressão de Mcl-1, Bcl-2 ou Bcl-x

L. Observamos nem indução da morte celular espontâneo nem a proliferação diminuída de células sem Mcl-1, Bcl-2 ou Bcl-x

L. Em contraste, knockdown de Mcl-1 levou a um aumento da proliferação. Surpreendentemente, nós demonstram uma profunda disfunção de ambas, a migração e a invasão, as células de cancro colorectal após Mcl-1, Bcl-2 ou Bcl-x

G knockdown. Este fenótipo foi completamente revista em células que sobre-expressam Mcl-1, Bcl-2 ou Bcl-x

L. Foi observado o efeito mais pronunciado entre as proteínas investigados para Bcl-2. Os dados apresentados indicam um papel crucial de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L para a migração e a invasão de células de cancro colorrectal independentes dos seus efeitos anti-apoptóticos conhecidos. Assim, nosso estudo ilustra novos mecanismos antitumorais da proteína Bcl-2 visando

Citation:. Koehler BC, Scherr A-L, Lorenz S, Urbanik T, Kautz N, Elssner C, et al. (2013) Além da morte celular – antiapoptóticas proteínas Bcl-2 regular a migração e invasão de células de câncer colorretal

In Vitro

. PLoS ONE 8 (10): e76446. doi: 10.1371 /journal.pone.0076446

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 14 de junho de 2013; Aceito: 23 de agosto de 2013; Publicação: 03 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Koehler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma Pós-Doutorado-Fellowship concedido a BCK pela Faculdade de Medicina da Universidade de Heidelberg, Alemanha (https://www.medizinische-fakultaet-hd.uni-heidelberg.de) e subsídios para HSB da Fundação alemã de Pesquisa (Deutsche Forschungsgemeinschaft, https://www.dfg.de/, DFG SCHU 1443 /4-1) e da Merck Serono GmbH (Darmstadt, Alemanha). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Henning Schulze-Bergkamen recebeu bolsas de pesquisa, bem como o reembolso das despesas de viagem de conferências e honorários da Merck GmbH Serono. Nenhum dos autores está relacionado a Merck Serono por emprego, consultoria, patentes e produtos em desenvolvimento ou comercializar produtos. Nenhum produto da Merck Serono foi utilizado ou investigados no manuscrito. Merck Serono GmbH não estava envolvido nos experimentos ou preparação do manuscrito. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

carcinoma colorectal (CRC) Introdução

é a segunda neoplasia maligna mais comum em mulheres eo terceiro em homens em todo o mundo com uma incidência crescente. Além disso, CRC é a quarta causa comum de morte por câncer. Mesmo que os avanços no desenvolvimento de medicamentos e cirurgia levou a um aumento da sobrevida geral, o prognóstico de pacientes com CCR metastático (estágio IV UICC) ainda é limitada [1], [2]. Metastasation é uma das principais causas de morte em doentes com cancro e envolve um processo de passos múltiplos da enorme complexidade. Apesar de nossa compreensão crescente das vias subjacentes, muitos aspectos da metástase continuam por resolver [3], [4].

A célula B linfoma-2 (Bcl-2) família de proteínas é composto por cerca de 25 membros e tem sido extensivamente estudadas no que diz respeito à sinalização da apoptose. O delicado equilíbrio de proteínas Bcl-2 governa o destino de células na superfície mitocondrial. Os pró-apoptóticos Bcl-2 (i.e. proteínas Bax e Bak) são ligados pelos seus parentes anti-apoptóticas (ou seja, Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L). No caso de uma mudança desse equilíbrio para a morte, os pró-apoptóticos proteínas Bcl-2 são liberados pelos seus homólogos anti-apoptóticos. Uma vez que os pró-apoptóticos proteínas Bcl-2 são libertados, as mitocôndrias são ativados e morte celular ocorre [5]. Além disso, uma contribuição de proteínas anti-apoptóticas e a necrose autofagia foi mostrado [6], [7]. Em autofagia, anti-apoptóticos Bcl-2 proteínas agem sequestrando proteínas proautophagic como Beclin1 [8], [9].

Os antiapoptóticas proteínas Bcl-2 são amplamente sobre-expresso em cancros humanos, incluindo CRC. Por exemplo, um aumento da expressão de Bcl-x

L, e de Mcl-1 tem sido demonstrado para os CRCs e correlaciona-se com um mau diferenciação, maior estágio do tumor e o prognóstico pobre dos pacientes [10] – [12]. Em contrapartida, outro estudo apresenta dados que correlacionem a alta expressão de Bcl-2 com boa evolução clínica de pacientes com CRC [13]. Estes relatórios contraditórios apontar para funções não redundantes de proteínas Bcl-2 anti-apoptóticos e explicar a necessidade de uma investigação mais profunda do compromisso e da relevância destas proteínas no CRC.

Há evidências crescentes para um papel das proteínas anti-apoptóticos além da regulamentação morte celular. Por exemplo, Mcl-1 e as suas variantes de splicing foram mostrados para interagir com a cadeia respiratória e do metabolismo oxidativo [14]. Bcl-x

L, e Bcl-2 tem sido associada com a sinalização envolvidos em espécies reactivas de oxigénio (ROS) A produção de [15], [16]. Os efeitos das proteínas Bcl-2 na proliferação ainda devem ser esclarecidas. Há alguma evidência de efeitos antiproliferativos de Bcl-2, Bcl-x

L, e de Mcl-1 no ambiente fisiológico [17]. Neste caso, um benefício de sobrevivência de células menos propensas a apoptose é mantida, pelo menos, em parte, à custa de proliferação. No entanto, é importante para resolver a questão, se os efeitos reguladores de proteínas Bcl-2 sobre ciclo celular e morte celular são fenómenos independentes. Até agora, apenas pouco se conhece sobre um compromisso potencial da antiapoptóticas proteínas Bcl-2 sobre a migração e invasão das células cancerosas. Bcl-x

G tem mostrado estar envolvidas em cancro da mama e metastasation migração CRC, mas o papel do bcl-2 e de Mcl-1 a ​​disseminação do tumor permanece sem solução [18], [19]. Em nosso estudo teve como objetivo investigar a indução de morte celular, proliferação, migração e invasão das células CRC após eliminação de Bcl-2, Bcl-x

L ou Mcl-1 expressão. Importante, um knockdown de proteínas Bcl-2 anti-apoptóticos inibida directamente a migração e a invasão de células de CRC independentes da indução da morte celular ou efeitos sobre a proliferação. Em resumo, nosso estudo proporciona novos insights sobre os efeitos antitumorais da inibição da proteína Bcl-2 no cancro colorectal além de sinalização morte celular e regulação do ciclo celular.

Materiais e Métodos

Reagentes e linhas celulares

linhas celulares de CRC HT29, SW480, Caco2 e Colo205 foram adquiridos da ATCC. As células foram cultivadas numa atmosfera humidificada (37 ° C, 5% de CO

2) em meio RPMI + GlutaMAX ™ (Gibco, Karlsruhe, Alemanha) suplementado com FCS a 10% (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha), 1% de Pen /Strep (PAA Laboratories), 1% de HEPES (Gibco) e aminoácidos não essenciais a 1% (NEAA, Gibco). Todas as linhas celulares foram regularmente examinado para contaminações e não excedeu a passagem do 10. reagentes quimioterapêuticos 5-fluorouracil, oxaliplatina e irinotecano foram adquiridos de Sigma-Aldrich (Hamburgo, Alemanha).

Viabilidade Teste

As células foram semeadas em placas de 12 poços e 24 h após a sementeira ou transfectadas tratadas como indicado. A viabilidade celular foi determinada utilizando um (, 4 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 3- ensaio colorimétrico brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT) como descrito anteriormente [20]. A absorvância foi medida a 550 nm usando um leitor de microplacas (Infinito 200 Pro; Tecan, Männedorf, Suíça).

RNAi, plasmídeos e Transfecção

pequeno ARN interferente (siRNA) segmentação de Bcl-x

L, Bcl-2, Mcl-1 mRNA ou DNA de plasmídeo foi administrada no dia 1 após a sementeira das células em 12 ou placas de 6 cavidades, com uma confluência de 70-80% no tempo de transfecção. As seguintes sequências de siRNA foram aplicadas (MWG Biotech, Ebersberg, Alemanha): Bcl-x

G 5′-gcuuggauaaagaugcaaTT-3 ‘(sentido) e 5′-uugcaucuuaucccaagcAG-3′ (anti-sentido), Mcl-1 5’- aaguaucacagacguucucTT-3 ‘(sentido) e 5′-gagaacgucugugauacuuTT-3′ (anti-sentido), Bcl-2 5’-uaauaacgugccucaugaaTT-3 ‘(sentido) e 5′-uucaugaggcacguuauuaTT-3′ (anti-sentido). ARNsi contra GFP foi usado como controlo: 5’-GFP ggcuscguccaggagcgcaccTT-3 ‘(sentido) e 5′-ggugcgcuccuggacgguagccTT-3’ (anti-sentido). Letras minúsculas representam ribonucleotídeos e capitais desoxirribonucleótidos. As células foram transfectadas em OptiMEM® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) sem quaisquer suplementos usando RNAiMAX ™ (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante.

O plasmídeo de transfecção foi realizada utilizando Lipofectamine® LTX (Invitrogen) em OptiMEM® para SW480 células ou DNA peqFECT (Peqlab, Erlangen, Alemanha) em RPMI completo para células HT29 de acordo com o protocolo do fabricante. Foram utilizados os plasmídeos seguintes: Mcl-1 humana foi clonado num vector pEF4. Humano Bcl-2 e Bcl-x

L foram clonados num vector pcDNA3. pcDNA3-hBCL-2 foi um presente tipo de W. Roth (Instituto de Patologia, Heidelberg). pcDNA3-hBCL-x

L foi gentilmente cedido por M. Li-Weber e P. H. Krammer (German Cancer Research Center, Heidelberg, Alemanha). Correspondentes vectores vazios foram utilizados como controlos. Em paralelo, a eficiência de transfecção foi validado utilizando transfecção de GFP por citometria de fluxo. A eficiência de transfecção foi de pelo menos 70% em todas as experiências (dados não apresentados) e ainda avaliada por Western blotting 24, 48 e 72 h após a transfecção.

A detecção da proliferação e morte celular

Após tratamento , o sobrenadante foi transferido para tubos e as células foram cuidadosamente separadas utilizando Accutase ™ (PAA) e reunidas com o sobrenadante correspondente FACS. Após centrifugação, as células foram ressuspensas num tampão hipotónico contendo 0,1% (w /v) de citrato de sódio, 0,1% (v /v) de Triton X-100 e 50 ug /ml de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich). Após 1 h de incubação a 4 ° conteúdo de DNA total de C das células foi medido de acordo com o protocolo de Nicoletti

et al.

[21], utilizando um fluxo CANTO II citômetro (Becton Dickinson [BD], Franklin Lakes, NJ EUA). análise do ciclo celular foi realizada utilizando FACS Diva 6 (BD) e FlowJo 7.6.5. (Árvore Star Inc., Ashland, OR EUA). As células representam a fração subG1 foram descritos como apoptose.

Para especificar melhor indução de morte e proliferação celular, as células foram fixadas e permeabilizadas usando ciclo celular e kit Proliferação de citometria de fluxo (BD) de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, as células foram pulsadas durante 1 hora com 20 pM Bromodeoxiuridina (BrdU) para discriminar descansando a partir de células em proliferação. Daqui em diante, as células foram colhidas, fixadas, permeabilizadas e depois refixed seguido de coloração com anticorpos de fluorocromo acoplado contra PARP clivada (Asp214, acoplada a PE) como um indicador para a apoptose, BrdU (acoplado a PerCP-Cy ™ 5.5) para a proliferação e phosphorylated- H2AX (pS139, acoplado a Alexa Fluor® 647) por danos DNA, respectivamente. As células foram depois analisadas por citometria de fluxo.

A lise celular, SDS-PAGE e Western Blotting

As células foram semeadas em placas de 12 poços, cultivadas durante 24 h e tratou-se como indicado. A lise celular, SDS-PAGE e Western blot foram realizados. Os anticorpos seguintes foram usados ​​para imunodetecção: anti-Mcl-1 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha), anti-Bcl-x

(Cell Signaling, Boston, MA, EUA) G, anti-Bcl-2 (Abcam, Cambridge, UK), anti-αTubulin (Sigma), anti-PARP clivada (ASP214, Cell Signaling).

celular Contando

As células foram semeadas em placas de 6 poços e transfectadas com siRNA específico após 24 h. As células foram colhidas, ressuspensas e depois contadas usando uma câmara de Neubauer 24, 48 e 72 h após a transfecção. coloração azul Trypane foi usada para excluir as células mortas e fragmentadas durante o processo de contagem.

Ensaios de Migração

2 × 10

6 células foram semeadas em placas de 12 poços, cresceu a uma confluência de cerca de 70-80% e transfectadas como indicado. 24 h após a transfecção na monocamada de células foi riscado utilizando uma ponta de pipeta esterilizada. As células foram então lavadas com meio e as imagens foram imediatamente capturados usando um microscópio invertido (CKX41, Olympus Inc., Hamburgo, Alemanha) equipado com uma câmara digital a cores (XC30, Olympus Inc.). A localização exata da imagem dentro da monocamada foi marcado para identificar a mesma diferença ao longo do próximo 72 h. A anulação do diferencial foi medida a cada 24 h como se segue utilizando o software de imagem CellSense® (Olympus Inc.): distâncias Gap do zero entre um lado e o outro foram medidos em determinados intervalos ao longo da borda do zero (gerado a cada 200 um). A média das distâncias medidas, em seguida, foi calculada e comparada para a distância média da diferença no ponto de tempo de início da experiência [22].

Invasão Ensaio

Biocoat Matrigel ™ Invasão Chambers (tamanho de poro de 8 micra, BD) foram utilizados para estudar a invasão de células SW480. câmaras de invasão de Matrigel ™ foram hidratadas em FCS RPMI isento numa atmosfera humidificada, durante 2 h. Daqui por diante, câmaras de invasão foram transferidos em poços de placas complementares (BD) contendo 750 ul de meio RPMI suplementado com FCS a 10%. FCS serve como um quimioatractor para as células invasivas. As células foram semeadas em placas de 12 poços e transfectaram-se como descrito. 24 h após a transfecção as células foram colhidas utilizando Accutase ™ (PAA), reunidas e contadas. 3 × 10

5 células foram então ressuspensas em 500 ul de FCS RPMI livre e transferido para a parte superior da câmara de invasão. Após 72 h, a superfície superior da câmara de invasão foi esfregado para remover as células não-invasoras, utilizando um cotonete de algodão com ponta. células invadidas sobre a superfície inferior do inserto foram fixadas com 80% de EtOH durante 30 minutos, seguido por coloração dos núcleos utilizando Hoechst 33342 (Invitrogen) durante 15 min. Inserções foram em seguida lavadas em PBS. Cinco fotos de cada inserção foram tomadas e o número de células invadidas foi contado pelo olho nu.

Cultura celular 3D

Nós usamos Alvetex® andaimes feitos de um material inerte, altamente poroso e transfronteiriça ligada andaime poliestireno, seccionado em uma membrana de espessura de 200 um para executar adequadas três experiências de cultura de células dimensionais. Alvetex® Scaffolds foram usadas em formato de placa de 12 poços (Reinnervate AVP002, Sedgefield, Reino Unido), sob condições estéreis. Os andaimes foram incubadas com EtOH estéril filtrada (80%) durante 5 min como um pré-tratamento, lavou-se duas vezes com meio e deixada em meio. As células transfectadas foram colhidas e utilizando Accutase ™ tal como descrito, contadas e ressuspensas em RPMI completo. 1 × 10

6 células foram então semeadas em cima do disco inserção num volume total de 200 ul de meio. 3 h após a semeadura, andaimes foram inundadas delicadamente de baixo para cima até que a cobertura completa foi alcançada. O meio foi trocado a cada 48 h.

Seccionamento e imunohistoquímica do 3D-andaimes

Depois de 72 h, andaimes foram lavadas duas vezes em PBS, cortado em fatias e imediatamente transferido em Cryomolds® contendo meio de montagem outubro (Serviços de Ciência, Munique, Alemanha) e, gradualmente, congelados na fase gasosa de azoto líquido. Após 24 h a -80 ° C, foram os andaimes criosseccionada (Cryostat, Thermo) e montada em lâminas de HistoBond®. Seções (9 mm de espessura) foram fixadas em PFA 4% e corados com hematoxilina e eosina para estudos morfológicos, contagem total de células e medição da profundidade de invasão. Além disso, foi realizada utilizando immunhistochemistry sistema de detecção Novolink Polímero (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante após PFA-fixação e de recuperação de calor induzida epitopo (HIER) em tampão citrato (pH 6). Os anticorpos contra Ki67 (Abcam), e Bcl-x

L (Cell Signaling) foram utilizados e as lâminas foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos. As imagens foram capturadas usando um microscópio invertido. As imagens foram analisadas usando software CellSense® e ImageJ.

Análise Estatística

Os dados obtidos na invasão e 3D-andaimes experimentos foram analisados ​​utilizando o teste t de Student (pareado, frente e verso) com base na distribuição normal de dados. Para Ensaios de Migração, a relação entre gapclosure como resposta, e tempo e tratamento como variáveis ​​explicativas foi investigada por uma análise de variância (ANOVA). A análise da interacção entre o tempo e o tratamento não foi um objectivo do presente estudo e que não foi incluída no modelo de variância. SPSS 20 estatísticas (IBM, NY EUA) foi utilizado o software para todos análises estatísticas. Um valor de P 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-xL Expressão em linhas celulares de cancro colorrectal humano

a fim de investigar a expressão dos anti-apoptóticos Bcl-2 proteínas Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L em linhas celulares de CRC humanos, foram medidos os níveis de proteína em quatro linhas celulares de cancro colorrectal. CaCo2, Colo205, HT29 e SW480 células são amplamente utilizados e bem caracterizada [23], [24]. células Caco2 são conhecidas por serem fracamente tumorigénico em ratinhos. células SW480 e Colo205 são localmente invasivos em modelos de tumores ortotópicos. células HT29 metástases no fígado e pulmões quando injectados no tecido subcutâneo [24]. Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

G expressão foi detectada em linhas celulares de CRC (Fig. 1A). células Caco2 apresentaram quantidades consideráveis ​​de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L, com o mais alto nível de expressão de Bcl-2. células Colo205 que teve uma diminuição da quantidade de Bcl-x

L. células SW480 tinha uma quantidade aproximadamente igual de todas as proteínas Bcl-2. células HT29 mostrou uma expressão dominante da proteína Bcl-2 e um baixo nível de Bcl-x

L. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que o padrão de expressão das proteínas anti-apoptóticas variaram nas linhas celulares de CRC utilizados no nosso estudo. Não houve correlação entre a tumorigenicidade de uma linha de células e um determinado padrão de expressão (Fig. 1A). Decidimos concentrar em células SW480 e HT29 para mais experiências com Bcl-2 knockdown, porque ambas as linhas celulares compartilham a capacidade de invadir e forma metástases em modelos de ratos. Analisa

(A) Western blot do cancro colo-rectal linhas celulares de CaCo2, Colo205, SW480 e HT29. os níveis basais de expressão de Bcl-x

L, Mcl-1 e Bcl-2. Tubulin serviu como controle de carga. As células são dispostas com o aumento da tumorigenicidade da esquerda para a direita. Aqui, a tumorigenicidade indica a capacidade de uma linha de células de metástases em ratinhos. A menor tumorigenicidade significa o crescimento do tumor local, falta de invasão; a maior tumorigenicidade indica a formação de metástases distantes órgão (fígado e /ou do pulmão). analisa (B) Western Blot de HT29 (esquerda) e SW480 (à direita) após células mediada siRNA knockdown de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

G 24, 48 e 72 h após a transfecção. Tubulin serviu como controle de carga. As transferências de Western apresentados são representativos de três experiências independentes.

Knockdown de antiapoptóticas proteínas Bcl-2 não induz apoptose espontânea, mas sensibiliza células CRC à quimioterapia

Em primeiro lugar, determinou o efeito da siRNA alvejando específica Bcl-2, Bcl-x

L ou Mcl-1 ao longo de um período de tempo de 72 h em HT29 e células SW480. Aqui, a regulação negativa de proteínas anti-apoptóticas foi eficiente durante pelo menos 72 h, como observado por análise de Western blot (Fig. 1 B). A fim de analisar o impacto de uma regulação negativa da proteína Bcl-2, Bcl-x

L ou Mcl-1 sobre a viabilidade das células MTT foi realizado Ensaios de 48 h após a transfecção. Os resultados indicam não haver efeitos de diminuição dos níveis de proteína anti-apoptóticos Bcl-2 sobre a viabilidade das células em células HT29 e SW480 (Fig. 2 A).

(A) Ensaio de MTT-de SW480 e células HT29 após knockdown de Mcl- 1, Bcl-2 e Bcl-x

L. (B) as análises de citometria de fluxo e depois knockdown de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L em HT29 (esquerda) e células SW480 (direita) transferências de Western para a clivagem de PARP correspondente 48 h. (C) análise de citometria de fluxo de HT29 (esquerda) e células SW480 (à direita) para pH2AX 48 h após o knockdown de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L. 24 h de tratamento Estaurosporina (1? M) serviram como um controlo positivo para a indução da morte celular. (D) para a análise de citometria de fluxo de DNA-fragmentação de células HT29 após knockdown de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L seguido por 48 horas de tratamento com 30 uM de oxaliplatina e 0,2% de DMSO como veículo. A citometria de fluxo foi realizada análise em triplicado. As barras representam SD ± média. Os ensaios são representativos de pelo menos três experiências independentes. (Oxa = oxaliplatina).

Em segundo lugar, nós investigamos se a indução de morte celular espontâneo ocorreu em células HT29 e SW480 transfectadas. Portanto, as células foram analisadas para clivado poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) 48 h após a transfecção por citometria de fluxo, assim como por transferência de Western. Desde PARP é alvo de activado Caspase 3 sua clivagem indica uma execução eficiente da apoptose [25]. Nós não detectar um aumento na clivada (cl.) Níveis de PARP, posteriores a Mcl-1 knockdown (Fig. 2 B). Para Bcl-2 e Bcl-x

L knockdown, detectamos um aumento muito ligeiro em cl. níveis de PARP por FACS, mas não podia detectar uma quantidade razoável de proteína clivada em transferências de Western (Fig. 2 B). Além disso, temos verificado por danos DNA como uma marca da morte celular. Portanto, coradas células 48 h após a transfecção com o anticorpo acoplado fluorocromo segmentação histona H2AX fosforilada [26]. A fosforilação da H2AX ocorre em resposta ao DNA rupturas de filamentos duplos. Não houve uma quantidade considerável de H2AX fosforilada detectável em células transfectadas e os controlos (Fig. 2 C). A estaurosporina (STS) tratamento de células HT29 e SW480 serviu como um controlo positivo para a indução da morte celular (Fig. 2 B e C).

Em terceiro lugar, o nosso objectivo de investigar o potencial anti-apoptótica de proteínas Bcl-2 para knockdown sensibilizar células HT29 a quimioterápicos clinicamente relevantes e comumente usados. Para o 5-FU e Irinotecano não houve efeitos significativos sensibilizantes de siRNA knockdown mediada de proteínas anti-apoptóticas, como avaliado por análise FACS de fragmentação do ADN (dados não mostrados). Em flagrante contraste, observou-se uma sensibilização profunda e altamente significativa para a oxaliplatina após knockdown das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2, Bcl-x

L, e de Mcl-1 (Fig. 2D).

Tomados em conjunto, estes resultados indicam que um knockdown da Bcl-2, Bcl-x

L ou Mcl-1 não conduzem à morte celular espontânea e foi aparentemente bem compensado em células de CRC. Entre os quimioterápicos aplicados no tratamento CRC, apenas o efeito de oxaliplatina foi marcadamente aumentada por knockdown de proteínas anti-apoptóticos.

Knockdown de antiapoptóticas proteínas Bcl-2 não exerce efeitos antiproliferativos sobre células CRC

Depois de exclusão da indução da morte celular espontânea após a Bcl-2, Bcl-x

L ou Mcl-1 knockdown nós próxima investigou a proliferação de células de CRC. Uma elevada proporção de células HT29 não tratados (38,6%) foi avaliada por proliferação como a incorporação de BrdU (fig. 3 A e B). A proporção de células em proliferação não era significativamente diferente depois de Bcl-2 e Bcl-x

G knockdown (siBcl-2:37,3%; siBcl-X

G: 37,4%). Em contraste, knockdown de Mcl-1 levou a um aumento significativo na incorporação de BrdU, em comparação com os controlos (47,5 vs 38,6%, p 0,05, Figura 3 A e B.). Para SW480 células, observou-se um nível basal inferior de proliferação (21,1% de células positivas para BrdU). Os resultados para as células transfectadas com ARNsi contra Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

G estavam de acordo com os obtidos para as células HT29. Novamente, só que Mcl-1 knockdown levou a um aumento significativo de positividade BrdU, enquanto Bcl-2 e Bcl-x

L knockdown não mostraram efeitos significativos (Mcl-1:25,6% vs. 21,1%, p 0,05, Figura 3 C).. Para validar ainda mais nossos resultados sobre a proliferação após siRNA transfecção, seguimos número total de células de células SW480 ao longo do tempo. Os resultados ficaram em linha com as experiências BrdU: Apenas exclusão de Mcl-1 levou a um aumento da contagem de células totais, enquanto que nenhuma alteração significativa foi observada para Bcl-2 e Bcl-x

L eliminação (Fig 3 D). . Tomados em conjunto, os nossos dados indicam que não há nenhum efeito significativo de um knockdown da Bcl-2 e Bcl-x

L na proliferação. Por outro lado, a falta de Mcl-1 conduz a um aumento da proliferação apontador em funções específicas de Mcl-1, neste contexto.

SW480 e células HT29 foram transfectadas com ARNsi contra Mcl-1, Bcl-2 e Bcl- x

L. 24 h após a transfecção, as células foram pulsadas com 20 uM de BrdU e preparadas para citometria de fluxo. (A) o fluxo inicial representativas citometria de dados com células HT29 para positividade BrdU após coloração com anticorpo anti-BrdU ligado a PerCP-Cy5.5 fluoróforo. (B) As análises de citometria de fluxo para a incorporação de BrdU nas células HT29 e SW480 (C). (D) A contagem total de células de células SW480 após knockdown de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L. As células foram semeadas em placas de 6 cavidades, colhidas e contadas 24, 48 e 72 h após a transfecção. Os valores são expressos em média ± SD. Os ensaios foram feitas em triplicado (citometria de fluxo) e sextuplicates (contagem de células). Os ensaios são representativos de pelo menos três experiências independentes. * P . 0,05

Knockdown de anti-apoptótica Bcl-2 Proteínas Migração Massively danifica de células CRC

Em seguida, teve como objetivo investigar os efeitos de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

G supressão sobre a migração de células de CRC. A fim de visualizar a migração celular, foi realizada ensaios de raspar em monocamadas de células HT29 e SW480 transfectadas. distância de folga foi medida a cada 24 h após knockdown de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L seguido por cálculo de anulação do diferencial. encerramento Gap foi significativamente retardado em células HT29 e SW480 após knockdown de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L (valores de p para HT29: siMcl-1: 0,001; siBcl-2: 0001; siBcl-x

L: = 0,002 P-valores para SW480: siMcl-1:. = 0,0011; siBcl-2:. = 0,0005; siBcl-x

L: = 0,004) (Fig. 4 B e C, esquerda). Em células HT29 e SW480, foi observado o efeito mais notável após knockdown de Bcl-2. Aqui, a distância de migração foi diminuída para 56% em SW480 e 36% em HT29 após 72 horas em comparação com controlos (Figura 4 A;. A Fig. 4 B e C, esquerda). Tomados em conjunto, demonstram que os efeitos negativos de uma Mcl-1, Bcl-x

L, e Bcl-2 sobre knockdown CRC migração independente da indução da morte celular e efeitos antiproliferativos.

SW480 e células HT29 foram transfectadas com ARNsi contra Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L e cultivadas como uma monocamada. distância de folga foi medida a cada 200 | iM ao longo da borda do fechamento do gap e hiato calculada 24, 48 e 72 h após a transfecção. (A) imagens representativas capturados após knockdown de Bcl-2 em células HT29 (barra de escala indicam ampliação para todos os painéis). cinética (B) Gap fechamento de células HT29 após knockdown de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L (esquerda) e correspondentes Western blot (direita). cinética (C) Gap fechamento de células SW480 após knockdown de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L (esquerda) e correspondentes Western blot (direita). Os ensaios são representativos de pelo menos três experiências independentes. Os valores são expressos como média ± DP. (p-valores para HT29: siMcl-1: 0,001; siBcl-2: 0,001; siBcl-x

L:. = 0,002 p-valores para SW480: siMcl-1: = 0,0011; siBcl -2: = 0,0005; siBcl-x

L:. = 0,004)

A superexpressão de anti-apoptótica Bcl-2 Proteínas Acelera migração de células CRC

além disso, testou-se a expressão aumentada de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L em HT29 e células SW480 influências potencialmente migração e reverte o fenótipo das experiências knockdown. Mais uma vez, foram realizadas ensaios de raspar e células utilizadas transfectadas com plasmídeos de proteínas Bcl-2 de expressão correspondentes. Surpreendentemente, observou-se uma migração significativamente acelerada de células SW480 que sobre-expressam Bcl-x

L, e Bcl-2 (P 0,001, Figura 5 B, esquerda.). Células com superexpressão Bcl-2 quase duplicou distância migrada após 72 h (999 mm vs. 526 mm nos controles, Fig. 5 A). Para Mcl-1 sobre-expressando células SW480 observou-se uma, mas significativo aumento na migração inferior (p . 0,01, figura 5 B, esquerda). Estas observações também foram feitos para as células HT29 com a sobre-expressão de Mcl-1, Bcl-2 ou Bcl-x

L (dados não apresentados). Além disso, não houve aumento da proliferação detectável em células que sobre-expressam Mcl-1, Bcl-2 ou Bcl-x

L (dados não apresentados). Em resumo, que mostra que anti-apoptóticos Bcl-2 proteínas são capazes de desencadear a migração de células de CRC.

células SW480 foram transfectadas com plasmídeos expressando Mcl-1 humana, Bcl-2 ou Bcl-x

L, e crescido como uma monocamada. Lacunas foram gerados e fechamento do gap medida como descrito. (A) imagens representativas para células SW480 com superexpressão Bcl-2 (barra de escala indica ampliação para todos os painéis). (B) Gap cinética de encerramento de células SW480 que sobre-expressam Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

G (à esquerda) e transferências de Western correspondente (direita). Os ensaios são representativos de pelo menos três experiências independentes. Os valores são expressos como média ± DP. p-valores: MCL-1: = 0,0006; Bcl-2: = 0,0002; Bcl-x

L:. 0,0001

Knockdown de antiapoptóticas proteínas Bcl-2 Regular invasão das células CRC

Para investigar mais efeitos reguladores de Mcl-1 , Bcl-x

L, e invasão de Bcl-2 em processos relevantes para a metástase de CRC, que também avaliada de células de CRC após a manipulação de proteínas Bcl-2. As células com excluída Bcl-x

L mostraram significativamente prejudicada propriedades invasivas em ensaios de invasão câmara de Boyden em comparação a zombar células transfectadas (70% em comparação aos controles, p 0,05; A Fig. 6 A e B). Mais surpreendentemente, um knockdown de Bcl-2 revogada quase completamente a capacidade das células para invadir SW480 (38% em comparação com os controlos, p 0,001). Além disso, Mcl-1 knockdown também causou uma diminuição profunda invasão de (37% em comparação com os controlos, p 0,001; Fig. 6 A e B). Estas observações sublinham o papel de anti-apoptóticos Bcl-2 proteínas para a migração e a invasão de células de CRC e identificar um papel proeminente de Bcl-2 no âmbito da capacidade de invasão.

SW480 células foram semeadas em placas de 6 cavidades e foram transfectadas, como descrito. 24 × 10

5 células foram semeadas na câmara superior de um Transwell. 48 h após a sementeira, os núcleos na superfície inferior foram visualizadas por coloração de Hoechst. (A) imagens representativas da superfície de inserção inferior após coloração Hoechst (barra de escala indica ampliação para todos os painéis). (B) Cinco campos de visão por pastilha foram contados. N = 5 por grupo. Os valores são expressos como média ± DP. Os ensaios são representativos de pelo menos três experiências independentes. ** P 0,01.