Abstract

Fundo

PI3K /alterações Akt estão associados com resposta incompleta à quimioradioterapia no cancro do colo do útero humano. Este estudo foi realizado para testar a presença de mutações na via de PI3K e para avaliar os efeitos de inibidores de AKT na captação de glicose e a viabilidade celular.

Experimental Design by

A análise mutacional de DNA a partir de biópsias de tumores pré-tratamento 140 e 8 linhas celulares de cancro cervical humano foi realizada. Células C33A (

PIK3CAR88Q

e

PTENR233

*) foram tratados com concentrações crescentes de dois inibidores de AKT alostéricos (SC-66 e MK-2206) com ou sem o análogo glucose de 2-desoxiglucose (2 -DG). A viabilidade celular e o estado de activação de Akt /mTOR foram determinados em resposta ao tratamento. captação de glicose foi avaliada por incubação com

18F-fluorodeoxyglucose (FDG). A migração celular foi avaliada por ensaio de zero.

Resultados

Activar

PIK3CA

(E545K, E542K) e foram identificados inativantes

PTEN

(R233 *) mutações no cancro do colo do útero humano. AKT eficazmente inibida SC-66, e substratos de mTOR mTOR em células C33A. SC-66 inibiu a absorção de glucose através do fornecimento reduzido de GLUT1 e Glut4 para a membrana celular. tratamento SC-66 (1 ng /ml-56%) e MK-2206 (30? M-49%) diminuiu a viabilidade celular por meio de um mecanismo não apoptótico. Diminuições na viabilidade celular foram melhoradas quando os inibidores da AKT foram combinadas com 2-DG. O ensaio zero mostrou uma redução substancial na migração celular em cima do SC-66 tratamento.

Conclusões

O espectro mutacional da via PI3K /AKT no cancro do colo do útero é complexa. inibidores de AKT efetivamente bloquear mTORC1 /2, diminuir a absorção de glicose, glicólise, e diminuir a viabilidade das células

in vitro

. Estes resultados sugerem que os inibidores de AKT pode melhorar a resposta à quimioradioterapia no cancro do colo do útero

Citation:. Rashmi R, DeSelm C, Helms C, Bowcock A, Rogers BE, Rader J, et al. Inibidores (2014) AKT promover a morte celular no cancro do colo do útero através da ruptura de mTOR Sinalização e Glucose Captação. PLoS ONE 9 (4): e92948. doi: 10.1371 /journal.pone.0092948

editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de Agosto de 2013; Aceito: 27 de fevereiro de 2014; Publicação: 04 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Rashmi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por subvenções do NIH (US NIH 5K12HD00145910) para Julie K. Schwarz, MD, PhD. CD foi apoiado pelo Medical Research Student Grant (# RMS113) da Sociedade Radiológica da América do Norte (Julie K. Schwarz orientador). O Siteman Cancer Center é suportado pelo NCI Cancer Support Center Grant # P30 CA91842. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a nível mundial, o cancro do colo do útero é o terceiro tipo de câncer feminino mais comum, e ocupa o quarto lugar em termos de mortalidade [1]. chemoradiation concorrente (irradiação pélvica com a administração concomitante de quimioterapia com cisplatina) é o padrão de cuidados para pacientes com câncer de colo uterino localmente avançado. Temos demonstrado anteriormente que os resultados de pós-terapêutica [

18F] fluoro-desoxi-glucose positrões tomografia de emissão (FDG-PET) são preditivos de progressão-livre e sobrevida global resultados após chemoradiation [2] – [4 ]. Presentemente não existem opções de tratamento eficazes disponíveis para os pacientes cujos tumores não respondem ao chemoradiation tradicional.

Recentemente, identificamos PI3K /AKT alterações da via em tumores de pacientes com pós-terapia positiva FDG-PET. Observamos também elevada expressão p-AKT em amostras de biópsia pré-tratamento, e os pacientes cujos tumores expressaram níveis elevados de p-AKT tinha diminuído os resultados de sobrevivência e aumento da doença metastática após quimioradioterapia padrão [5]. As alterações genéticas que conduzem a activação da AKT /via PI3K /mTOR está associada com resistência ao tratamento de tumores sólidos variedade de [6]. Vários inibidores de PI3K /AKT foram avaliadas em ensaios clínicos para os cancros da mama e outros com respostas positivas em pacientes com alterações de PI3K /AKT [7]. Há relatos que sugerem que os cancros com

PIK3CA

mutações são mais sensíveis à AKT ou PI3K /inibidores de mTOR [8], [9].

Nossa hipótese é que os inibidores da PI3K /AKT vai melhorar a resposta a chemoradiation em tumores cervicais com alterações da via PI3K /AKT. Para testar a presença de mutações na via de PI3K /AKT, foram analisados ​​140 de pré-tratamento biópsias de tumores do colo do útero e 8 linhas celulares de cancro cervical humano [10]. Nós, então, selecionou o C33A linha de células de câncer de colo do útero, que sofre mutação para ambos

PIK3CA

e

PTEN

(

PIK3CA

R88Q,

PTEN

R233 *) e expressa a níveis elevados de p-AKT no início do estudo, para avaliar a resposta a dois inibidores de AKT alostéricos, SC-66 e MK-2206.

Materiais e Métodos

os pacientes

a população do estudo incluiu 140 pacientes prospectivamente inscritos em estudos bancários tumor no momento do diagnóstico de câncer cervical (março de 1998 a julho de 2011). Aprovação do Office Protection institucional Pesquisa em Seres Humanos foi obtida neste estudo, e todos os pacientes assinaram o consentimento informado. O seguimento clínico, incluindo imagens FDG-PET foi realizada para cada paciente de acordo com as diretrizes institucionais, como descrito anteriormente [3]. Na época do último acompanhamento, 76 pacientes tiveram nenhuma evidência da doença, e 8 pacientes estavam vivos com a doença; 7 pacientes morreram devido a doença intercorrente; 2 pacientes morreram devido à toxicidade relacionada com o tratamento e 47 pacientes morreram devido ao câncer cervical. Mediano de acompanhamento de pacientes vivos no momento da última acompanhamento foi de 41 meses (intervalo de 4 a 161 meses).

A análise estatística

Sobrevivência e recorrência de tumor foram medidos a partir da conclusão do tratamento. O método de Kaplan-Meier (produto-limite) foi utilizada para obter estimativas de sobrevivência [11]. Testes da equivalência das estimativas de sobrevivência entre os grupos de pacientes foram realizados pelo teste de log-rank generalizada Wilcoxon. Statview software versão 5.0.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC) foi utilizado para a análise.

A análise mutacional usando MALDI-TOF

biópsias de tumores foram seccionados e avaliação de conteúdo de células tumorais como previamente descrito [5]. DNA do tumor foi preparado usando métodos padrão pela Universidade Washington de recolha de tecidos Núcleo Facility. Os ensaios para um subconjunto de 32 mutações oncogênicas selecionados (

AKT1

,

AKT2

,

PIK3CA

e

PTEN

) a partir de [10] foram redesenhados em três multiplexes de genotipagem, utilizando software de Ensaio Designer de Sequenom, versão 3.1.2.2. (Sequenom Inc, San Diego, CA). Os multiplexes foram projetados para usar a química Iplex. O sistema Sequenom MassARRAY (https://www.sequenom.com) emprega MALDI-TOF (Laser dessorção /ionização assistida por matriz – Time of Flight) espectrometria de massa para medir diferenças de massa seguintes adições de base única para iniciadores de extensão. picos espectrais correspondentes às massas esperados para cada iniciador estendido são transformadas em chamadas amostra genótipo. Usando o protocolo padrão Iplex, o núcleo Genotipagem da Universidade de Washington (St. Louis, MO, EUA) processada de 15 ng de ADN por amostra multiplex através do sistema MassARRAY. As áreas de pico representando adições de base normais e mutantes foram obtidos a partir do espectro de massa de cada amostra. Uma mutação foi considerada presente em uma amostra quando o pico mutante era responsável por 25% ou mais das áreas de pico combinadas, e ausente quando a área do pico mutante era inferior a 25% do total. Lista de mutações OncoMap que foram testadas em nossas multiplexes são OM_00970-AKT1-E17K, OM_00032-AKT2-S302G, OM_00033-AKT2-R371H, OM_00241-PIK3CA-R88Q, OM_00242-PIK3CA-N345K, OM_00243-PIK3CA-C420R, OM_00246A-PIK3CA -E545K, OM_00248-PIK3CA-H701P, OM_00249-PIK3CA-H1047L, OM_00250A-PIK3CA-H1047R, OM_00250B-PIK3CA-H1047R, OM_00251-PIK3CA-H1047Y, OM_01017-PIK3CA-E545A, OM_01018B-PIK3CA-N1068fs*4,OM_0102-PIK3CA-Y1021C,OM_00839-PTEN-R173C,OM_00840-PTEN-R173H,OM_00841-PTEN-R233*,OM_00842-PTEN-R335*, OM_01038-PTEN-K267fs * 9 OM_01039-PTEN-V317fs * 3, OM_01069-PTEN-K6fs * 4.

Cultura de células e reagentes

linhas celulares de cancro do colo do útero foram mantidas em meio IMDM (Vida Technologies, CA) com calor a 10% de FBS inactivado e incubou-se a 37 ° C em 5% de CO

2. SC-66 foi adquirido a Biovision (Milpitas, CA) e MK-2206 a partir de Selleck Chemicals (Houston, TX). 2-desoxi glicose, protease e inibidores de fosfatase cocktails foram adquiridos a Sigma (Saint Louis, MO). Todas as drogas para cultura de células foram dissolvidas em sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sigma). oligos siRNA contra

AKT1

,

AKT2

e

rictor

foram adquiridos de Sigma (Saint Louis, MO).

Western blot e isolamento de membrana

a fosforilação de AKT e AKT alvos a jusante de mTOR e com ou sem (6-10 ug /ml) e MK-2206 (0-2,5 M) foram determinados por western blotting com anticorpos primários contra fosforilado e 66-SC formulários totais de mTOR, p70s6k, 4E-BP1, S6, GSK3-beta, FOXO pAKT

Thr308, pAKT

Thr450 e pAKT

Ser473 (1:1000; Cell Signaling Technology, MA), formas totais de AKT, mTOR e 4-EBP1 (1:1000, Cell Signaling Technology, MA), formas totais de p70S6K e β-Actina HRP de Santa Cruz Biotechnology, CA e formas totais e de PRAS40 FOXO da Millipore (1:5000, Santa Cruz Biotechnology, CA). p-actina foi utilizada como controlo interno. As manchas foram sondadas com conjugado com HRP anti-coelho (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ou anti-rato IgG policlonal anticorpos secundários (Santa Cruz Biotechnology, CA) durante 1 h à TA. Para a detecção de Pierce Dura substrato (Pierce Biotechnology) foi utilizada de acordo com o protocolo do fabricante e expostas a filme de raios-X.

A viabilidade celular e coloração Anexina

Para as células C33A ensaio de viabilidade celular foram tratados com os inibidores de AKT alostérico SC-66 (0.0001 g /ml-5 ug /ml) e MK-2206 (125 nM-30 ^ M) com ou sem o análogo glucose de 2-desoxiglucose (2-DG) (5-20 mM) usando titulação da dose e intervalos de tempo. Para as experiências de ARNip, células C33A foram transfectadas transitoriamente e avaliadas para a expressão da proteína após 48 horas. A viabilidade celular foi testada utilizando azul de Alamar a partir de Life Technologies, de acordo com as instruções do fabricante. Anexina /7-AAD coloração foi realizada 24 horas após o tratamento, utilizando um kit de BD, Biociências seguindo as instruções do fabricante, e as células foram analisadas por citometria de fluxo.

Os ensaios de captação de FDG

O FDG ensaio de incorporação foi realizada como descrito anteriormente [5]. Resumidamente, as células foram semeadas e pré-tratados com o bloco (citocalasina B) durante 30 min seguido por inibidores de AKT durante um adicional de 30 min. Após isto,

18FDG foi adicionado ao meio isento de glicose durante 1 h. As células foram lavadas, colhidas e contadas num contador gama.

Imunofluorescência

Em uma lâmina de câmara (8 poços) 25000 células foram semeadas e tratadas com SC-1 66 ug /ml durante três h e fixo através de 4% p-formaldeído dos Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA) por 10 minutos. As lâminas foram então bloqueadas em soro de cabra normal a 5% (Jackson ImmumoResearch, West Grove, PA) durante 1 h, seguido por extensas lavagens com PBS. Em seguida, os anticorpos primários GLUT1 e Glut4 (Abcam, Cambridge, MA) foram adicionados, seguido por conjugado de anticorpo secundário com Alexa Fluor 488 (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). As lâminas foram finalmente montado usando Prolong ouro anti-fade (Life Technologies, Inc. Grand Island, NY).

ensaios metabólicos

ensaio de lactato foi realizada utilizando um kit de (Sigma, Saint Louis , MO) de acordo com as instruções do fabricante e utilizando meios de cultura recolhidos após desproteinização utilizando filtros de 10 kDa por coluna de centrifugação. Os ensaios de ATP e de NADP /NADPH foram realizadas utilizando os kits comercialmente disponíveis de fluorométricos (Abcam, Cambridge, MA) de acordo com as instruções do fabricante, utilizando lisados ​​de células.

Cicatrização de feridas ensaio

Um milhão de células C33A foram plaqueadas numa placa de cultura de tecidos de 35 mm, e cultivadas até à confluência. Dois arranhões paralelos foram feitas com uma ponta de pipeta de 200 uL por prato e a largura zero foi medido como sendo a linha de base [12]. A largura da ferida foi medida a um mínimo de seis pontos diferentes para cada ferida. SC-66 (1 e 2,5 ug /ml) e MK-2206 (2,5 e 5 uM) foram adicionadas durante 24 h. A largura dos riscos foi medida usando o software Qcapture Pro e visualizadas utilizando um Olympus × 70 microscópio. cicatrização de feridas em percentagem foi calculada dividindo a largura zero após a adição do fármaco pela largura controle menos 100%. Os resultados apresentados são a média ± SEM.

Resultados

caminho

PI3K /AKT /mTOR é ativo em linhas celulares de cancro do colo do útero

Um painel de linhas celulares de cancro do colo do útero humanos foi testada para o padrão de expressão e status de ativação de moléculas da via PI3K /AKT /mTOR. Os lisados ​​celulares foram preparados sem qualquer tratamento e western blots da linha de base foram realizadas. P70s6k, o marcador para a activação da via mTOR, foi fosforilada na maioria das linhas celulares excepto para HeLa, C41 e C33A onde foi identificada como sendo fracamente fosforilada (Fig. 1a). A fosforilação de 4E-BP1 e S6 foram encontrados a ser baixa na maioria das linhas celulares estudadas. Em SiHa e SW756, os níveis de formas não fosforiladas de mTOR expressão, p70S6K, 4E-BP1 e S6 foram baixos em comparação com as outras linhas celulares. Por outro lado, a fosforilação de mTOR verificou-se ser semelhante entre as linhas celulares (Fig. 1a). foram determinados a expressão da linha de base das formas fosforiladas de AKT, tais como Ser473, Thr308 e Thr450. C33A expressa todas as três formas de p-AKT. Para determinar o estado de reguladores a montante de AKT, tais como PI3K e PTEN, p-linha de base e os níveis de PI3K-PTEN P foram examinados. nível PTEN fosforilado foi semelhante entre as linhas celulares, excepto para C33A onde o nível de banda total de PTEN foi mínima. PI3K foi activado na maioria das linhas de células aqui estudada. SiHa exibiu muito baixa ativação PI3K (Fig. 1B). Todos estes resultados sugerem que as linhas celulares de cancro do colo do útero ter activado via mTOR em condições basais e grandes variações existia nos níveis de p-AKT.

(A-B) componentes da via mTOR e formas fosforiladas da Akt foram testados usando comercialmente disponíveis anticorpos em oito lisados ​​celulares de cancro do colo do útero preparada sem qualquer tratamento. (C)

PIK3CA

,

AKT

, e

PTEN

estado mutacional do gene de 8 linhas celulares de cancro do colo do útero humanos.

análise mutacional Sequenom de PIK3CA, PTEN e genes AKT no cancro do colo do útero

para testar a presença de mutações na via PI3K /AKT, realizou-se uma análise mutacional Sequenom para mutações oncogênicas em genes

PIK3CA

,

PTEN

e

AKT

. Nós não detectar qualquer

AKT1

ou

mutações Akt2

nas linhas celulares de cancro do colo do útero. C33A abrigava um R88Q

PIK3CA

mutação. R88Q é uma mutação ativadora encontrado no domínio ABD da subunidade p110α do

gene PIK3CA

. Este defeito está associada à ativação enzimática melhorada da actividade da proteína AKT e PI3K

in vitro

[13], [14]. Descobrimos que o E545K

PIK3CA

mutação estava presente em células CaSki (Fig. 1C) ME-180 e. O

PIK3CA

mutação E545K é uma mutação ativadora no domínio helicoidal da subunidade p110α de proteína PI3K. Esta mutação é conhecido para conferir maior actividade de cinase e para activar constitutivamente AKT [15]. Encontramos também uma R173C

PTEN

mutação genética em CaSki e uma

PTEN

mutação R233 * em células C33A (Fig. 1C). O

PTEN

mutação R173C está associada com a diminuição da atividade da fosfatase contra PIP

3 [16]. O

PTEN

mutação R233 * no exão 7 induz um codão de paragem prematuro no gene, o que explica a ausência de

PTEN

expressão da proteína em células C33A [17] (Fig. 1B).

Usando o ensaio Sequenom, nós então testados para mutações no

PIK3CA

,

AKT Comprar e

PTEN

genes em 140 biópsias pré-tratamento recolhidos no nosso banco de tumores. Nós não detectar qualquer mutação ensaiada na

gene AKT em nossa população de pacientes. Descobrimos que os tumores em 7 de 140 pacientes abrigava um

PIK3CA

mutação E545K e 1 de 140 teve um

PIK3CA

mutação E542K. Nós também descobrimos que um tumor abrigava um

PTEN

R233 * mutação. Os pacientes com mutações E545K e E542K em

PIK3CA

foram encontrados para exibir mau prognóstico e sobrevida livre de doença mais curto após quimioradioterapia padrão (irradiação pélvica e quimioterapia com cisplatina concomitante) (p = 0,05, Fig. 2).

curva de Kaplan Meier para a sobrevivência livre de progressão para os pacientes cervicais cancerosas com tipo selvagem PIK3CA contra tumores mutantes E545K ou E542K (p = 0,05).

inibidores de AKT SC-66 e MK-2206 induzem a morte de células não apoptóticas em células C33A mutante PIK3CA e PTEN

Usando células C33A como um modelo para a via PI3K /AKT mutante cancro cervical, determinou-se a sobrevivência de células de tumor era dependente da sinalização de Akt. Células C33A foram incubados com doses crescentes de SC-66 e MK-2206 e a viabilidade foi determinada após 24 e 48 horas. A viabilidade celular diminuiu a partir de 1 ug /ml de SC-66 após 24 e 48 horas, para 55% e 43%, respectivamente. A viabilidade a 5 ug /ml de SC-66 verificou-se ser de 15% após 24 h (Fig. 3a). Células C33A foram também sensíveis a outro inibidor AKT alostérico, MK-2206. A viabilidade celular foi encontrada para diminuir começando com a concentração de 15 uM (58%) e diminuindo a 2% em 48 h (Fig. 3B). Para confirmar que afeta sobre a viabilidade celular foram devido à inibição AKT ao invés de efeitos alvo fora de SC-66 e MK-2206, foram realizados experimentos de siRNA. Como mostrado na Figura 3C, a viabilidade das células C33A diminuiu para um nível semelhante, quando as células foram transfectadas com ARNsi resultantes no knockdown de

AKT1

,

AKT2

, e

rictor

(Fig . 3D).

células C33A

(a-B) foram semeadas em placas de 48 poços e tratadas com doses crescentes de SC-66 (0,0001-5 ug /ml) e MK-2206 (1.25-30 uM ) em triplicado para 24 e 48 horas. A viabilidade foi medida utilizando Azul de Alamar. viabilidade percentual foi calculada com base em controlos tratados com veículo. (C) Células C33A foram semeadas em 48 placas bem e transfectadas com oligos contra

AKT1

,

AKT2

e

rictor

e tratados com SC-66 (1 mg /ml) e MK-2206 (20