Abstract

A activação constitutiva do fator de transcrição fator-kB nuclear (NF-kB) está envolvido na tumorigênese e quimio-resistência. Como o regulador chave do NF-kB, IKKβ é um importante alvo terapêutico para vários cancros. Trichothecin (TCN) é um metabolito isolado a partir de um fungo endófito de planta herbácea

Maytenus hookeri Loes.

Neste estudo, avaliou-se a actividade anti-tumoral de TCN TCN e descobriram que inibe marcadamente o crescimento de células cancerosas com constitutivamente activada de NF-kB. TCN induz /G1 paragem do ciclo celular e apoptose G0 em células de cancro, a activação de proteínas pró-apoptóticas, incluindo caspase-3, -8 e PARP-1, e a diminuição da expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2, Bcl-XL, e survivina. Ensaio de actividade repórter e análise de expressão de genes alvo ilustrados que TCN funciona como um inibidor potente da via de sinalização de NF-kB. TCN inibe a fosforilação e a degradação de IκBα e bloqueia a translocação nuclear de p65, e, assim, inibe a expressão de genes alvo de NF-kB XIAP, ciclina D1, e Bcl-xL. Embora TCN não interfere diretamente com IKKβ quinase, que suprime a fosforilação de IKKβ. Superexpressão de IKKβ constitutivamente activado abortada TCN induzida apoptose de células cancerígenas, enquanto knockdown de IKKβ endógena com células cancerosas siRNA sensibilizados em relação a apoptose induzida por TCN. Além disso, TCN mostrou um efeito marcadamente fraco em células normais. Estes achados sugerem que TCN pode ser um candidato potencial terapêutico para o tratamento do cancro, tendo como alvo a sinalização de NF-kB

Citation:. Su J, Zhao P, Kong L, Li X, Yan J, Zeng Y, et al. (2013) Trichothecin Induz Morte Celular no NF-kB activada constitutivamente células cancerosas humanas através da inibição da IKKβ fosforilação. PLoS ONE 8 (8): e71333. doi: 10.1371 /journal.pone.0071333

editor: Linda Bendall, Westmead Millennium Institute, da Universidade de Sydney, Austrália |

Recebido: 11 de abril de 2013; Aceito: 27 de junho de 2013; Publicação: 01 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Su et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelos 100 talentos Programa da Academia chinesa de Ciências (Y. Li), o Programa da China (No. 2009CB522300) Desenvolvimento de Pesquisa básica do Estado Maior, a Fundação de Ciência Natural da China (No.81173076), eo Top Recrutado talento de Ciências e Tecnologia da província de Yunnan (2009CI120). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

fatores de transcrição NF-kB consistem em cinco subunidades homólogas: RelA (p65), RelB, CREL (Rel), NF-κB1 (p50 e seu p105 precursor) e NF-κB2 (p52 e seu p100 precursor) , que funcionam como vários homodímeros e heterodímeros [1], [2]. No canónica via de NF-kB, as células podem ser estimuladas por diferentes estímulos, incluindo as espécies de oxigénio reactivas, factor de necrose tumoral alfa, interleucina 1-beta, lipopolissacarídeos bacterianos, etc. Após a activação, a subunidade inibidora IκBα é fosforilada pela cinase IkB ( IKK) complexo, que é então ubiquitinadas e degradadas através da via do proteassoma, promovendo a translocação do complexo p65 /p50 para o núcleo e activar a expressão de genes a jusante [3], [4].

NF-kB sinalização desempenha um papel importante na regulação da inflamação, tumorigénese e desenvolvimento do cancro [5] – [7]. Em uma grande variedade de cancros, incluindo malignidades-hematog�icas (tais como a leucemia, linfoma e mieloma múltiplo), e tumores sólidos (por exemplo, pulmão, mama e pâncreas) -nf-kB é activado persistentemente [8], [9]. A activação de NF-kB regula-se a expressão de genes anti-apoptóticos que codificam para Bcl-xL, XIAP, cIAP1 e cIAP2, assim como genes proliferativas, tais como ciclina D1 e IL-6 [10] – [13]. atividade de NF-kB também está intimamente ligado à metástase do tumor e câncer quimio-resistência. activação de NF-kB induz a transcrição de genes envolvidos na angiogénese, um processo crucial na formação de tumores e metástase [14]. Além disso, os inibidores do NF-kB aumentar a sensibilidade de cancros a agentes quimioterapêuticos, tais como paclitaxol, TNF-α e EXPERIMENTAÇÃO [15] – [17]. Dada a relação entre a NF-kB e do cancro, o desenvolvimento de inibidores do NF-kB tem um grande potencial na supressão da proliferação de certos tipos de cancro, bem como melhorar as terapias de cancro existentes [18], [19].

Maytenus hookeri Loes.

tem sido usado como um remédio popular por um longo tempo no sudoeste da China por causa de seu anti-cancerígeno e anti-inflamatórios. Anteriormente, maitansina foi identificado pelo seu efeito anti-cancro por interferirem microtúbulos [20], [21]. O derivado de maitansina, DM1, tem sido utilizado em emtansine trastuzumab (T-DM1), uma nova droga desenvolvido para o tratamento de cancro da mama positivo para HER2 [22]. No entanto, os constituintes químicos responsáveis ​​pelas actividades anticancerígenos desta planta merecem estudos posteriores.

Trichothecin (TCN) é isolada a partir do fungo endófito de

Maytenus hookeri Loes

. Os relatórios anteriores de nosso e outros demonstraram que a TCN está envolvido com algumas actividades anti-tumorais, mas o perfil de anti-tumor ou mecanismos subjacentes a estas acções são falta [23] – [25]. No presente estudo, verificou-se que TCN inibe o crescimento de células cancerosas humanas por inibição da sinalização de NF-kB. Os nossos dados mostraram que a TCN suprime a activação de IKKβ suprimindo a sua fosforilação, inibe a expressão de genes alvo de NF-kB, e induz a paragem do ciclo celular e a apoptose de células de cancro. Como um novo inibidor da via NF-kB, TCN pode vir a ser um candidato de drogas potencialmente promissores no desenvolvimento de novas terapias de câncer.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares

linhas celulares de cancro humano, HepG2, A549, PANC-1 e HL-60, linha celular de rim embrionário humano HEK 293T, brônquica linha celular epitelial humana túbulo proximal linha de células epiteliais de rim humano HK-2 BEAS-2B e foram adquiridos a partir de ATCC. linha epiteliais do cólon humano celular (CCD-841-CON) foi gentilmente oferecida por Dr. Lin, Li, do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular, Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China) [26]. As células foram cultivadas em 5% de CO

2 a 37 ° C em meio RPMI-1640, meio MEM ou DMEM contendo 10% (v /v) de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT).

Reagentes

os anticorpos monoclonais para o P65 de NF-kB, a PARP-1, caspase-8, Bcl-xL, caspase-3, ciclina D1, Bcl-2, a survivina, fosfo-IKKβ (Ser177), e β-actina bem como anticorpos policlonais para IκBα, fosfo-IκBα (PS32 /pS36) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology-(Santa Cruz, CA). O anticorpo policlonal de XIAP foi obtido a partir de Proteintech (Chicago, IL). anticorpo monoclonal para fosfo-p65 de NF-kB e um anticorpo policlonal para o total IKKβ foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technologies (Boston, MA). NF-kB p65 plasmídeo repórter luciferase (PNF-kB-Luc) foi comprado de Beyotime Instituto de Biotecnologia (China). O plasmídeo pCMV-SPORT6 inserido com a sequência humana RelA dirigir a expressão de p65 foi obtido a partir de Thermo Scientific (Rockford, IL). Alexa Fluor 546 conjugado com anticorpo secundário, Lipofectamine 2000, Z’-Lyte ™ kit de ensaio da quinase e IKKβ proteína humana recombinante foram obtidos de Invitrogen-Life Technologies (Carlsbad, CA). Kit de ensaio de repórter de luciferase dupla foi obtido a partir de Promega (Madison, WI). Duplex siARN com dois resíduos de timidina (dTdT) na extremidade 3 ‘da sequência foram sintetizados em GenePharma (Xangai, China). Recombinante TNF-α humano foi adquirido a partir de Pepro Tech (Rocky Hill, NJ). A menos que indicado de outra forma, todos os outros reagentes foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Compostos

TCN e outros compostos testados foram extraídos a partir de

Trichothecium roseum

LZ93, um fungo endofítico isolado do

Maytenus hookeri Loes.

, como descrito anteriormente [24] (estruturas designadas na Figura 1A e a Figura S1A).

(a) estrutura química da trichothecin. efeitos (B) celular citotóxicos de trichothecin em concentrações sucessivas. Depois de 48 h de tratamento, a viabilidade celular foi determinada utilizando ensaios MTT. (C) Anexina V-FITC análise /PI da apoptose em células tratadas com TCN durante 24 h. (D) HL-60, HepG2, A549 e células PANC-1 foram tratados com TCN durante 24 h e os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot com anticorpos indicados. p-actina foram utilizados como controlos de carga. Cada coluna representa a média ± SD de triplicados em três experimentos independentes.

Ensaio de citotoxicidade e IC

50 Determinação

A viabilidade celular foi avaliada por ensaio MTT. As células foram tratadas com os compostos indicados a concentrações de 0,064, 0,32, 1,6, 8 e 40 ^ M em placas de 96 poços. Após 48 h, 0,1 mg de MTT foram adicionados a cada poço, para uma concentração final de 20%. As células foram então incubadas a 37 ° C durante 4 h e a absorvância foi medida a 595 nm por espectrofotometria. Os sub

50 valores IC foram determinados por análise de regressão não-linear utilizando o software GraphPad Prism (GraphPad, Inc., San Diego, CA).

Luciferase Reporter Assay

células HEK 293T foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos de pRL-TK (Promega, Madison, WI) pNF-kB-Luc e utilizando Lipofectamina 2000 durante 4 horas numa placa de 96 poços. As células foram então pré-incubadas com diferentes concentrações de compostos, durante 1 h, e posteriormente activadas com 25 ng /mL de TNF-α durante 18 h. actividades de luciferase foram medidas utilizando o kit Dual-Luciferase Reporter Assay.

Western Blotting

lisados ​​celulares totais foram preparado por lise directa em 2 × tampão de Laemmli (Tris-HCl 0,125, pH 6,8, 4% de SDS, 20% glicerol, 10% β-mercaptoetanol e 0,004% de azul de bromofenol). As amostras foram então fraccionados em gel de acrilamida a 12%, transferido para uma membrana de PVDF (Bio-Rad), e incubadas com anticorpos primários específicos, seguido de anticorpos secundários conjugados com peroxidase correspondentes. Proteínas de interesse foram visualizados por detecção quimioluminescente em um mini4000 ImageQuant LAS (GE Healthcare).

Imunofluorescência Coloração

Para o experimento p65 translocação, as células HepG2 foram cultivadas em lâminas de câmara durante 24 h e pré incubadas com TCN a 37 ° C durante 1 h, seguido de estimulação de TNF-α durante 20 min. Para a detecção de fosforilação IKKβ, as células foram pré-incubadas com TCN a 37 ° C durante 1 h seguida por estimulação de TNF-α durante 10 min. As células foram depois fixadas em solução salina de fosfato tamponada com 4% de paraformaldeído durante 20 min, e posteriormente permeabilizadas em salino tamponado com fosfato com 0,1% de Triton X-100. Para observar a localização da subunidade p65, as células foram incubadas com anticorpo anti-p65 e anticorpo secundário conjugado com FITC correspondente antes da coloração dos núcleos com DAPI. Para a detecção IKKβ fosforilação, as células foram incubadas com anticorpo anti-fosfo-IKKβ e anticorpo secundário Alexa Fluor 546 correspondente. As imagens foram posteriormente observadas utilizando um microscópio de fluorescência (Eclipse Ti, Nikon).

celular Apoptosis Assay

celular apoptose foi analisada utilizando o kit de anexina V-FITC /PI apoptose (BD Biosciences, Franklin Lakes , NJ) de acordo com os protocolos do fabricante. As células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1,2 x 10

6 células /poço. Após 24 horas de tratamento com o composto nas concentrações indicadas, as células foram recolhidas e em seguida lavada duas vezes com PBS frio, e em seguida ressuspensas num tampão de ligação contendo Anexina V-FITC e iodeto de propídeo (PI). Após incubação durante 15 min à temperatura ambiente no escuro, a intensidade de fluorescência foi medida usando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

Análise do Ciclo Celular

células HepG2 ( 5 × 10

5cells /poço em placas de 12 cavidades) foram incubadas com TCN para pontos indicados tempo (8, 16 e 24 h) e as concentrações (1,25, 2,5 e 5 | iM). As células foram recolhidas e lavadas duas vezes com PBS e foram fixadas com 70% de etanol durante a noite. As células fixadas foram lavadas com PBS e depois incubadas com 20 uL de RNase A (1 mg /mL) durante 30 minutos e coradas com uma solução de iodeto de propídio (PI) (50 ug /ml concentração final) no escuro durante 1 h. A intensidade da fluorescência foi analisada por citometria de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). As percentagens das células distribuídas em diferentes fases do ciclo celular foram determinadas usando FlowJo 7.6.1.

A superexpressão de IKKβ CA

A construção dirigir a expressão de um IKKβ constitutivamente activo (S177E, S181E) (IKKβ CA) foi obtido a partir de Addgene (Catálogo No.11105) [27]. As células HepG2 foram transf ectadas com os plasmídeos utilizando Lipofectamine 2000. Cerca de 12 h após a transfecção, as células foram tratadas com TCN durante mais 24 h.

RNA de interferência

As células HepG2 foram transf ectadas transitoriamente com um controlo scrambled siRNA (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ‘) e IKKβ-siARN (5′-GGUGGAAGAGGUGGUGAGCTT -3’) [28], respectivamente, a uma concentração de prato 150 pmol /60 mm utilizando Lipofectamine 2000. O composto testado resultante foi depois adicionada para as células transfectadas 48 h pós-transfecção.

IKKβ cinase ensaio de Actividade

o ensaio de cinase foi realizado com IKKβ kit Z’-Lyte ™ Kinase Assay seguindo os protocolos do fabricante. Em resumo, as proteínas recombinantes IKKβ humanos foram incubadas com a mistura reaccional de quinase com quantidades crescentes de TCN ou estaurosporina, um inibidor de quinase, durante 1 h. A reacção foi então parada com o reagente de paragem e a fluorescência foi detectada com excitação a 400 nm e emissão a 445 nm e 520 nm usando o leitor de placas Envision multimodo.

Resultados

TCN Inibe celular crescimento e induz a apoptose em NF-kB células cancerosas

Nós investigamos a atividade anticâncer de TCN por ensaio de viabilidade celular MTT em quatro linhas celulares de cancro que abrigam constitutivamente activado NF-kB constitutivamente activada [29] – [32]. Em todas as linhas celulares testadas, TCN exibiram inibição do crescimento evidente (Figura 1B). A IC

50 valores em HL-60, células HepG2, A549 e PANC-1 eram de 0,18, 0,82, 0,39, e 0,28 uM, respectivamente. Anexina V-FITC coloração /PI foi ainda analisada para a apoptose das células com a citometria de fluxo. Após o tratamento com 5 TCN uM durante 24 h, a apoptose celular em células HL-60, HepG2, A549 e células PANC-1 notavelmente elevadas, para 61,13%, 44,03%, 34,93% e 24,47%, respectivamente. Enquanto isso, a apoptose em linhas de células humanas normais BEAS-2B, HK-2 e CCD-841-con não foram afectados pelo tratamento TCN, mesmo na maior concentração de 5 ^ M, sugerindo TCN possui selectividade contra as células cancerosas (Figura 1C). A análise por Western blot demonstrou que também TCN induzida significativamente a activação de caspase-8 e caspase-3, bem como a clivagem de PARP-1 nas quatro linhas celulares de cancro. O nível de proteína Bcl-2, um regulador chave da via apoptótica intrínseca, também foi regulada negativamente por tratamento NPT. Além disso, o nível de survivina, uma proteína anti-apoptótica, diminuíram drasticamente em células tratadas TCN, especialmente em células HepG2 (Figura 1D).

TCN inibe a sinalização de NF-kB e induz a paragem do ciclo celular HL-60 e em G0 /G1

O efeito de NPT sobre a sinalização de NF-kB foi testado em células HEK 293T transitoriamente transfectadas com um repórter de NF-kB (pNF-kB-Luc) .A expressão do gene repórter foi claramente activadas por TNF -α, o qual foi eficazmente inibida por TCN (Figura 2A). Para verificar se TCN inibe a intrínseca do NF-kB em células cancerosas, estudou-se a expressão de genes alvo de NF-kB nos quatro NF-kB activado linhas celulares de cancro tratados com TCN. Os níveis de proteína de p65, XIAP, ciclina D1, e Bcl-xL eram claramente regulados negativamente em células tratadas TCN (Figura 2B). Desde Ciclina D1 é necessário para a progressão do ciclo /célula G1 S, nós investigamos o efeito dos NPT sobre a paragem do ciclo celular. As células HepG2 foram tratadas com 2,5 uM TCN. G0 /G1 parada do ciclo celular óbvio foi detectada tão cedo quanto 8h. No entanto, com prolongar do tratamento, foi observado crescimento de células de fase sub-G1, indicando apoptose celular induzida por TCN (Figura 2C).

células HEK 293T (A) foram transientemente transfectadas com pNF-κB- plasmídeos Luc, seguido de tratamento com TCN durante 1 h antes de ser estimuladas com 25 ng /mL de TNF-α durante 18 h. (B) Os lisados ​​tratados com fromcells TCN durante 24 h foram sujeitos a análise de Western blot com p65, XIAP, ciclina D1 e anticorpos Bcl-xL. As células HepG2 (C) foram tratadas com 2,5 uM para TCN 8, 16 e 24 h. As células foram colhidas e submetidas a análise do ciclo celular. A percentagem de células de diferentes fases do ciclo celular foi analisada por FlowJo. Experimentos foram realizados de forma independente em triplicado, os resultados são apresentados como médias e desvios-padrão. A significância estatística foi analisada por ANOVA one-way, ** p . 0,01

Além disso, investigamos os efeitos da trichothecolone, um derivado da TCN, no crescimento celular e da atividade de NF-kB. Trichothecolone é outro metabólito isolado do fungo endófito de

Maytenus hookeri Loes.

, Que compartilha o mesmo núcleo pai com TCN, com a notável exceção de um substituinte diferente na 4-OH [24]. Como TCN, trichothecolone também inibiu o crescimento celular e a actividade repórter de NF-kB (Figura S1), mas ambas as actividades são muito mais fraca, o que sugere que o substituinte em 4-OH desta classe de compostos é crítica para as suas actividades biológicas.

TCN Inibe a fosforilação e degradação de IκBα e Blocos p65 nuclear translocação

Nós checar o efeito do TCN sobre a translocação nuclear de p65, uma marca registrada da ativação da sinalização da NF-kB. tratamento TNF-α induzida a translocação de NF-kB do citoplasma para o núcleo, e TCN bloqueou significativamente o processo de translocação em células HepG2 (Figura 3A). A sobre-expressão de p65 marcadamente reverteu o efeito inibitório do TCN na transcrição do repórter de NF-kB (Figura 3B). Em seguida, testamos o efeito do TCN na fosforilação e degradação IκBα. TCN inibido o TNF-α induziu a fosforilação IκBα de uma maneira dose-dependente e significativamente bloqueada à degradação de IκBα. Mais pungente, descobrimos que TCN inibiu a fosforilação p65 em Ser536 (Figura 3C), o que contribui para a degradação de IκBα e a activação de NF-kB de sinalização [33], [34].

(A) HepG2 As células pré-tratadas com 2,5 uM TCN foram estimuladas com 25 ng /mL de TNF-α durante 20 min e processadas para a imunocoloração com anticorpo anti-p65. Núcleos de células foram coradas com DAPI (azul) e p65 foi visualizada por fluorescência verde. (B) As células HEK293T foram transfectadas transientemente com plasmidos de expressão de p65, seguido por pré-tratamento de 0,3 uM TCN e estimulação com 25 ng /mL de TNF-α PNF-kB-Luc e. actividade repórter foi então medida. células (C) pré-tratados com HepG2 TCN foram recolhidas após a estimulação com 25 ng /mL de TNF-α durante 10 min. Os lisados ​​celulares foram então analisadas por anticorpos blot utilizando ocidentais contra fosfo-IκBα, fosfo-p65 e IκBα. As experiências foram efectuadas de forma independente em triplicado e os resultados são apresentados como médias e desvios-padrão. A análise estatística foi tocar com o teste t de Student, * p . 0,05

TCN inibe a fosforilação da IKKβ induzida por TNF-α

Como IκBα e p65 são ambos substratos de IKKβ quinase, que é ativado por sofrer fosforilação (Ser 177 e Ser 181) e subsequentemente fosforila IκBα [35], [36], verificamos a fosforilação de IKKβ em TNF-a células HepG2 tratadas por imunofluorescência e western blot. Verificou-se que o nível de fosforiladas IKKβ diminuiu drasticamente após o tratamento TCN, com o nível total de proteína IKKβ inalterado (Figura 4A e B). Para determinar se TCN interfere com a actividade de quinase IKKβ directa, um ensaio de actividade de quinase foi realizado utilizando proteína recombinante humana purificada usando IKKβ estaurosporina, um potente inibidor da cinase, tal como o controlo positivo. O resultado mostrou que a TCN não afectou a actividade de cinase de IKKβ recombinante (Figura 4C). Estes dados demonstram que TCN inibe a sinalização de NF-kB através da supressão da activação da via IKKβ bloqueando a sua fosforilação.

(A) IKKβ fosforilação foi detectada por um anticorpo fosfo-IKKβ em células HepG2 estimuladas com 25 ng /mL de TNF- ct durante 10 min. As células foram fixadas, permeabilizadas, e examinadas por microscópio de fluorescência. (B) Análise de transferência de Western que mostra a inibição da fosforilação IKKβ em células tratadas com 2,5 uM TCN. As células foram recolhidas depois de estimuladas com 25 ng /mL de TNF-α durante 10 min. (C) IKKβ actividade de quinase foi analisada com IKKβ recombinante utilizando o kit de ensaio de quinase Z’-Lyte ™. A fluorescência foi detectada a 400 nm para os comprimentos de onda de excitação e 445 nm e 520 nm para os comprimentos de onda de emissão. Experimentos foram realizados de forma independente em triplicado e os resultados são apresentados como médias e desvios-padrão.

celular TCN cancerígenas induzida apoptose é mediado pela inibição da fosforilação IKKβ

morte celular induzida TCN foi investigada em células que sobre-expressam forma constitutivamente activa (CA) de IKKβ [27], [28]. Como mostrado na Figura 5A, a sobre-expressão de IKKβ CA em células HepG2 suficientemente activado sinalização de NF-kB em ensaio da actividade de luciferase. tratamento TCN antagonizado com TNF-α na activação de sinalização de NF-kB, ao passo que a transfecção com eficiência IKKβ CA reverteu o efeito inibidor do TCN. Consistentemente, a sobre-expressão de IKKβ CA abortado a apoptose celular induzida em TCN células HepG2 (Figura 5B). Enquanto isso, a análise de Western blot mostrou que a desactivação da caspase-3, a PARP-1 e a regulação positiva de survivina por IKKβ CA (Figura 5C).

células HEK 293T (A) foram transfectadas transitoriamente com IKKβ CA ou vector vazio de 12 h, em seguida, pré-tratados com 2,5 uM TCN e estimuladas com 25 ng /mL de TNF-α durante 18 h. As células submetidas a análise da actividade da luciferase. As células HepG2 (B) foram transientemente transfectadas com IKKβ CA ou vector vazio durante 12 h, e, em seguida, tratada com 2,5 uM TCN durante 24 h. As células submetidas à análise de apoptose. (C) As células HepG2 foram transf ectadas com IKKβ CA ou vector vazio durante 12 h, e, em seguida, tratada com 2,5 uM TCN durante 24 h. As células sujeitas a análise de Western blot para a expressão de proteínas indicadas. (D) As células HepG2 foram transf ectadas transitoriamente com um siRNA mexidos ou IKKβ siRNA durante 48 h, tratada com 2,5 uM TCN durante 24 horas e submetidas a análise da apoptose. As células HepG2 (E) transientemente transfectadas com ARNsi mexidos ou IKKβ siRNA foram tratadas com 2,5 uM TCN durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram recolhidos e sujeitos a análise de Western blot com os anticorpos indicados. As experiências foram efectuadas de forma independente em triplicado e os resultados são apresentados como médias e desvios-padrão. A análise estatística foi tocar com o teste t de Student, * p . 0,05

Em seguida, verificou o efeito do IKKβ knockdown sobre a actividade apoptótica de TCN. Em comparação com o tratamento apenas com TCN, knockdown de IKKβ com células HepG2 siARN sensibilizados a apoptose induzida por TCN, com a proporção de apoptose aumentou para 43,11% (18,17% em tratamento sozinho TCN) (Figura 5D). Como mostrado na Figura 5E, a expressão de IKKβ em HepG2 foi parcialmente reduzido pelo tratamento de IKKβ siARN. Consistente com o aumento da indução de apoptose de células, a regulação negativa das proteínas anti-apoptóticas (survivina, XIAP e Bcl-2) por TCN foi aumentada em células knockdown IKKβ, e a clivagem de caspase-3 foi também aumentado (Figura 5E) . Enquanto isso, a transfecção com um controlo scrambled siRNA não teve nenhum efeito na resposta de células HepG2 para tratamento TCN (Figura 5D, 5E).

Discussão

Dada a ligação entre NF-kB e cancro, o desenvolvimento de inibidores do NF-kB tem um grande potencial na supressão da proliferação de certos tipos de cancro, bem como melhorar as terapias de cancro existentes. Ao longo das últimas décadas, uma grande variedade de compostos naturais e sintéticos têm sido encontrados capaz de suprimir a sinalização de NF-kB, mas através de uma variedade de diferentes mecanismos. PS-341, um inibidor de proteassoma, tem sido um fármaco de primeira linha utilizados no tratamento de mieloma múltiplo para mais de uma década, que funciona por inibição da actividade intrínseca do NF-kB, bloqueando IκBα degradação [37]. Enquanto isso, Eriocalyxin B, uma ent-Kauranoid isolado a partir de

Isodon eriocalyx

, inibe a activação de NF-kB através da interferência com a ligação de ambas p65 e p50 ao elemento de resposta [38].

IKKβ desempenha um papel central na activação da via canonical ambos e não-canónica de sinalização de NF-kB. Após a ativação, a sinalização de NF-kB leva à auto-polyubiquitination do fator receptor associado fator de necrose tumoral 6 (TRAF6). O TRAF6 ubiquitinadas depois recruta o factor activado-β de crescimento transformante-quinase 1 (TAK1) e a cinase de IkB complexo (IKK), que consiste em duas subunidades catalíticas, IKK1 (IKKα) e IKK2 (IKKβ), e uma subunidade reguladora, nemo (modulador de NF-kB essencial, IKKγ), de modo que pode TAK1 fosforilam e activam IKKβ. A auto-fosforilação também foi referida como estando envolvida na activação de IKKβ [39], [40]. Devido ao papel frequentemente observado que a activação de IKKβ desempenha na geração de cancro, proliferação e metástase, IKKβ tem sido considerada um fármaco alvo promissor para tratamentos contra o cancro [41], [42]. Um FDA aprovou medicamento órfão para o tratamento de câncer de pâncreas, CDDO-Me, também conhecido como RTA 402, bloqueia a via NF-kB através da inibição direta da IKKβ em Cys-179 [43].

No estudo atual, descrevemos TCN, um potente inibidor de NF-kB, bloqueou a activação IKKβ suprimindo a sua fosforilação e, subsequentemente, inibiu a expressão dos genes alvo de NF-kB via de sinalização, incluindo XIAP, ciclina D1 e Bcl-xL, que regulam a sobrevivência da célula e célula proliferação. Como resultado, TCN induzida apoptose celular e a paragem do ciclo celular em NF-kB células cancerosas humanas constitutivamente activados, sem afectar as células normais com baixo basal actividade de NF-kB (Figura S2). Considerando os eventos complexos que associam com a ativação de IKKβ, os mecanismos precisos como TCN prejudica a fosforilação de IKKβ são dignos de uma investigação mais aprofundada.

Os metabolitos de colonizar fungos endofíticos em fitoterapia foram encontrados para possuir vários bioatividades [44 ], [45]. agentes anticancerígenos de muitas plantas hospedeiras são encontrados em metabólitos dos fungos endofíticos, como Taxol, que foi isolado a partir de fungos endofíticos

Taxomyces andreanae

em

Taxus brevifolia

[46]. No presente estudo, TCN, juntamente com 6β-hydroxyrosenonolactone, trichothecolone, roseocardin e roseotoxin B foram isolados de fungos endofíticos LZ93 de

Maytenus hookeri Loes.

E foram testados para as suas actividades anticancerígenos (Figura S1). Entre os compostos que isoladas, TCN provou ser a mais potente. Estes resultados indicam que as propriedades de TCN pode ser um dos potenciais mecanismos subjacentes às atividades de eficácia e anti-câncer de

Maytenus hookeri Loes.

Tomado no seu conjunto, os nossos resultados sugerem que a TCN, como um potente inibidor da sinalização de NF-kB, tem valor terapêutico promissor para o tratamento do câncer e merece uma maior exploração.

Informações de Apoio

Figura S1. Bio-actividades de compostos isolados de fungos endofíticos LZ93 de

Maytenus hookeri Loes.

(A) estruturas químicas de 6β-hydroxyrosenonolactone (6β-HRL), trichothecolone, roseocardin e roseotoxin B. (B) citotóxica efeitos induzidos por trichothecin, trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin e roseotoxin B a 40 uM em células HL-60, HepG2, A549 e células PANC-1 após 48 h de tratamento. (C) Efeito de trichothecin, trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin roseotoxin e B na induzida por TNF-α activação de NF-kB. células HEK 293T foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos seguido por pré-tratamento com DMSO ou 0,3, 0,6 PNF-kB-Luc e pRL-TK, 1,25 uM TCN, ou de sucessivas concentrações de 2,5, 5, 10 uM de trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin ou roseotoxin B durante 1 hora antes da estimulação de 25 ng /mL de TNF-α durante 18 h. sombreamento progressivamente mais escura de cada barra indica concentrações mais elevadas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071333.s001

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Figura S2. Diagrama esquemático de inibição de IKKβ TCN e da via de NF-kB.

Após estimulada por TNF-α, um painel de quinases será submetido a ubiquitinação e a fosforilação, o que resulta na activação de NF-kB através de degradação de IKKβ medicado IκBα e translocação de p65. TCN inibe a fosforilação da IKKβ, que por sua vez resulta em apoptose e inibição do crescimento das células cancerosas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071333.s002

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